劉云璐,王承龍,王 強,楊 靜

(1.中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院，北京 100089;2.國家中醫(yī)心血管臨床醫(yī)學(xué)研究中心，北京 100089;3.中國中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院，北京 100102;4.中國中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗中心，北京 100010)

心力衰竭(心衰)是威脅全球人類健康最主要的疾病之一[1-3]。心衰可由任何導(dǎo)致的心內(nèi)壓升高或心輸出量減少的心臟疾病引起[3]。心肌梗死被認為是導(dǎo)致心衰的主要原因。心肌細胞的緩慢持續(xù)的損傷和死亡，是導(dǎo)致進行性心功能不全的主要病理生理機制[4]。因此，了解心肌細胞損傷死亡的機制，對預(yù)防心衰具有重要性。目前，心衰的機制研究包括心肌細胞死亡、線粒體功能異常[5]、鈣調(diào)控失調(diào)、心肌纖維化和心肌肥大等方面[6-8]。明確心肌細胞損傷模型形成的機制，對心衰的基礎(chǔ)研究進展，具有重要意義[7]。

戊巴比妥鈉對中樞神經(jīng)系統(tǒng)存在廣泛的抑制作用，故研究中常作為動物基礎(chǔ)麻醉藥[8]。然其對心臟也具有較大的副作用，可嚴重抑制心肌收縮功能導(dǎo)致心衰。其損傷機制除線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激之外，還與細胞凋亡、細胞自噬等環(huán)節(jié)密切相關(guān)[3,9]，因此戊巴比妥鈉可作為制作體外心力衰竭模型的藥物[10]。目前，戊巴比妥鈉誘導(dǎo)心肌細胞損傷死亡的機制尚不十分明確，本實驗通過電鏡下直觀地觀察心肌細胞、亞細胞、凋亡狀態(tài)的改變，明確戊巴比妥鈉誘導(dǎo)大鼠心肌細胞株H9c2(2-1)(H9c2細胞)細胞損傷死亡的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 戊巴比妥鈉粉末(美國SIGMA公司，貨號57-33-0)，國產(chǎn)DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Gibco公司，貨號C11995500BT)，胎牛血清(Gibco公司，貨號10100147)，0.25%胰蛋白酶(Gibco公司，貨號25200272)，青鏈霉素混合液(Gibco公司，貨號15140122)，PBS緩沖液(索萊寶科技有限公司，貨號P1020)，活性氧(ROS)試劑盒(美國SIGMA公司，貨號MAK114)，三磷酸腺苷(ATP)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所，貨號A095-2-1)，戊二醛溶液(美國SIGMA公司，貨號G5882)，RIPA組織/細胞裂解液(北京索萊寶科技有限公司，貨號S3568)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)：H9c2細胞(購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院細胞資源中心)，培養(yǎng)于10%胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM高糖完全培養(yǎng)基中(37 ℃、5%CO2)。待細胞生長成熟，狀態(tài)穩(wěn)定后，進行實驗。

1.2.2 構(gòu)建心肌細胞損傷模型：無血清DMEM高糖培養(yǎng)基溶解戊巴比妥鈉粉末，混勻后配置成0.4%、0.8%、1.6%戊巴比妥鈉溶液。加至生長H9c2心肌細胞的六孔板中，分別作用0、7、10 min。實驗最終確定，0.8%戊巴比妥鈉處理H9c2細胞7 min，為心肌細胞損傷模型最佳條件。

1.2.3 透射電鏡觀察H9c2細胞線粒體、自噬小體形態(tài)結(jié)構(gòu)變化：低倍鏡下(德國Leica倒置顯微鏡)觀察H9c2細胞形態(tài)學(xué)改變。透射電鏡(日本HITACHI投射電子顯微鏡)觀察H9c2細胞線粒體超微結(jié)構(gòu)改變。0.25%EDTA的胰蛋白酶消化、收集細胞，PBS潤洗2次，離心，加入2%戊二醛，4 ℃固定過夜。PBS漂洗，1%鋨酸固定，1%醋酸鈾塊染，梯度丙酮脫水，包埋液包埋固化，半薄切片及甲苯胺藍染色，LKB-V超薄切片機超薄切片。透射電鏡下觀察H9c2細胞線粒體自噬小體形態(tài)及數(shù)量改變。

1.2.4 CCK-8法檢測H9c2細胞增殖活力： H9c2心肌細胞1×104個/孔接種于96孔板中，100 μl/孔完全培養(yǎng)基，每組6復(fù)孔。隔夜培養(yǎng)后，戊巴比妥鈉干預(yù)7 min，24 h后檢測細胞增殖活力。每孔10 μl CCK-8，90 μl完全培養(yǎng)基，避光37 ℃、5%CO2培養(yǎng)2～4 h。酶標儀450 nm檢測OD值，計算H9c2細胞增殖活力。

1.2.5 H9c2細胞ATP、ROS含量變化:ATP試劑盒通過蟲熒光素酶法，檢測H9c2細胞ATP濃度。棄去6孔板原有培養(yǎng)基，加入200 μl/孔裂解液，移液槍反復(fù)吹打，晃動6孔板，使裂解液充分接觸并裂解細胞。4 ℃、12000 g離心5 min，取上清。加100 μl酶工作液至檢測管，室溫放置3～5 min，消耗掉本底全部ATP。細胞上清20 μl/檢測管孔，微量移液槍迅速混勻，間隔2 s以上，液閃儀測定RLU值。

ROS熒光探針標記H9c2細胞中ROS。H9c2細胞1×104/cm2于10 cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)12 h后，0.8%戊巴比妥鈉處理7 min，加入完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。棄去培養(yǎng)基，PBS潤洗細胞2次，0.25%胰蛋白酶消化，吹打。1000 r/min離心5 min，棄上清。無血清培養(yǎng)基稀釋10 μmol/L活性氧熒光探針(DCFH-DA，1∶1000)，重懸H9c2細胞團；37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育30 min，每隔5 min混勻1次?；A(chǔ)培養(yǎng)基重懸細胞3次，每次1000 r/min離心5 min，熒光顯微鏡檢測強熒光產(chǎn)物2’,7’-二氯熒光素(2’,7’-Dichlorofluorescein,DCF)。

1.2.6 流式細胞術(shù)檢測H9c2細胞凋亡改變:不含EDTA胰蛋白酶消化H9c2細胞，1000 r/min離心5 min，4 ℃預(yù)冷的PBS潤洗細胞2次，250 μl結(jié)合緩沖液(去離子水1∶10稀釋)重懸細胞，調(diào)節(jié)H9c2細胞濃度為1×106/ml。5 ml流式管100 μl細胞懸液中，加入Annexin V-FITC和10 μl碘化丙錠溶液各5 μl，混勻，室溫避光孵育15 min，反應(yīng)管中加400 μl PBS，1 h內(nèi)流式細胞儀檢測。

2 結(jié) 果

2.1 0.8%戊巴比妥鈉處理H9c2細胞7 min為構(gòu)建心肌細胞損傷模型最佳條件 低倍鏡下，H9c2細胞形態(tài)如圖1所示，0%(對照組)，0.4%、0.8%、1.6%戊巴比妥鈉分別處理H9c2細胞0、7、10 min。倒置顯微鏡下觀察H9c2細胞，原本梭形的細胞兩端變細中部變圓，有脫壁傾向，心肌細胞搏動停止，則為造模成功。0.8%戊巴比妥鈉處理7 min的H9c2細胞符合模型條件。

圖1 光鏡比較不同條件下，戊巴比妥鈉作用于H9c2心肌細胞的形態(tài)學(xué)變化(甲苯胺藍染色，×100)

2.2 透射電鏡下觀察H9c2細胞線粒體、自噬小體等超微結(jié)構(gòu)改變 見圖2，對照組(無戊巴比妥鈉處理)，H9c2細胞線粒體邊界清楚，基質(zhì)均勻，線粒體嵴致密，形態(tài)正常。模型組(0.8%戊巴比妥鈉處理H9c2細胞7 min)，H9c2細胞線粒體邊界模糊不清，體積明顯腫脹，基質(zhì)密度降低，部分線粒體內(nèi)膜破裂、嵴疏松溶解，少數(shù)出現(xiàn)嵴斷裂現(xiàn)象，可見空泡樣變。與對照組H9c2細胞相比，模型組H9c2細胞線粒體腫脹，自噬小體的數(shù)量明顯增多，形成大量空泡，線粒體膜的完整性受到破壞(圖3)。

圖2 透射電鏡比較對照組和模型組H9c2心肌細胞中線粒體結(jié)構(gòu)變化(甲苯胺藍染色，×30000)

圖3 透射電鏡比較對照組和模型組H9c2心肌細胞中自噬小體的生成(甲苯胺藍染色，×3000)

2.3 H9c2細胞中ATP、ROS的改變 與對照組[(1.707±0.022)nmol/mg ATP]相比，模型組[(0.044±0.003)nmol/mg]ATP含量顯著減少(P<0.01)。ROS熒光探針標記實驗顯示，相比對照組，模型組DCF熒光明顯增強(圖4)。DCF熒光強弱與線粒體ROS活性成正相關(guān)，實驗顯示，模型組ROS水平明顯增加。

圖4 熒光顯微鏡下，對照組與模型組H9c2細胞中ROS(紅色熒光)表達水平(甲苯胺藍染色，×200)

2.4 H9c2心肌細胞凋亡的改變 對照組凋亡H9c2細胞(4.8%±1.04%)比模型組(7.1%±2.43%)H9c2細胞凋亡率有增加趨勢，比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。如圖5所示，相比對照組，模型組凋亡H9c2細胞增加，死亡H9c2細胞明顯增加。

圖5 流式細胞術(shù)比較對照組和模型組H9c2細胞凋亡細胞數(shù)量

3 討 論

我們的實驗探索了戊巴比妥鈉在不同藥物濃度及作用時間下，對大鼠H9c2心肌細胞形態(tài)、亞細胞形態(tài)、超微結(jié)構(gòu)、ATP、ROS、凋亡等方面的影響，從而誘導(dǎo)心衰的機制[11]。實驗結(jié)果表明，戊巴比妥鈉使H9c2細胞線粒體結(jié)構(gòu)及功能受損，下降A(chǔ)TP、ROS水平，使自噬小體及凋亡細胞增加。從而使H9c2心肌細胞存活率降低，細胞形態(tài)出現(xiàn)較大變化，繼而心肌細胞搏動停止，從而導(dǎo)致心衰。

心衰的機制被認為與線粒體能量代謝相關(guān)，心臟僅約占體重的5%，卻占ATP消耗量的18%[12-13]，戊巴比妥鈉被報道明顯抑制心肌細胞線粒體鉀通道[4,13]，從而損傷心肌細胞。我們的實驗由電鏡直接觀察戊巴比妥鈉對心肌細胞線粒體的損傷，并定量證明戊巴比妥鈉降低心肌細胞的ATP含量[14]。同樣，戊巴比妥鈉曾被報道降低心臟的左心室壓和左室收縮壓，減慢心率，抑制心肌細胞縮短幅度，降低心肌細胞的存活率[15]，抑制心臟肌層的線粒體ATP酶活性[16]。這些發(fā)現(xiàn)與我們的ATP實驗結(jié)果一致。

戊巴比妥鈉對凋亡的作用已被報道[8,17-19]，但對心肌細胞的凋亡作用尚未報導(dǎo)。我們實驗表明，戊巴比妥鈉誘導(dǎo)H9c2細胞凋亡。戊巴比妥鈉對自噬作用尚未報道，我們從電鏡下觀察到戊巴比妥鈉促進H9c2細胞自噬小體生成，為戊巴比妥鈉在凋亡方面的作用提供證據(jù)。

綜上所述，本實驗成功構(gòu)建了戊巴比妥鈉誘導(dǎo)心衰相關(guān)的大鼠H9c2心肌細胞損傷模型，并明確了戊巴比妥鈉對H9c2細胞形態(tài)、線粒體形態(tài)、ATP能量消耗、ROS氧化應(yīng)激、凋亡、自噬方面的作用。但為得到更確切的研究結(jié)論，尚需更進一步詳細的實驗。