張 蕾, 王璐瑤, 付學(xué)奇， 趙婉竹， 郝婧瑋, 王新穎, 紀(jì)秋研

(1. 牡丹江師范學(xué)院 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 黑龍江 牡丹江157011； 2. 吉林大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 長(zhǎng)春130012； 3. 新疆醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院， 烏魯木齊830017)

山奈酚是一種廣泛存在于多種植物中的多醇羥基黃酮類化合物[1]. 研究表明， 山奈酚具有抗癌、 抗氧化、 抗炎癥反應(yīng)等多種藥理學(xué)活性[2-5]. 與大多數(shù)類黃酮一樣， 山奈酚通常以多種糖苷形式存在， 而不是以游離苷元的形式存在. 只有以苷元形式存在的黃酮才能直接進(jìn)入血液， 發(fā)揮多種生理作用， 糖苷經(jīng)酸水解后形成苷元可顯著提高山奈酚的提取率[6]. 酸水解是一種有機(jī)分子被水分解的化學(xué)反應(yīng)， 酸作為催化劑將糖苷水解成苷元[7-8]， 可將以結(jié)合苷形式存在的山奈酚解離. 本文通過(guò)酸水解方法將共軛鍵結(jié)合的山奈酚解離， 從而提高山奈酚的提取率. 但酸濃度太高山奈酚的提取率反而降低， 可能是由于較高的酸濃度下黃酮類化合物易發(fā)生降解所致[9].

研究表明， 植物活性成分的抗氧化作用可能與黃酮含量相關(guān)[10-11]. 自然界中富含黃酮類化合物的食物有益于人體健康， 其中抗氧化作用較顯著[1]. 山奈酚是一種以黃酮為母核的化合物， 其抗氧化功能可能與分子結(jié)構(gòu)中兩大抗氧化藥效基團(tuán)酚羥基相關(guān)， 并與其羥基可提供電子的能力有關(guān)[12]. 超氧陰離子(·O2-) 自由基是需氧細(xì)胞線粒體內(nèi)電子轉(zhuǎn)移而產(chǎn)生的一種自由基， 在生物體內(nèi)可長(zhǎng)時(shí)間攻擊靶向目標(biāo)， 對(duì)細(xì)胞有較強(qiáng)的氧化毒性， 與人體衰老及癌癥等疾病的發(fā)生有關(guān). 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH·)自由基是一種在N—N鍵上含有不對(duì)稱價(jià)電子的氮族自由基， 是用天然多糖抗氧化成分研究抗氧化活性的一種常用評(píng)價(jià)方法[13-14]. 山奈酚具有一定的抗氧化作用， 可清除·O2-自由基[15]、 DPPH·自由基和2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)自由基等[16-17]. 王銳等[18]采用綜合碘量法和DPPH法研究表明， 山奈酚的乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物具有良好的抗氧化活性， 山奈酚可通過(guò)抑制CAT、 GSH-Px和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶等抗氧化酶的表達(dá)降低由酒精和多不飽和脂肪酸導(dǎo)致小鼠肝組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)[19]. Rajendran等[15]對(duì)小鼠體內(nèi)抗氧化酶進(jìn)行測(cè)定的結(jié)果表明， 山奈酚對(duì)抗氧化酶的含量具有調(diào)節(jié)作用. 本文通過(guò)響應(yīng)面方法(RSM)優(yōu)化提取辣木籽中山奈酚的提取條件， 并研究其清除·O2-自由基和DPPH·自由基的效果， 為山奈酚藥用價(jià)值的開(kāi)發(fā)利用提供理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自上海源葉公司； 乙醇、 鹽酸、 硫酸購(gòu)自國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司； 色譜甲醇購(gòu)自美國(guó)默克公司. 高效液相色譜儀(Waters 2695型， 美國(guó)Waters公司)； 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(L3S型， 上海儀電分析儀器有限公司).

1.2 色譜條件

用甲醇(溶劑A,φ=55%)和體積分?jǐn)?shù)為0.2%的磷酸(溶劑B,φ=45%)作為流動(dòng)相進(jìn)行高效液相色譜分析. 流速為1.0 mL/min， 柱溫為35 ℃， 進(jìn)樣量為20 μL， 檢測(cè)波長(zhǎng)為370 nm. 所得校準(zhǔn)曲線公式為y=66 924x-20 981(R2=0.999 9).

1.3 游離態(tài)和結(jié)合態(tài)山奈酚的提取

將干燥的辣木籽1 105 g粉碎后， 分次放入1 L圓底燒瓶中， 加入體積分?jǐn)?shù)為60%的甲醇回流， 按固液比(m(固)∶V(液))=1∶7進(jìn)行提取， 60 ℃水浴中回流1 h， 反復(fù)提取2次， 合并提取液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后得辣木籽浸膏， 并稱質(zhì)量.

1.4 響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助提取方法

分別采用不同硫酸或鹽酸濃度(0，1×10-3，5×10-3，0.01，0.05，0.1，0.2，0.4，0.8 mmol/L)、 固液比(1∶5,1∶10,1∶50,1∶100,1∶200)和提取時(shí)間(5,10,20,30,40,50，60 min)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn). 以山奈酚的提取率為衡量指標(biāo)， 確定響應(yīng)面的實(shí)驗(yàn)條件.

利用Box-Behnken數(shù)據(jù)處理軟件， 采用RSM方法分析優(yōu)化條件間的交互作用[20]. 基于單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果， 將提取溫度設(shè)定為60 ℃， 選擇鹽酸濃度、 提取時(shí)間和固液比3個(gè)影響因素， 考察山奈酚的提取率， 對(duì)其提取條件進(jìn)行優(yōu)化.

1.5 抗氧化效果

1.5.1 ·O2-自由基清除法

根據(jù)文獻(xiàn)[21-22]對(duì)鄰苯三酚自氧化速率進(jìn)行測(cè)定及不同濃度山奈酚(10，50，100，200，500 μmol/L)和維生素C(Vc， 5 mmol/L)對(duì)·O2-自由基進(jìn)行測(cè)定， 并計(jì)算清除率.

1.5.2 DPPH·自由基清除法

采用DPPH·自由基測(cè)定方法[21-22]， 分別計(jì)算濃度為10,50,100,200,500 μmol/L的山奈酚溶液及Vc(5 mmol/L)對(duì)DPPH·自由基的清除率.

2 結(jié)果與討論

2.1 山奈酚提取單因素實(shí)驗(yàn)

不同條件下各單因素對(duì)山奈酚提取率的影響如圖1所示.

圖1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Single factor experimental results

2.1.1 不同萃取劑和鹽酸濃度對(duì)山奈酚提取率的影響

由圖1(A)可見(jiàn)， 當(dāng)萃取溶劑為乙酸乙酯，V(乙酸乙酯)∶V(甲醇)=1∶1， 溫度為60 ℃時(shí)， 提取效果最佳. 由圖1(B)可見(jiàn): 當(dāng)鹽酸濃度為5×10-3～0.05 mol/L時(shí)， 山奈酚提取率較高； 當(dāng)硫酸濃度較高時(shí)， 山奈酚提取率顯著降低； 不同濃度鹽酸溶液中山奈酚的提取率均高于在硫酸溶液中的提取率. 因此， 確定鹽酸最佳濃度為0.01 mmol/L.

2.1.2 提取時(shí)間對(duì)山奈酚提取率的影響

選擇提取時(shí)間分別為5,10,20,30,40,50,60 min， 結(jié)果如圖1(C)所示. 由圖1(C)可見(jiàn)： 當(dāng)提取時(shí)間小于5 min時(shí)， 山奈酚的提取率較低， 可能是因?yàn)槲唇o溶劑提供足夠的時(shí)間滲透到辣木籽中所致； 當(dāng)提取時(shí)間大于20 min時(shí)， 提取率呈下降趨勢(shì). 因此， 確定最佳提取時(shí)間為10 min.

2.1.3 固液比對(duì)山奈酚提取率的影響

原料與溶劑的比例是決定萃取效率的一個(gè)關(guān)鍵因素. 較大的溶劑體積可提高萃取效率， 但體積過(guò)大會(huì)導(dǎo)致萃取過(guò)程復(fù)雜. 由圖1(D)可見(jiàn)， 當(dāng)固液比為1∶50～1∶100時(shí)， 山奈酚的提取率顯著提高， 這可能是因?yàn)楫?dāng)固液比小于1∶50時(shí)， 提取物的黏度過(guò)大， 阻礙了山奈酚的有效提取. 因此， 確定最佳固液比為1∶100.

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化結(jié)果

以鹽酸濃度、 固液比和提取時(shí)間為3個(gè)變量因素， 山奈酚提取率為實(shí)驗(yàn)指標(biāo)， 進(jìn)行如表1所示的隨機(jī)化實(shí)驗(yàn). 共進(jìn)行17次實(shí)驗(yàn)， 5次重復(fù)(運(yùn)行3，4，8，12，17次)用于估計(jì)純誤差平方和.

表1 Box-Behnken設(shè)計(jì)

回歸方程的可信度分析列于表2. 由表2可見(jiàn)， 預(yù)測(cè)的R2=0.170 4, 與調(diào)整后的R2=0.790 6相符， 精度比為7.294. 兩個(gè)響應(yīng)的回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果列于表3. 由表3可見(jiàn)， 模型具有較高的F值和較低的P值， 表明該值由噪聲導(dǎo)致的概率僅為0.01%. 由于任何小于0.050 0的F值均為顯著的， 大于0.1則為不顯著， 因此， 模型中的A,B,C,AB,AC，BC，A2，B2，C2是顯著的. 得到的回歸方程為

提取率=(1.1+6.8×10-2A+2.6×10-2B+9.8×10-2C-5.4×10-2AB-

4.3×10-2AC+0.05BC-0.23A2-0.29B2-2.9×10-2C2)%，

(1)

其中A為鹽酸濃度， B為提取時(shí)間， C為固液比.

表2 回歸方程的可信度分析

三維響應(yīng)面是回歸方程的圖形表現(xiàn)， 可預(yù)測(cè)檢驗(yàn)變量和響應(yīng)值與各變量水平間的相互作用關(guān)系[23-24]. 圖2為響應(yīng)值對(duì)應(yīng)各影響因素對(duì)山奈酚提取率的影響. 基于Desigh-Expert軟件分析， 預(yù)測(cè)最佳提取工藝為： 鹽酸濃度6.1×10-2mmol/L， 提取時(shí)間12.87 min， 固液比1∶137.46， 提取率可達(dá)1.11%.

2.3 山奈酚對(duì)·O2-自由基和DPPH·自由基的清除能力

在堿性條件下， 鄰苯三酚可通過(guò)發(fā)生自氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)釋放超氧陰離子， 同時(shí)超氧陰離子進(jìn)一步加速鄰苯三酚發(fā)生氧化反應(yīng)， 生成一系列中間產(chǎn)物. 通過(guò)在反應(yīng)體系中加入抗氧化物質(zhì)以降低鄰苯三酚自氧化速率， 達(dá)到清除產(chǎn)生的超氧陰離子的作用， 抑制中間產(chǎn)物生成， 使反應(yīng)溶液的吸光度減小[21]. 不同濃度的山奈酚提取物對(duì)·O2-自由基的清除率如圖3所示. 由圖3可見(jiàn)： 10 μmol/L山奈酚對(duì)·O2-自由基的清除率為4.8%， 200 μmol/L山奈酚對(duì)·O2-自由基的清除率為26.1%， 且具有劑量依賴性； 陽(yáng)性對(duì)照Vc的清除能力最強(qiáng)為58.3%， 可見(jiàn)低濃度的山奈酚對(duì)·O2-自由基的清除率較低.

表3 回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)

山奈酚對(duì)DPPH·自由基的清除是通過(guò)待測(cè)物質(zhì)給出的氫原子與DPPH·自由基結(jié)合， 從而改變?nèi)芤旱奈舛? 不同濃度的山奈酚對(duì)DPPH·自由基的清除率如圖4所示. 由圖4可見(jiàn)， 10 μmol/L山奈酚對(duì)DPPH·自由基的清除率為38.8%， 且隨著山奈酚濃度的提高， 其對(duì)DPPH·自由基清除率也升高.

綜上所述， 本文通過(guò)雙相酸水解法優(yōu)化了山奈酚的提取條件， 通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)考察酸濃度、 提取時(shí)間和固液比對(duì)山奈酚提取率的影響， 并利用響應(yīng)面Box-Behnken實(shí)驗(yàn)得到山奈酚提取的最佳工藝條件為： 鹽酸濃度6.1×10-2mmol/L， 提取時(shí)間12.87 min， 固液比1∶137.46， 該條件下山奈酚的提取率可達(dá)1.11%. 本文中山奈酚對(duì)·O2-自由基和DPPH·自由基均有一定的清除作用， 且呈劑量依賴， 其中對(duì)DPPH·自由基的清除能力較強(qiáng)， 10 μmol/L 的山奈酚對(duì)DPPH·自由基清除率為38.8%.