楊珺源，駢紅茹，楊明珠，鄭 直

(中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所 北京協(xié)和醫(yī)學院基礎學院 生物化學與分子生物學系，北京 100005)

惡性瘧原蟲(Plasmodiumfalciparum,P.falciparum, Pf)和間日瘧原蟲(Plasmodiumvivax,P.vivax, Pv)是傳染病瘧疾的主要病原體[1]。有效控制或消除瘧疾必須阻斷瘧原蟲的傳播[1-2]。瘧原蟲配子體是按蚊通過受感染的人類傳播瘧疾的關鍵[3]。

瘧原蟲雌性配子體特異性轉錄的動合子25 ku表面蛋白的轉錄子(ookinetes surface protein s25 mRNA, s25 mRNA)已被廣泛用作檢測瘧原蟲雌性配子體的靶標，s25 mRNA僅在雌性配子體中轉錄，在雌雄配子結合受精后發(fā)育成的動合子中激活翻譯為表面蛋白s25[4]。目前針對Pfs25和Pvs25 mRNA的檢測方法有RT-qPCR，nest-RT-PCR，RT-LAMP，QT-NASBA等[5-9]，但由于大部分方法需核酸提取和反轉錄，耗時耗力且需要針對每個靶標(待測靶序列)設計其反轉錄的熒光探針，靈活性低；有些方法仍需電泳分析，或因本身步驟復雜、易污染、技術難度高等原因無法應用于大規(guī)模篩查。所以目前缺乏一種操作快速簡便，靈敏特異且高通量的雌性配子體的篩查方法。

本研究基于實驗室前期研究基礎[11]，建立了基于捕獲和連接的PCR(capture and ligation probe-PCR, CLIP-PCR)染料法和通用TaqMan探針法檢測瘧原蟲雌性配子體s25 mRNA，將血樣裂解后直接特異性捕獲mRNA靶標，通過探針雜交將擴增模板置換為DNA，通過通用TaqMan探針或SYBR Green染料檢測，全程高效靈敏，為大規(guī)模配子體檢測帶來便利。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品：北京健康受試者的血液3份、云南那邦鎮(zhèn)的Pv瘧原蟲感染血液樣品3份、中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所的血液培養(yǎng)的Pf樣品1份。該研究獲得北京協(xié)和醫(yī)學院倫理委員會批準(批準文號: 032-2016)及受試者的知情同意。

1.1.2 主要試劑：T4 多聚核苷酸激酶(New England Biolabs，NEB 公司)；裂解液和96 孔捕獲板和洗液(Diacurate公司；www.diacurate.com)；血液DNA提取試劑盒和蛋白酶K(北京天根生化科技有限公司)；T4 DNA連接酶(北京康為世紀生物科技有限公司)；TransStart Green qPCR SuperMix和Ex Taq Premix (全式金生物技術有限公司)；One Step PrimeScripTMRT-PCR Kit(TaKaRa公司)；MEGAscript? Kit(Thremo Fisher Scientific 公司)；捕獲探針和連接探針(Diacurate公司)。

1.2 方法

1.2.1 樣品的采集：血液樣品使用真空采樣管抽取一定量的靜脈血，而后分裝于1.5 mL的離心管，裂解液裂解后于-80 ℃保存。血液培養(yǎng)的Pf樣品由中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所王恒教授饋贈。

1.2.2 CLIP-PCR捕獲和連接探針的設計：以Pf雌性配子體(GenBank：XM_001347551)和Pv雌性配子體(GenBank：XM_001608410)的Pfs25和Pvs25 mRNA為檢測靶標，根據(jù)CLIP-PCR原理[11]，設計捕獲探針(capture probe，CP)和連接探針(ligation probe，LP)(表1，2)。即在靶標互補結合序列的5′或3′端加入特殊設計的尾巴序列，CP的尾巴序列可以與96孔板上固定的寡核苷酸雜交，LP的尾巴序列可以與通用引物和通用TaqMan探針雜交。

1.2.3 擴增用通用TaqMan探針的設計：設計一條TaqMan探針，該探針含有3個LNA(locked nucleic acid)，且該探針與人類基因組和瘧原蟲基因組具有低同源性。

表1 惡性瘧s25 mRNA的捕獲探針和連接探針的靶標結合序列

表2 間日瘧s25 mRNA的捕獲探針和連接探針的靶標結合序列

1.2.4 標準品的制備：1)根據(jù)Pf和Pv雌性配子體s25 mRNA即基因的序列設計擴增引物，用從血液培養(yǎng)的Pf 或云南那邦鎮(zhèn)Pv感染血液樣品提取的DNA為模版，擴增目的基因。2)用T7啟動子加入原正向引物作為新擴增正向引物和反向引物對目的基因進行擴增得到5′端有T7啟動子序列的s25基因。3)以此作為轉錄模板，最終經(jīng)轉錄純化分別得到的Pfs25和Pvs25 mRNA，得量分別為155.9 ng/μL和201.0 ng/μL，換算得到的拷貝數(shù)(copies)為4.49×1011copies/μL 和6.17×1011copies/μL，以此分別作為接下來實驗中的標準品。

1.2.5 CLIP-PCR檢測瘧原蟲配子體：原理見圖1。1)樣品(血液10 μL)加入配制好的裂解體系中(16.7 μL的3×裂解液、2.5 μL 20 g/L蛋白酶K、0.5 μL 100 nmol/L探針工作液、去離子水)共50 μL，恒振蕩儀56 ℃，1 200 r/min裂解30 min(RNA標準品無需此步驟)。2)將裂解產(chǎn)物轉移至96孔捕獲板，每孔50 μL，1 000 r/min恒溫振蕩捕獲30 min。3)捕獲結束后將板內的液體甩出，用1×的洗液以每孔150 μL×3次洗滌捕獲孔，拍干，2 500 r/min反向離心20 s。4)加入連接體系每孔50 μL(5×連接緩沖液10 μL、1 μL T4 DNA 連接酶、39 μL去離子水)，于37 ℃ 12 min進行連接反應。連接反應結束后甩干板子，通過SYBR Green 染料法或者TaqMan探針法進行qPCR檢測。

(1)SYBR Green 染料法：加入qPCR 反應體系每孔25 μL/孔(含12. 5 μL TransStart Green qPCR SuperMix、0.2 μL 10 nmol/L 引物、12.1 μL去離子水)，離心后放入BioRad CFX96熒光定量PCR儀中，95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，55 ℃ 10 s， 72 ℃ 20 s，進行40個循環(huán)，最后進行熔解曲線分析。

(2)通用TaqMan探針法：加入qPCR反應體系每孔25 μL(12.5 μL Premix Ex Taq Probe qPCR、0.5 μL 10 nmol/L引物、0.25 μL 10 nmol/L TaqMan探針、11.25 μL去離子水)，離心，放入BioRad熒光定量PCR儀中，95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，55 ℃ 10 s，72 ℃ 20 s，進行40個循環(huán)。

圖1 CLIP-PCR配子體檢測技術的實驗原理Fig 1 Principle of gametocytes detection by CLIP-PCR

1.2.6 標準RT-qPCR：參照文獻[10]中的TaqMan 探針和引物序列的設計，RT-qPCR 定量檢測瘧原蟲的靶標s25 mRNA。

1.2.7 瘧原蟲檢測：參照文獻[11] 的方法定量檢測培養(yǎng)的Pf或Pv實際樣品中18S rRNA。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 染料法CLIP-PCR的熔解曲線和通用TaqMan探針法CLIP-PCR的擴增曲線

分別檢測不同拷貝數(shù)的Pfs25和Pvs25 mRNA標準品、健康人血液樣品和無模板對照(no template control, NTC)。CLIP-PCR染料法檢測Pfs25 mRNA的陽性峰Tm值為78 ℃，健康人血液樣品和NTC的引物二聚體峰Tm值為75 ℃(圖2A)；Pvs25 mRNA的陽性峰Tm值為78.5 ℃，健康人血液樣品和NTC的引物二聚體峰Tm值為76.5 ℃(圖2B)，不同靶標濃度下的熔解曲線峰形均一，均為單峰。CLIP-PCR通用TaqMan探針法檢測Pfs25 mRNA和Pvs25 mRNA在各濃度均有S型擴增曲線的趨勢，健康人血液樣本和NTC無擴增信號(圖3)。

2.2 染料法和通用TaqMan探針法CLIP-PCR與RT-qPCR靈敏度與重復性對比

如圖4所示，2種方法與RT-qPCR相比，不同濃度標準品測得的循環(huán)定量(quantification cycle,Cq)值與拷貝數(shù)的對數(shù)值呈良好的線性關系，且線性基本相似。與RT-qPCR相比，2種方法都可以檢測到11 copies/reaction的Pfs25和Pvs25 mRNA，且相同濃度重復3次檢測批內重復性均良好。各個濃度的 Cq 值變異系數(shù)(cofficient of variaiton，CV) 均小于5%。

-d(RFU)/dT.derivative of fluorescence intensity with respect to temperature; NTC.no template control圖2 染料法CLIP-PCR檢測Pfs25 mRNA(A)和Pvs25 mRNA(B)的熔解曲線Fig 2 Melting curve of SYBR Green CLIP-PCR by detecting Pfs25 mRNA (A)and Pvs25 mRNA(B)

NTC. no template control圖3 通用TaqMan探針法CLIP-PCR檢測Pfs25 mRNA(A)和Pvs25 mRNA(B)的擴增曲線Fig 3 Amplification curve of TaqMan CLIP-PCR by detecting Pfs25 mRNA (A)and Pvs25 mRNA(B)

2.3 染料法和通用TaqMan探針法CLIP-PCR檢測瘧原蟲雌性配子體特異性分析

染料法和通用TaqMan探針法CLIP-PCR可以從人為混合的 RNA模板中準確檢測出Pfs25 mRNA和Pvs25 mRNA(表3)，且與非混合模板的差異無統(tǒng)計學意義。

2.4 在實際樣品中的應用

CLIP-PCR染料法檢測血液培養(yǎng)Pf樣品和3例Pv瘧原蟲陽性血液樣品(表4)。

圖4 染料法、通用TaqMan探針法CLIP-PCR和RT-qPCR檢測Pfs25 mRNA(A)和Pvs25 mRNA(B)的比較

表3 染料法和通用TaqMan探針法CLIP-PCR檢測單獨或混合的Pfs25和Pvs25 mRNA模板

表4 Pf和Pv實際樣品中瘧原蟲(18S rRNA)及其雌性配子體密度(s25 mRNA)的Cq值

3 討論

本研究建立了一種基于捕獲和連接擴增的染料法和通用TaqMan探針法檢測瘧原蟲雌性配子體s25 mRNA。將裂解血樣與CP、LP在96孔捕獲板中共同孵育，CP一端與靶標互補配對，另一端與捕獲板上的寡核苷酸互補配對，直接把特異性RNA靶標固定到96孔板上，LP也與靶標互補配對，形成“三明治”雜交。酶促反應連接連續(xù)的LP，形成兩端為通用引物和通用熒光探針序列結合序列的DNA模板，由此將待檢靶標由RNA置換為單鏈DNA擴增模板，從而省去了核酸提取和反轉錄的步驟。除此之外，相比RT-qPCR，本方法無需對特異性靶標進行單獨的熒光探針設計，通過在LP中加入通用熒光探針的互補序列，使得擴增模板5′端通用引物的下游帶有熒光探針結合區(qū)域，從而可直接用探針法進行檢測。本工作相較于實驗室前期基礎[11]，拓展了設計思路，建立了一種新的探針檢測方法。

本方法適用于多種靶標的檢測，根據(jù)不同靶標設計可自由設計探針。針對同一靶標設計多組探針，同時擴增，在靶標含量極少的情況下能有效降低假陰性的出現(xiàn)。本方法具有多重檢測的應用潛力，通用TaqMan探針和引物的使多重體系的調整方便靈活。利用通用引物進行單獨擴增，避免了特異引物在PCR中的非特異結合，同時也減少了由于引物的相互影響帶來的錯誤結果；利用通用TaqMan探針替代設計探針避免了不同靶標熒光探針結合能力不同對信號的影響，同時減少多根熒光探針錯誤結合的情況。

評價配子體攜帶率和配子體密度有利于了解當?shù)氐膫鞑摿?，改進消除策略以及配子體藥物的篩選。本研究開發(fā)了CLIP-PCR染料法和通用TaqMan探針法檢測Pf、Pv的雌性配子體s25 mRNA，結果表明，該方法特異性良好，檢測陽性與健康人血液樣本和NTC都可明顯區(qū)分，檢測不同瘧原蟲種的同源s25 mRNA的混合模板不發(fā)生信號交叉。靈敏度和重復性與標準RT-qPCR相當，仍需繼續(xù)優(yōu)化條件提高靈敏度。檢測實際樣品適用性良好，配子體的濃度與瘧原蟲濃度大致呈現(xiàn)正相關。但檢測樣品量較少，計劃下一步加測Pf和Pv臨床樣品，驗證配子體與瘧原蟲之間準確關系。除此之外，本方法全程簡單快速，僅涉及試劑的添加、孵育和清洗，在處理大量樣品時可以明顯減少實驗操作時間，相比RT-qPCR檢測96個樣品需6～8 h，本方法可在3～4 h內完成檢測。

綜上所述，本研究研發(fā)了一種靈敏高效的Pf和Pv雌性配子體的檢測技術，在瘧疾傳播控制和配子體大規(guī)模篩查中具有一定的應用價值。