陳宣承,李紅領,李海濤

(江南大學 食品學院,江蘇 無錫,214122)

結腸直腸癌(carcinoma of colon and rectum,CRC)是第二大流行癌癥[1],死亡率逐年上升,且發(fā)病情況日漸趨于年輕化[2],影響CRC發(fā)病的因素極為復雜,飲食、腸道菌群、個體情緒甚至生物鐘均會有一定的影響,因此了解CRC的發(fā)生和發(fā)展機制對于預防及治療CRC至關重要。攝入紅肉對患結腸直腸癌有重大風險[3],紅肉中的血紅素鐵可以解釋紅肉攝入與結腸直腸癌患病風險的關系,因為白肉(如雞肉、魚肉等)的攝入并不會加大CRC的患病風險[4-6]。膳食血紅素鐵主要存在于紅肉中的血紅蛋白和肌紅蛋白,可在小腸部位被吸收[7]。血紅素鐵是一種廣泛存在于動物紅肉、肝臟、血液中的有機鐵,血紅素(亞鐵原卟啉,Fe2+)是一個在其中心含有亞鐵離子的四吡咯環(huán),而氯化血紅素(鐵原卟啉,Fe3+)含有3價鐵,是血紅素的體外純化形式[8-9]。含血紅素的蛋白質在生物體內生物化學反應中發(fā)揮著重要的作用,如氧氣運輸和儲存(如血紅蛋白和肌紅蛋白),參與藥物代謝(如細胞色素P450),抗氧化能力(如乳酸鹽酶,過氧化物酶)和信號傳導過程(如一氧化氮合成酶)[10-12]。已有研究表明,氯化血紅素對人結腸細胞具備遺傳毒性和細胞毒性[13],同時,通過藥物抑制或基因敲除轉鐵蛋白DMT1,減少結腸細胞對2價鐵的吸收,可以有效減少結腸腫瘤的發(fā)生[14]。這些研究表明,鐵平衡對結腸直腸癌的發(fā)生至關重要。

目前主要有3種機制可以解釋肉類和結直腸癌之間的關系[15],(1)可能通過肽衍生的胺的N-亞硝化作用或在胃腸道中形成潛在的致癌性物質N-亞硝基化合物,通過亞硝化作用產(chǎn)生S-亞硝基硫醇和亞硝酰基鐵(FeNO)[16]；(2)在高溫下煮熟的肉含有誘變性雜環(huán)胺(mutagenic heterocyclic amine,HCA)[17]；(3)流行病學和實驗數(shù)據(jù)支持紅肉中存在的血紅素鐵可促進結直腸癌的發(fā)生發(fā)展,血紅素對上皮細胞的直接細胞毒性、基因毒性效應,以及血紅素鐵對N-硝基化合物和脂質過氧化產(chǎn)物形成的催化作用[18]。然而,在采用流行病學方法統(tǒng)計分析時,會出現(xiàn)一定偏差,需要進一步的實驗說明。

本研究以血紅素鐵為研究對象,通過建立動物模型以及細胞模型,探究血紅素鐵的攝入對結腸直腸癌的發(fā)生發(fā)展的影響,以及巨噬細胞在結腸直腸癌發(fā)生中的影響。研究成果提出一種血紅素鐵對CRC發(fā)病的新的機制解析,為結腸直腸癌的預防及治療提供一種新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗動物

SPF級C57BL/6 N雄性小鼠,5周齡,體重20～22 g,北京維通利華實驗動物技術有限公司。

1.1.2 實驗細胞

人髓系白血病單核細胞THP-1,ATCC細胞庫(the global bioresource center)。

1.1.3 抗體

重組Anti-Xanthine Oxidase抗體(XOD,ab109235)、重組Anti-gamma H2A.X 抗體(p-H2AX,ab81299)、重組Anti-STAT3(phospho Y705)抗體,Abcam；F4/80抗體C-7(F4/80,sc—377009),Santa(santa cruz biotechnology)；β-actin(4970),CST(cell signaling technology)。

1.1.4 實驗試劑

髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)測試盒、脂質過氧化物(lipid hydroperoxide,LPO)試劑盒及組織鐵測定試劑盒,南京建成生物工程研究所；黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase,XOD)活性檢測試劑盒,北京索萊寶科技有限公司；Mouse TNF-α ELISA Kit、Mouse IL-10 ELISA Kit,南京福麥斯生物技術有限公司；小鼠脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)ELISA試劑盒,上海酶聯(lián)生物科技有限公司；免疫組化試劑盒,生工生物工程(上海)股份有限公司；氧化偶氮甲烷(azoxymethane,AOM),無錫萊弗思生物實驗器材有限公司；葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium,DSS),南京百思凱科技有限公司；氯化血紅素,上海阿拉丁生化科技股份有限公司；蔗糖鐵,山西普德藥業(yè)有限公司；polymethacrylate copolymer(PMA),西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 利用AOM/DSS誘導原發(fā)結直腸癌腫瘤小鼠模型實驗

5周齡SPF級C57BL/6 N雄性小鼠,飼養(yǎng)于江南大學實驗動物中心SPF屏障環(huán)境中,在屏障環(huán)境中適應喂養(yǎng)1周后隨機分組。在實驗中設置的血紅素鐵劑量(50、100 mg/kg)對應醫(yī)學用藥中劑量。模型組、低劑量血紅素鐵組(50 mg/kg)以及高劑量血紅素鐵組(100 mg/kg)各15只接受單次AOM(10 mg/kg,200 μL)的腹腔注射,空白組及對照組(100 mg/kg)各6只接受注射同體積9 g/L的NaCl溶液。同時,對照組和干預組開始灌胃相應濃度的氯化血紅素水溶液,與此同時,空白組和模型組每次每只灌胃200 μL 9 g/L的NaCl溶液,每灌胃5 d休息1 d,持續(xù)到實驗結束。1周后,模型組和干預組將水壺中的飲用水替換為質量濃度為20 g/L的DSS(分子質量為35 000～50 000 Da)水溶液,2 d換1次,空白組和對照組維持普通飲用水,持續(xù)1周,將DSS水溶液換回普通飲用水,再飼養(yǎng)2周,視為1個循環(huán),上述循環(huán)重復2次,總計3次循環(huán)。最后1次循環(huán)結束后,飼喂2周,隨后根據(jù)動物福利原則處死小鼠,眼球采血,對結腸、脾器官等進行分離,40 g/L多聚甲醛-PBS固定及液氮冷凍保存,以備后續(xù)實驗。

1.2.2 小鼠結直腸組織標本制作以及蘇木精—伊紅染色實驗

在AOM/DSS誘導原發(fā)結直腸癌腫瘤小鼠實驗中,各組小鼠經(jīng)過麻醉處死后,取下結直腸,縱剖攤平,緊密卷起,依次完成脫水、透明、浸蠟、包埋及切片步驟后,完成標本的制作。標本再經(jīng)過烤片、脫蠟、復水、染色、脫水、透明及封片等步驟,于掃描顯微鏡下觀察。

1.2.3 免疫組化(immunocytochemistry,IHC)分析

標本經(jīng)過烤片、脫蠟、復水后,在體積分數(shù)3%的H2O2溶液中浸泡10 min,再用清水浸泡2次洗滌,再檸檬酸鈉溶液中煮沸3 min,冷卻至室溫,完成抗原修復后,水洗2次,再用PBS溶液浸泡(2×5 min),使用5%的BSA-PBS溶液封閉1 h,棄去封閉液,施加一抗(XOD、F4/80抗體,1∶200稀釋),在濕潤的水盒中4 ℃過夜孵育,再按免疫組化試劑盒說明書要求施加二抗、顯影、復染,最后使用不同濃度酒精、二甲苯梯度脫水,封片,在掃描顯微鏡下掃描觀察。

1.2.4 細胞實驗

人髓系白血病單核細胞THP-1在37 ℃,體積分數(shù)5% CO2條件下,用含10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。以每皿5×105接種于10 cm皿,過夜后更換培養(yǎng)基,再培養(yǎng)24 h穩(wěn)定細胞代謝,之后經(jīng)100 ng/mL PMA誘導24 h,再將含0.2 μg/mL LPS及蔗糖鐵(75、150 μmol/L)的培養(yǎng)基刺激細胞,6 h后收集細胞蛋白,以備后續(xù)實驗。

1.2.5 蛋白提取

對于小鼠結腸樣品,每組挑選4只小鼠樣品,模型組、低劑量血紅素鐵組和高劑量血紅素鐵組則按結腸腫瘤組織和瘤旁組織提取,每個樣品提取30 mg,加入30倍體積含磷酸酶抑制劑、蛋白酶抑制劑和PMSF的Ripa裂解液進行裂解,組織研磨后,12 000 r/min離心10 min,棄沉淀,吸取上清液,部分上清液按照BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書要求對蛋白濃度進行測定,剩余樣品加入體積分數(shù)5%的β-巰基乙醇的5×loading buffer后,95 ℃金屬浴加熱變性10 min,后續(xù)備用；對于細胞樣品,收集貼壁細胞及上清液,1 000 r/min離心5 min,PBS清洗3遍,以洗去多余培養(yǎng)基,后用含磷酸酶抑制劑、蛋白酶抑制劑和PMSF的Ripa裂解液進行裂解,經(jīng)超聲破碎儀充分裂解后,12 000 r/min離心10 min,棄沉淀,吸取上清液,后續(xù)按組織蛋白提取步驟提取蛋白,后續(xù)備用。

1.2.6 蛋白質印跡法(western blot)分析

30 μg蛋白樣品變性后經(jīng)10%SDS-PAGE分離,轉移至PVDF膜上,用含有5% BSA的TBST溶液(TBS水溶液,含有1%體積分數(shù)的吐溫-20)封閉1 h,施加一抗(XOD、p-stat3、H2AX、β-actin抗體,1∶1 000稀釋)4 ℃過夜孵育；再施加二抗孵育1 h(1∶2 500稀釋)后,再用TBST水溶液洗滌5次,每次5 min,最后加入顯影液,避光顯影20 s后,在掃描儀下顯影掃描觀察實驗結果。

1.2.7 小鼠結腸部位MPO、LPO及組織鐵含量測定

對于小鼠結腸樣品,每組挑選4只小鼠樣品,模型組、低劑量血紅素鐵組和高劑量血紅素鐵組則按結腸腫瘤組織和瘤旁組織提取,每個樣品提取90 mg,加入20倍體積生理鹽水,組織研磨后,棄沉淀,吸取上清液,部分上清液按照BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書要求對蛋白濃度進行測定,其余樣品按MPO測試盒、LPO試劑盒及組織鐵測定試劑盒說明書分別測定結腸組織MPO酶活、LPO含量以及結腸組織鐵含量,具體計算按說明書給與公式得出相應結果。

1.2.8 小鼠結腸部位TNF-α及IL-6含量測定

對于小鼠結腸樣品,每組挑選4只小鼠樣品,模型組、低劑量血紅素鐵組和高劑量血紅素鐵組則按結腸腫瘤組織和瘤旁組織提取,每個樣品提取60 mg,加入20倍體積PBS,組織研磨后,棄沉淀,吸取上清液,按Mouse TNF-α ELISA Kit和Mouse IL-6 ELISA Kit試劑盒說明書要求測量結腸部位TNF-α及IL-6含量。

1.2.9 小鼠血漿LPS含量測定

對小鼠血漿樣品,每組挑選4只小鼠樣品,每個樣品吸取100 μL血漿,用LPS試劑盒中稀釋液2倍稀釋后,按相應說明書測定血漿中LPS含量。

1.3 統(tǒng)計分析

采用平均值±標準差表示實驗結果,用Graphpad Prism 6 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析,P<0.05,表示具有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 血紅素鐵攝入增加結直腸癌發(fā)生發(fā)展進度

對于動物實驗,建立AOM/DSS誘導原發(fā)結直腸癌腫瘤小鼠模型,并用不同濃度的氯化血紅素灌胃干預,圖1-a為實驗方案設計。將小鼠分組為空白組(1)、血紅素鐵對照組(2)、模型組(3)、低血紅素鐵干預組(4)以及高血紅素鐵干預組(5)，并在下文統(tǒng)一用序號1-5代替組別，其中空白組及血紅素鐵對照組各5只小鼠，模型組、高低劑量血紅素鐵干預組各10只小鼠。整個實驗周期平均體重記錄如圖1-b所示,經(jīng)過13周的灌胃干預,空白組平均體重為(31.57±1.81) g,模型組為(29.78±2.03) g,對照組為(31.65±1.94) g,低劑量血紅素鐵干預組為(29.31±2.04) g,高劑量血紅素鐵干預組為(28.50±2.11) g(與模型組比較,P<0.05,單因素方差分析t檢驗)。由3位具備小鼠結直腸病理分析經(jīng)驗的實驗人員對小鼠結直腸腫瘤部位的結節(jié)數(shù)進行統(tǒng)計,結果表明高劑量血紅素鐵干預組結節(jié)數(shù)明顯多余模型組(圖1-d),同時觀察小鼠結直腸內表面發(fā)現(xiàn)高劑量血紅素鐵干預組有較大腺瘤生成,以及發(fā)現(xiàn)高劑量血紅素鐵組小鼠脾臟質量明顯較模型組偏高(圖1-c),這說明血紅素鐵具有增加結直腸癌腫瘤發(fā)生率的作用。隨后,通過對結直腸組織的病理學評估,發(fā)現(xiàn)高劑量血紅素鐵干預組小鼠結直腸病灶的結腸細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化,隱窩破壞明顯,呈纖維狀,有較大的腺瘤生成,而模型組小鼠結直腸病灶部位細胞形態(tài)變化較小,同時腺瘤體積較小(圖1-e),說明在實驗劑量下的血紅素鐵可以加重結直腸癌的發(fā)生發(fā)展。而對照組相對空白組則未見明顯變化(P>0.05)。

2.2 血紅素攝入增加組織鐵含量及氧化應激水平

鐵一向被認為是氧自由基和脂質過氧化生成的催化劑,在AOM/DSS誘導原發(fā)結直腸癌腫瘤小鼠模型中,通過測量小鼠不同部位結腸組織鐵含量,發(fā)現(xiàn)血紅素鐵的攝入會增加結直腸組織鐵含量,且跟濃度呈正相關,同時發(fā)現(xiàn)在結直腸癌腫瘤小鼠中,腫瘤組織較瘤旁組織鐵含量更高(圖2-c)。通過測定小鼠氧化應激水平發(fā)現(xiàn),MPO活性(圖2-b)和LPO含量(圖2-a)均上升,且腫瘤組織較瘤旁組織鐵含量更高,這與組織鐵含量表現(xiàn)一致,說明小鼠氧化應激的變化可能是因為隨著血紅素鐵的攝入,結腸部位組織鐵含量的增加引起的。

圖1 血紅素鐵攝入對結直腸癌的影響Fig.1 Influence of hemin intake on CRC 注:*,表示差異顯著(P<0.05); **,表示差異極顯著(P<0.01); ***,表示差異高度顯著(P<0.001),(下同)

a-LPO含量；b-MPO活性；c-鐵含量圖2 結腸組織鐵及氧化應激水平分析Fig.2 Analysis of iron and oxidative stress levels in colon

2.3 血紅素鐵攝入對結腸組織炎癥因子的影響

在AOM/DSS誘導原發(fā)結直腸癌腫瘤小鼠模型中,通過測量小鼠不同部位結腸組織鐵含量發(fā)現(xiàn),在腫瘤組織中TNF-α表達量較瘤旁組織顯著提高,但不同組別間TNF-α的含量上升幅度不大(圖3-a),同時,腫瘤組織較瘤旁組織白細胞介素6的表達上調,且模型組較空白組表達上調,且經(jīng)過血紅素鐵的干預后,干預組及對照組均有不同程度上調(圖3-b)。不同組別間的小鼠炎癥變化程度小,這是因為AOM/DSS模型是一種慢性炎癥,炎癥程度較氧化應激相對較弱。

2.4 血紅素鐵上調的氧化應激依賴XOD表達

研究發(fā)現(xiàn)血紅素鐵會引起氧化應激水平的提高,XOD下游產(chǎn)物H2O2可在小腸黏膜細胞與亞鐵離子發(fā)生芬頓反應[19],能夠促進鐵的轉運和運輸,也能催化生成氧自由基。通過蛋白質印跡法分析發(fā)現(xiàn),血紅素鐵的存在可以上調高劑量干預組結腸組織XOD的表達,同時觀測到DNA損傷的標志蛋白磷酸化的H2AX上調,以及磷酸化STAT3蛋白較空白組高,高血紅素鐵組磷酸化STAT3蛋白較模型組表達上調(圖4-a)。通過測量小鼠結腸組織XOD活性,也得到了類似結果,高、低劑量干預組XOD活性較模型組顯著上升(圖4-b)。

2.5 XOD表達定位

結腸細胞與巨噬細胞均在腸道產(chǎn)生XOD,為了進一步探究結腸組織XOD表達的具體情況,通過免疫組化實驗確定XOD在結腸部位表達位置,通過XOD抗體和F4/80,發(fā)現(xiàn)F4/80定位的巨噬細胞與XOD表達位置高度重合(圖5-a),這說明結腸部位檢測到的絕大部分XOD來源于巨噬細胞。血漿LPS的含量可作為結腸屏障是否破壞的一個標志,實驗首先測量了血漿中LPS含量,發(fā)現(xiàn)經(jīng)過AOM/DSS誘導后,模型組和干預組小鼠血漿中LPS均出現(xiàn)上升(圖5-b),這說明攝入膳食血紅素鐵后,腸道屏障被破壞,給巨噬細胞提供了通道,接觸到鐵的巨噬細胞發(fā)生一系列生物生化反應。

a-TNF-α；b-IL-6圖3 結腸組織炎癥因子水平分析Fig.3 Analysis of inflammatory factor levels in colon

a-Western Blot分析；b-XOD活性圖4 結腸組織Western Blot及XOD活性分析Fig.4 Western Blot of colon tissue and XOD activity

為了驗證巨噬細胞對結腸細胞的影響,建立細胞模型,通過PMA誘導THP-1細胞分化成巨噬細胞,在蔗糖鐵和LPS刺激下,發(fā)現(xiàn)XOD表達顯著提高,且有劑量依賴現(xiàn)象,呈正相關趨勢(圖5-c)。這與前文中小鼠由于腸道屏障的破壞,塑造了細菌脂多糖接觸巨噬細胞的一個環(huán)境相對應,與其相互驗證。

a-結腸組織顯微圖片；b-血漿脂多糖含量；c-細胞系Western Blot分析圖5 結腸組織免疫組化、血漿脂多糖及THP-1細胞系Western Blot分析Fig.5 Analysis of IHC,LPS and Western Blot of THP-1 cell line

3 討論

世界癌癥研究小組認為紅肉和加工肉攝入會加大患結腸直腸癌的風險[20],目前,不僅在發(fā)達國家,在中等收入及低收入國家結直腸癌的發(fā)病率也在逐年上升[21]。而有研究表明紅肉中對結腸直腸癌起促進作用的不是血紅蛋白而是血紅素鐵[22],本實驗研究表明,膳食血紅素鐵對腸道屏障具有短期影響,對結腸黏膜中炎癥、滲透性和細胞毒性增加,血紅素鐵可以通過誘導氧化應激增加結直腸癌腫瘤的發(fā)生發(fā)展,而氧化應激可以通過黃嘌呤氧化酶的過度表達來增加。

膳食血紅素鐵的攝入不僅增加了結腸炎癥和氧化應激(如MPO活性和促炎性細胞因子的增加),而且還增加了DNA損傷和腸道通透性。有研究表明,炎癥與某些形式的癌癥發(fā)展有因果關系,其過程涉及組織巨噬細胞產(chǎn)生的活性氧的遺傳毒性,或通過產(chǎn)生促炎性細胞因子(例如IL-1β)[23]。與這些研究一致的是,攝入紅肉與結直腸癌發(fā)生和氧化應激增加有關,例如血漿C反應蛋白[24]和糞便水的遺傳毒性[25]。黃嘌呤氧化酶衍生的氧自由基和H2O2均可導致蛋白質和脂質氧化,進而直接或間接改變信號傳導途徑,破壞細胞膜完整性來影響腸道穩(wěn)態(tài)[26],因此本文通過測量結腸部位黃嘌呤氧化酶的表達和活性,定位到黃嘌呤氧化酶的變化來自于巨噬細胞,解釋了導致結腸穩(wěn)態(tài)破壞的源頭是黃嘌呤氧化酶。

本研究突出了黃嘌呤氧化酶在膳食血紅素鐵干預下對AOM/DSS誘導原發(fā)結直腸癌腫瘤小鼠的作用。總之,紅肉的攝入與結直腸癌發(fā)生的高風險有關,這是因為紅肉中血紅蛋白較白肉高10倍[27],血紅素鐵正是紅肉和結直腸癌發(fā)生高風險的關聯(lián)所在。

4 結論

本研究結果表明,在AOM/DSS誘導原發(fā)結直腸癌腫瘤小鼠模型實驗中,經(jīng)過血紅素鐵干預后,發(fā)現(xiàn)小鼠結直腸癌腫瘤的個數(shù)明顯增多,同時體重下降幅度更大,腫瘤發(fā)育程度大,健康小鼠給予血紅素鐵干預后,體征未出現(xiàn)異常；在體外THP-1細胞模型中研究發(fā)現(xiàn),通過PMA誘導THP-1細胞分化成巨噬細胞,在單純蔗糖鐵的刺激下,黃嘌呤氧化酶出現(xiàn)明顯變化,但在蔗糖鐵和LPS的共同刺激下,黃嘌呤酶表達量顯著上升,且隨蔗糖鐵濃度升高表達量變多。深入研究發(fā)現(xiàn),紅肉攝入會引起細胞黃嘌呤氧化酶表達和活性上調,增加氧化應激水平,在動物模型中,也能觀察到此種現(xiàn)象,血紅素鐵的攝入會增加機體氧化應激水平,破壞腸道屏障,鐵與巨噬細胞的接觸導致氧化應激增加,進而造成DNA損傷,增加結直腸癌的患病風險。本文研究成果對紅肉攝入加大結直腸癌風險的機制作出了一種可能的解釋,發(fā)現(xiàn)黃嘌呤氧化酶在結直腸癌疾病中是一個重要靶點,為紅肉攝入誘導結直腸癌的發(fā)生發(fā)展提供了一些新思路。