李富強,張廷新,朱麗萍,張楠,顏世敢

(齊魯工業(yè)大學(山東省科學院)生物工程學院,山東省微生物工程重點實驗室,山東 濟南,250353)

近年來,由于慢性病、致病微生物感染及不健康的生活方式等原因,導致免疫功能失調的發(fā)生率日益增高。目前,臨床常使用化學藥物,如匹多莫德、環(huán)磷酰胺、前列腺素、環(huán)孢素A、硫代氨基甲酸酯和青霉胺等來調節(jié)人體免疫功能[1-2]。但化學藥物存在價格昂貴,副作用較強(如引起惡心、骨髓毒性和肝臟毒性)等缺點[3]。研究表明,免疫調節(jié)肽對先天性和獲得性免疫應答反應具有調節(jié)作用,且具有無副作用、成本低的優(yōu)點,為免疫調節(jié)制劑的研發(fā)開辟了新途徑。

本文對近年來食物蛋白源免疫調節(jié)肽的類型、獲取途徑、功效評價方法及作用機制進行綜述,以期為免疫調節(jié)相關功能性食品、藥物的研究及開發(fā)提供參考。

1 免疫調節(jié)肽的功效評價方法

免疫調節(jié)肽的功效評價多數(shù)是通過細胞模型和動物模型進行測定,少數(shù)通過臨床試驗測定。淋巴細胞增殖試驗、腹腔巨噬細胞吞噬功能測定、自然殺傷細胞活性測定、細胞因子(IL-2、IFN-、IL-5、IL-6)測定等體內外免疫學檢測是目前常用的免疫調節(jié)功能評價方法(圖1)。

圖1 食源性免疫調節(jié)肽的評價方法Fig.1 Evaluation method of food-derived immunomodulatory peptides

1.1 體外免疫調節(jié)活性評價

多肽的體外免疫活性評價多采用細胞模型測定。細胞模型分為原代細胞和傳代細胞系2種,其中傳代細胞系最常用。

巨噬細胞在免疫系統(tǒng)中起著至關重要的作用,能夠通過吞噬作用及釋放細胞毒分子(如NO)或細胞因子(如TNF-α、IL-6)殺死病原體。因此,巨噬細胞是評價多肽免疫調節(jié)活性的理想細胞模型。在眾多傳代細胞系中,小鼠巨噬細胞系RAW 264.7在評價多肽免疫調節(jié)活性中應用最廣泛。此外,U937細胞(人單核巨噬細胞模型)、THP-1細胞(人單核細胞模型)和Jurkat T細胞(人T淋巴細胞模型)也常用于評價免疫調節(jié)活性。XU等[4]從中華小公魚胃蛋白酶產物中以RAW 264.7細胞相對增殖率為指標篩選出具有免疫調節(jié)活性的五肽YVMRF,該五肽能促進RAW 264.7細胞分化,增加NO、白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-1(IL-1)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的產生。LIU等[5]以U937細胞分泌IL-6的水平,從玉米醇溶蛋白嗜熱菌蛋白酶產物中鑒定出5條多肽：PFNQLAG、SQLALTNPT、FLPFNQL、PFNQL和FLPPVT,其中FLPFNQL的免疫調節(jié)活性最高。

原代細胞也用作評價免疫調節(jié)活性的體外細胞模型。通常在無菌條件下取小鼠腹腔巨噬細胞或脾淋巴細胞進行培養(yǎng),并用不同濃度的蛋白水解物或多肽處理細胞,孵育一段時間后,檢測細胞增殖情況、形態(tài)變化或免疫調節(jié)因子的分泌水平,以評估多肽的潛在免疫調節(jié)活性。HOU等[6]在無菌條件下取小鼠脾臟分離得到原代脾淋巴細胞,以脾淋巴細胞增殖活性評價阿拉斯加鱈魚排蛋白水解物的免疫調節(jié)活性,經分離、純化、鑒定得到3條免疫調節(jié)肽：NGMTY、NGLAP和WT,均能促進脾淋巴細胞增殖。

1.2 體內免疫調節(jié)活性評價

多肽的體內免疫調節(jié)活性評價通常在小鼠模型上進行。小鼠口服不同濃度多肽,持續(xù)給藥一段時間,試驗結束后,處死小鼠,取脾臟、胸腺、血液等,測定免疫臟器指數(shù)(脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù))和血清中免疫因子水平等,評估多肽的免疫調節(jié)活性。多肽的給藥周期和使用濃度取決于多肽的來源和結構。進行動物模型試驗時一般要設置高、中、低劑量組。賀屹潮[7]用環(huán)磷酰胺建立免疫低下小鼠模型,評價大鯢肉酶解產物的免疫調節(jié)活性,試驗發(fā)現(xiàn),酶解產物具有較強的免疫調節(jié)活性,在試驗濃度為100 mg/mL時能顯著提高正常小鼠細胞免疫功能以及免疫低下小鼠的巨噬細胞吞噬活性和IL-6分泌水平。HOU等[8]以氫化可的松建立的免疫低下小鼠模型,利用不同劑量鱈魚排蛋白水解物灌胃小鼠,發(fā)現(xiàn)其可以明顯提高免疫低下小鼠的免疫調節(jié)作用,證實鱈魚排蛋白水解物具有免疫調節(jié)活性。

2 免疫調節(jié)肽的構效關系及作用機制

對免疫調節(jié)肽的研究主要集中在免疫調節(jié)活性與結構(氨基酸種類、組成、序列長度等)的關系以及可能的作用機制。

2.1 免疫調節(jié)肽的構效關系

多肽的免疫調節(jié)能力大小取決于其構效關系,包括氨基酸組成、序列長度、電荷性質、親疏水性和多肽分子結構等。根據多肽的結構特征可以預測其是否具有免疫調節(jié)活性。

多肽的氨基酸組成、種類和多肽的分子結構與其免疫調節(jié)活性息息相關。具有免疫調節(jié)作用的多肽一般由2～10個氨基酸殘基組成,分子質量較小。研究發(fā)現(xiàn),多肽的免疫調節(jié)活性與精氨酸、賴氨酸和組氨酸等帶正電荷的氨基酸含量呈正相關[9-10]。葉盛旺等[11]從青蛤胃蛋白酶產物中篩選出分子質量<3 kDa的活性肽,免疫調節(jié)活性高,能顯著增強巨噬細胞RAW 264.7的吞噬能力、NO的分泌水平和細胞因子的分泌量。多數(shù)免疫調節(jié)肽含有特定氨基酸組成,如疏水性氨基酸(纈氨酸、亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、丙氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸和苯丙氨酸)和芳香基氨基酸(酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸)等。此外,N或C端含有精氨酸、磷酸絲氨酸、谷氨酰胺或色氨酸的免疫調節(jié)肽的免疫調節(jié)活性可能更高?？赡茉蚴谴嬖谠摻Y構的多肽與細胞膜的相互作用增加,更容易被免疫細胞上的受體識別,從而促進了其免疫調節(jié)活性[12-13]。從玉米蛋白得到的FLPFNQL、太子參蛋白得到的RGPPP和大米蛋白得到的YGIYPR均含有較高的疏水性氨基酸[5,9,14]。馬氏珠母貝酶解得到的二肽VR含有疏水性氨基酸纈氨酸(V)和帶正電荷的氨基酸精氨酸(R),在較低濃度下(0.3 mg/mL)表現(xiàn)出優(yōu)異的體外免疫調節(jié)活性[15]。

盡管大部分免疫調節(jié)肽都含有疏水性氨基酸,但疏水性氨基酸可能并不是免疫調節(jié)肽發(fā)揮其免疫調節(jié)作用所必需的。石紅嶺[16]從林蛙油中性蛋白酶產物得到的免疫調節(jié)肽HYDQSYR,不含有疏水性氨基酸,但能顯著促進小鼠脾細胞、RAW 264.7細胞增殖,促進IL-1β、TNF-α和NO分泌,其可能原因是該多肽整體呈正電荷且序列中存在酪氨酸(Y)殘基。

2.2 免疫調節(jié)肽的作用機制

免疫調節(jié)肽對先天性免疫和獲得性免疫應答反應均具有免疫調節(jié)作用。免疫調節(jié)肽具有多種靶細胞,包括單核細胞、巨噬細胞、自然殺傷細胞、T淋巴細胞和B淋巴細胞等。目前對多肽免疫調節(jié)作用的確切機制尚不完全清楚?？赡艿拿庖哒{節(jié)機制有：激活巨噬細胞及其吞噬功能,上調細胞因子、NO和免疫球蛋白等誘導免疫調節(jié)劑的分泌,增加白細胞數(shù),刺激自然殺傷細胞以及脾細胞、CD8+、CD4+、CD116+和CD56+細胞,激活轉錄因子核因子κB(NF-κB)和有絲分裂原激活蛋白激酶(MAPK),從而提高機體對病原體的防御能力、誘導產生分泌型IgA細胞、增強腸道黏膜免疫以及抑制宿主細胞對細菌成分(如脂多糖)的促炎反應等途徑(圖2)。這些作用可能通過多肽與免疫細胞表面受體的直接結合從而激活細胞表面受體介導的相關信號通路。CIAN等[17]發(fā)現(xiàn)柱斑紫菜水解物通過NF-κB通路、p38和JNK通路上調大鼠巨噬細胞中的IL-10水平,提高機體免疫能力。HE等[18]發(fā)現(xiàn)從鴨蛋清蛋白中獲取的多肽TQIDKVVHFDKLPGF和WTSSTMMEER,均可促進RAW 264.7細胞分泌NO、TNF-α和IL-6,分子對接實驗結果表明,該多肽與Toll樣受體2(TLR2)和4(TLR4)相互作用均表現(xiàn)出良好的親和力,相互作用位點圖分析發(fā)現(xiàn),該多肽能與受體形成穩(wěn)定的氫鍵,有助于多肽的免疫調節(jié)活性。

圖2 免疫調節(jié)肽的作用機制Fig.2 Mechanism of immunoregulatory peptides

3 不同類型食物蛋白源免疫調節(jié)肽的制備

1984年PARKER等[19]首次從人酪蛋白酶解產物中鑒定出免疫調節(jié)肽,此后,陸續(xù)發(fā)現(xiàn)多種具有免疫調節(jié)活性蛋白水解物或多肽。免疫調節(jié)肽的氨基酸組成及序列與其母體蛋白息息相關。不同蛋白來源的免疫調節(jié)肽活性不同。近年來從牛乳清蛋白[20]、魚肉蛋白[21]、蠶蛹蛋白[22]、大米蛋白[23]、小麥蛋白[24-25]、大豆蛋白[26]、羽扇豆蛋白[27-28]和微藻類蛋白[29]等多種食物蛋白中鑒定出多種免疫調節(jié)肽(表1)。

利用食物蛋白制備免疫調節(jié)肽的方法有酸水解、堿水解、化學水解、微生物水解和酶水解等[30],其中酶解法最常用。胰蛋白酶、堿性蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、糜蛋白酶、熱裂解酶、風味酶和中性蛋白酶等酶常用于免疫調節(jié)肽的制備。采用酶解法,從青蛤胃蛋白酶酶解產物[12]、小麥胚芽球蛋白堿性蛋白酶酶解產物[31]和日本黃姑魚木瓜蛋白酶酶解產物[32]中均分離鑒定出免疫調節(jié)肽。

蛋白酶解產物可通過低分子質量截留膜過濾、凝膠過濾色譜、離子交換色譜和反相-高效液相色譜(RP-HPLC)等手段進一步分離純化獲得免疫調節(jié)肽。采用多種分離純化手段逐步對酶解產物進行分離純化,對純化得到的免疫調節(jié)肽進行結構表征,可得到單一的免疫調節(jié)肽。多肽氨基酸序列鑒定常用的技術是液相色譜-質譜聯(lián)用(LC-MS),該技術靈敏度高、所需樣品量少[33]。通過質譜分析得到多肽序列,與多肽數(shù)據庫進行比對,可以解析免疫調節(jié)肽的構效關系[34]。

3.1 動物蛋白來源的免疫調節(jié)肽

乳、蛋是最早用于制備免疫調節(jié)肽的蛋白來源。由牛奶酪蛋白制備的酪蛋白磷酸肽(CPP),具有顯著的抗菌活性,且能刺激人外周單核細胞產生調節(jié)性細胞因子IL-10[35]。ADAMS等[36]從牛奶酪蛋白發(fā)酵產物中得到IPP和CPP兩種免疫調節(jié)肽,在沒有促炎刺激劑的情況下能誘導THP-1單核細胞產生調節(jié)性細胞因子IL-10,還可誘導人臍靜脈內皮細胞產生NO。KIEWIET等[37]發(fā)現(xiàn)牛奶乳清蛋白水解產物能夠顯著增加外周單核細胞表達IL-10和TNF-α,還可通過激活Toll樣受體來參與免疫調節(jié)。通過酶解、微生物發(fā)酵及理化方法處理雞蛋蛋白能制備具有免疫調節(jié)活性的多肽。蛋黃中的卵黃蛋白具有抗炎活性,能夠抑制脂多糖誘導的RAW 264.7巨噬細胞產生促炎細胞因子,如TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10[38]。卵黃蛋白的胃蛋白酶和堿性蛋白酶酶解產物具有很強的抗炎活性,能減少NO和前列腺素E2(PGE2)的產生,而后者與多種炎癥性疾病密切相關,其中誘導型一氧化氮(INOS)和環(huán)氧合酶2(COX-2)受到抑制[39]。HE等[18]發(fā)現(xiàn)鴨蛋清的木瓜蛋白酶水解物中的多肽TQIDKVVHFDKLPGF能顯著提高RAW 264.7細胞的吞噬能力,促進NO、TNF-α和IL-6的分泌以及激活Toll樣受體2和4參與免疫應答。分離自雞肉蛋白Protex 50FP酶解產物的多肽FLWGKSY在U937細胞上顯示出IL-6的抑制活性,具有較高的免疫調節(jié)活性[40]。

表1 食物蛋白源免疫調節(jié)肽的獲取、功能評價列表Table 1 The acquisition and functional evaluation of food protein-derived immunomodulatory peptides

3.2 植物蛋白來源的免疫調節(jié)肽

糧食作物是食物蛋白的重要來源,是制備免疫調節(jié)肽的潛在食物蛋白。源于大豆球蛋白的大豆衍生肽可與巨噬細胞和中性粒細胞表面的受體相互作用,產生與細菌感染類似的免疫信號,如大豆衍生的43肽Lunasin具有多種免疫調節(jié)活性。XU等[14]用胰蛋白酶消化大米蛋白,以RAW 264.7巨噬細胞相對增殖活性為活性評價指標,通過大孔吸附樹脂、強陽離子交換層析、凝膠過濾層析和反相高效液相色譜分離得到多肽YGIYPR,在質量濃度為12.5～100 μg/mL時能促進RAW 264.7細胞增殖。FANG等[23]在富硒大米蛋白中獲得富硒多肽TSeMMM和SeMDPGQQ,均能提高RAW 264.7細胞的吞噬率和增殖能力,降低NO生成量。LIU等[5]在玉米醇溶蛋白的嗜熱菌蛋白酶產物中獲得FLPPVT、PFNQLAG、SQLALTNPT、FLPFNQL和PFNQL,均能抑制U937細胞生成IL-6,調節(jié)炎癥反應。其中疏水性氨基酸占比較高的FLPPVT(83.33%)和FLPFNQL(71.43%)表現(xiàn)出更強的活性。

3.3 海洋蛋白來源的免疫調節(jié)肽

海洋蛋白來源的多肽和蛋白水解物具有多種生物學活性,如抗菌、抗氧化、降血壓、抗炎和免疫調節(jié)等。已經從蛤類等甲殼類軟體動物、海洋藻類、海洋魚類等海洋來源蛋白中獲取到免疫調節(jié)肽。HOU等[6]發(fā)現(xiàn)鱈魚排胰酶水解產物能顯著提高正常小鼠的淋巴細胞轉化活性、遲發(fā)型變態(tài)反應和單核巨噬細胞吞噬能力,能顯著提高免疫功能低下小鼠的免疫器官指數(shù)、遲發(fā)型變態(tài)反應、脾淋巴細胞的增殖、血清溶血素含量、碳廓清能力和腹腔巨噬細胞對雞紅細胞的吞噬率和吞噬指數(shù)等,進一步純化鑒定得到NGMTY、NGLAP和WT 3條多肽,純化的多肽在濃度為20 μg/mL時,淋巴細胞增殖率分別為35.92%、32.96%和31.35%。同樣,LI等[41]利用木瓜蛋白酶和胰蛋白酶酶解阿拉斯加鱈魚蛋白得到多肽ACNGR,能夠改善環(huán)磷酰胺誘導的小鼠的免疫器官指數(shù),促進脾淋巴細胞增殖,增加與腸黏膜免疫相關的SIgA、IgA、IL-6、IL-10的分泌,從而提高小腸黏膜免疫功能。分別從中華小公魚、青蛤的酶解產物分離的多肽YVMRF、RVAPEEHPVEGRYLV,均能夠促進RAW 264.7細胞的增殖活性[4,12]。海洋蛋白來源的免疫調節(jié)肽的序列通常較短,分子質量小于3 kDa。如從馬氏珠母貝酶解得到的免疫調節(jié)肽VR,僅由2個氨基酸組成,在0.3 mg/mL時也可促進小鼠脾淋巴細胞增殖和腹腔巨噬細胞吞噬活性,表現(xiàn)出優(yōu)異的體外免疫調節(jié)功能[15]。

4 生物信息學在活性肽發(fā)掘中的應用

酶解法是現(xiàn)階段制備活性肽的主要途徑。酶解使用的蛋白酶不能循環(huán)利用,增加了研發(fā)成本,還會影響后續(xù)的分離純化。隨著固定化酶技術的發(fā)展,將蛋白酶固定,然后對蛋白進行連續(xù)水解,能夠在一定程度上控制水解度和減少酶的浪費。而且,采用酶解法制備活性肽,需要篩選酶的種類并對酶解條件進行優(yōu)化,效率低、成本高,存在一定的盲目性。

隨著生物信息學的發(fā)展,可采用生物信息學方法進行生物活性肽的發(fā)掘、評價。如利用PeptideCutter和BIOPEP-UWM等分析平臺對已知蛋白序列進行模擬酶切。頡宇等[45]基于BIOPEP-UWM數(shù)據庫,借助計算機輔助與酶解法結合,定向制備出檸條籽蛋白抗氧化肽。利用PeptideRanker分析平臺,對酶切獲得的多肽進行生物活性評價,分析其存在生物活性的概率。生物活性肽的開發(fā)與應用還應注意其潛在的毒性。Toxinpred平臺可以預測多肽潛在的毒性,還可根據多肽序列突變選項來降低多肽的毒性。PAULINA 等[46]采用多肽組學和生物信息學方法并結合LC-ESI-MS,從牛肉的酸性乳清處理產物中得到一系列多肽序列,通過toxinpred分析毒性后,使用PeptideRanker和BIOPEP-UWM預測潛在的生物學活性,發(fā)現(xiàn)多肽產物中存在DPP-Ⅳ(二肽基肽酶)和ACE(血管緊張素轉化酶)抑制活性。采用生物信息學方法對蛋白序列模擬酶切,再結合酶解試驗進行驗證,這為新型免疫調節(jié)肽的發(fā)掘與活性研究提供了新途徑。

5 總結與展望

近年來,免疫功能失調引發(fā)的疾病呈上升趨勢,現(xiàn)階段臨床使用的免疫調節(jié)藥物價格昂貴,且具有一定的毒副作用,因此開發(fā)高效、經濟、安全的免疫調節(jié)肽具有重要意義。本文綜述了近年來食物蛋白源免疫調節(jié)肽的類型、獲取途徑、功效評價方法及作用機制研究進展。免疫調節(jié)肽的蛋白來源廣泛,制備工藝較成熟,安全性高,分子質量小,易吸收,具有減輕自身免疫病和炎癥、免疫反應及氧化應激功效,在食品、醫(yī)藥領域應用前景廣闊。但目前對食物蛋白源免疫調節(jié)肽的研究大都集中在制備、分離純化以及結構鑒定方面,其功效評價大都停留在細胞模型和動物模型水平,只有少部分在健康機體中得到進一步驗證,且缺乏在疾病模型中的驗證,與之相關的臨床人體實驗開展較少,仍處于試驗階段。此外,免疫調節(jié)肽的分子作用機制有待闡明,如發(fā)揮作用的氨基酸序列,以及作用的靶點等。隨著現(xiàn)代分離、鑒定技術與生物信息學的發(fā)展,采用上述生物信息學預測與實驗相結合的手段勢必推動免疫調節(jié)肽的研發(fā)和應用。相信在不久的將來,新型免疫調節(jié)肽將會不斷被發(fā)掘、鑒定。