劉家峰，舒 慶，張 穎

(1.西安市第九醫(yī)院中醫(yī)康復(fù)科，陜西 西安 710054；2.西安市第九醫(yī)院藥劑科，陜西 西安 710054； 3.西安市第九醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，陜西 西安 710054)

有研究[1]顯示左歸丸能夠產(chǎn)生類雌激素作用，通過雌激素受體α(ERα)和雌激素受體β(ERβ)對(duì)腦缺血再灌注損傷起到保護(hù)作用。腦缺血再灌注損傷是由于腦組織長(zhǎng)時(shí)間缺血、缺氧，再灌注后血氧水平恢復(fù)，活性氧短時(shí)間生成激增，誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生一系列的損傷反應(yīng)，進(jìn)而誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，產(chǎn)生神經(jīng)功能缺陷[2-4]。左歸丸對(duì)大鼠腦缺血的保護(hù)作用已經(jīng)有所報(bào)道[5]，但是目前尚無(wú)其直接針對(duì)離體細(xì)胞水平的研究。因此，本研究通過制備左歸丸含藥血清、原代培養(yǎng)神經(jīng)元膠質(zhì)混合細(xì)胞以及細(xì)胞氧糖剝奪處理[6]，在細(xì)胞水平研究左歸丸含藥血清對(duì)細(xì)胞氧糖剝奪損傷的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康SPF級(jí)SD雄性大鼠，出生后1～3 d，體重200 g左右，購(gòu)自西安交通大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SYXK(陜)2020-005。

1.1.2 主要試劑：左歸丸(Z11020735)，購(gòu)自北京同仁堂股份有限公司；0.3 g/L戊巴比妥鈉(H31020240)，購(gòu)自上海新亞藥業(yè)有限公司；相關(guān)一抗購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，二抗購(gòu)自上海易利生物科技有限公司；ER非特異性拮抗劑ICI182780，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；DMEM/F12培養(yǎng)基，購(gòu)自賽默飛世爾科技中國(guó)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 含藥血清制備：按照成人臨床日用劑量與體重折算系數(shù)比計(jì)算出相當(dāng)于中劑量的左歸丸大鼠用藥量為2.1 g/(kg·d)。左歸丸加雙蒸水(ddH2O)配制成含左歸丸0.2 g/ml的混懸液，每次灌胃時(shí)按灌服中藥量1 ml/200 g大鼠體重進(jìn)行稀釋，每天藥量按固定時(shí)間分2次灌胃，每次間隔4 h，連續(xù)給藥3 d。第3天采血前大鼠禁食12 h，采血后分離血清，56 ℃滅活30 min，220 nm濾膜過濾除菌，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 大鼠海馬神經(jīng)元膠質(zhì)細(xì)胞混合細(xì)胞原代培養(yǎng)：健康新生SD大鼠用75%酒精消毒，迅速斷頭。取腦組織，分離組織并置于無(wú)菌培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)皿中含有預(yù)先冷卻的磷酸鹽緩沖液(PBS)用于細(xì)胞培養(yǎng)。對(duì)于獲得的大腦皮層，小心地去除腦膜和血管膜。將分離的大腦皮層移入含有胰蛋白酶(終濃度0.125%)消化液的小瓶中，在37 ℃下切割并消化10 min。當(dāng)組織變成半透明時(shí)，加入等體積DMEM/F12培養(yǎng)基停止消化。然后用滴管輕輕吹過，并用200目尼龍濾網(wǎng)過濾。將過濾后獲得的細(xì)胞懸液以150 g離心8 min，丟棄上清液，將細(xì)胞重新懸浮在DMEM/F12完全培養(yǎng)基中，并將細(xì)胞密度調(diào)節(jié)至5×105/cm2，然后將其接種到預(yù)涂有聚賴氨酸的培養(yǎng)瓶中。將細(xì)胞在37 ℃、5% CO2條件下中培養(yǎng)。24 h后更換完整培養(yǎng)基，然后每2～3 d更換1次液體。

1.2.3 細(xì)胞分組及氧糖剝奪處理：將原代培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元膠質(zhì)混合細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、含藥血清組和抑制劑組。對(duì)照組細(xì)胞不做特別處理。模型組細(xì)胞給予氧糖剝奪，方案為換用無(wú)糖DMEM培養(yǎng)基并將細(xì)胞置于缺氧箱中，通入含95%氮?dú)夂?% CO2混合氣體，缺血、缺氧2 h后更換正常培養(yǎng)基。含藥血清組細(xì)胞除給予氧糖剝奪外，培養(yǎng)基中加入左歸丸含藥血清1 ml。抑制劑組細(xì)胞除給予氧糖剝奪、左歸丸含藥血清外，還另外給予ER非特異性拮抗劑ICI182780進(jìn)行干預(yù)。

1.2.4 CCK-8實(shí)驗(yàn)：將對(duì)數(shù)期的貼壁細(xì)胞通過胰酶進(jìn)行消化，使細(xì)胞脫落。待大部分細(xì)胞脫落后，加入2倍體積的培養(yǎng)基終止消化。瓶中液體全部轉(zhuǎn)移至離心管，以1000 r/min離心5 min，棄上清，用1 ml含血清培養(yǎng)基重懸，用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行計(jì)數(shù)。根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果稀釋細(xì)胞，使細(xì)胞濃度為1×106/ml。將稀釋好的細(xì)胞種于96孔板，每孔加100 μl稀釋好的細(xì)胞懸液。接種24 h、待細(xì)胞貼壁良好后，吸出培養(yǎng)基，對(duì)照組加入不含藥物培養(yǎng)基，其他三組加對(duì)應(yīng)的含藥培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育12 h。再次吸出培養(yǎng)基，各孔加入含CCK-8的培養(yǎng)基，CCK-8占培養(yǎng)基體積約1/10。孵育1 h，待顏色變?yōu)槌壬笥妹笜?biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)。

1.2.5 酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)實(shí)驗(yàn)：收集細(xì)胞培養(yǎng)液樣本，采用ELISA法檢測(cè)氧化應(yīng)激和炎癥因子谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白介素-1β(IL-1β)表達(dá)水平。首先，在實(shí)驗(yàn)前確定酶標(biāo)板孔數(shù)(包括空白對(duì)照孔，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品重復(fù)3個(gè)孔)。向孔中加入100 μl預(yù)稀釋濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品。同時(shí)，在空白對(duì)照孔中加入100 μl樣品稀釋劑。加入樣品后蓋上酶標(biāo)板，置于37 ℃恒溫箱中90 min，反應(yīng)后除去酶標(biāo)板中液體，依次加入預(yù)先制備的生物素化抗細(xì)胞因子抗體工作液，每孔100 μl，在37 ℃下孵育60 min。反應(yīng)完成后用0.01 mmol/L PBS洗滌混合物3次，每次浸泡1 min。預(yù)先制備的ABC工作液(包括HRP-鏈霉親和素)按100 μl/孔依次加入，置于37 ℃恒溫箱中30 min，反應(yīng)后用0.01 mmol/L PBS洗滌5次，每次浸泡1～2 min。加入TMB顯色液，置于37 °C培養(yǎng)箱中15 min。以每孔100 μl加入TMB終止液，并在450 nm處測(cè)定吸光度值。對(duì)照孔吸光度值減去各濃度標(biāo)準(zhǔn)樣品和待測(cè)樣品的吸光度值后，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行線性擬合，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各樣品中細(xì)胞因子的濃度。

1.2.6 Western blot實(shí)驗(yàn)：對(duì)TNF-α、IL-1β、B細(xì)胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)x蛋白(Bax)、半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)及磷脂酰肌醇激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。收集細(xì)胞后轉(zhuǎn)入1.5 ml離心管中，加入1 ml裂解液，置于冰上裂解30 min。裂解后在4 ℃、12000 r/min條件下離心15 min，取上清置于另一個(gè)干凈的EP管中，紫外分光光度計(jì)測(cè)量蛋白濃度。5×蛋白上樣緩沖液與蛋白按照1∶4的比例混勻，95 ℃條件下進(jìn)行蛋白滅活5 min。聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳：分離膠為10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠，按50 μg蛋白總量上樣。首先用80 V低壓條件跑膠至樣品到壓縮膠與分離膠交界處，隨后改用100 V恒壓條件，直到能夠分離各個(gè)目的條帶。轉(zhuǎn)膜條件：用濕轉(zhuǎn)法，恒流250 mA轉(zhuǎn)膜90 min。轉(zhuǎn)膜完成后，將NC膜放于TBST所配制的5%脫脂牛奶中，進(jìn)行蛋白封閉1 h。封閉之后用1%牛奶配置的一抗于4 ℃條件孵育過夜。次日，NC膜用TBST清洗3次，每次10 min，隨后用1%牛奶配制的二抗室溫孵育1 h。再用TBST洗滌3次，每次10 min。用ECL顯影定影液孵育NC膜1 min，將NC膜條帶放入顯影器進(jìn)行顯影。

2 結(jié) 果

2.1 各組細(xì)胞存活率比較 見圖1。與對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞在氧糖剝奪后細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.05)。與模型組相比，含藥血清組細(xì)胞存活率顯著增加(P<0.05)。ER拮抗劑ICI182780干預(yù)后，左歸丸含藥血清的作用被顯著減弱(P<0.05)。抑制劑組與模型組細(xì)胞存活率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

2.2 各組細(xì)胞GSH-Px、MDA、IL-1β、TNF-α表達(dá)水平比較 見表1。與對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞在氧糖剝奪后GSH-Px水平顯著減少，MDA、IL-1β、TNF-α水平出現(xiàn)顯著升高(均P<0.05)。與模型組相比，含藥血清組細(xì)胞GSH-Px水平顯著增加，MDA、IL-1β、TNF-α水平出現(xiàn)明顯下降(均P<0.05)。ER拮抗劑ICI182780干預(yù)后，左歸丸含藥血清的作用被顯著減弱(P<0.05)。抑制劑組與模型組細(xì)胞GSH-Px、MDA、IL-1β、TNF-α水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。

表1 各組細(xì)胞GSH-Px、MDA、IL-1β、TNF-α表達(dá)水平比較

2.3 各組細(xì)胞TNF-α、IL-1β蛋白表達(dá)水平比較 見圖2。與對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞在氧糖剝奪后TNF-α、IL-1β蛋白表達(dá)水平顯著上升(均P<0.05)。與模型組相比，含藥血清組細(xì)胞TNF-α、IL-1β蛋白表達(dá)水平則出現(xiàn)顯著下降(均P<0.05)。ER拮抗劑ICI182780干預(yù)后，左歸丸含藥血清的作用被顯著減弱(均P<0.05)。抑制劑組與模型組細(xì)胞TNF-α、IL-1β蛋白表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。

2.4 各組細(xì)胞Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)水平比較 見圖3。與對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞在氧糖剝奪后Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著減少，Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)水平出現(xiàn)顯著升高(均P<0.05)。與模型組相比，含藥血清組Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)，Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)水平出現(xiàn)顯著下調(diào)(均P<0.05)。ER拮抗劑ICI182780干預(yù)后，左歸丸含藥血清的作用被顯著減弱(P<0.05)。抑制劑組與模型組Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。

2.5 各組細(xì)胞PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較 見圖4。與對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞在氧糖剝奪后PI3K/AKT信號(hào)通路p-PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)水平顯著下降(均P<0.05)。與模型組相比，含藥血清組細(xì)胞p-PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)水平顯著上升(均P<0.05)。ER拮抗劑ICI182780干預(yù)后，左歸丸含藥血清的作用被顯著減弱(均P<0.05)。抑制劑組與模型組細(xì)胞p-PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。

左圖：為蛋白電泳圖;右圖：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

左圖：蛋白電泳圖；右圖：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

左圖：蛋白電泳圖；右圖：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

3 討 論

缺血性腦損傷是危害人類健康的主要疾病之一，致死、致殘率極高，目前治療手段有限，特別是針對(duì)卒中后的神經(jīng)功能恢復(fù)一直沒有有效的治療策略或藥物。中藥左歸丸是傳統(tǒng)補(bǔ)腎名方[7]，有研究發(fā)現(xiàn)其能夠產(chǎn)生類雌激素作用，對(duì)腦缺血再灌注損傷產(chǎn)生保護(hù)作用。我們前期研究也發(fā)現(xiàn)左歸丸可以通過ERs/PI3K/AKT信號(hào)通路對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷起到保護(hù)作用，但是目前尚沒有在細(xì)胞水平研究證實(shí)左歸丸對(duì)缺血損傷的保護(hù)作用。

缺血性腦損傷發(fā)生后，由于缺血、缺氧，導(dǎo)致腦細(xì)胞特別是神經(jīng)元損傷，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而直接影響神經(jīng)功能缺陷[8-9]。因此，減少神經(jīng)細(xì)胞損傷是減輕腦缺血再灌注損傷的重要策略。海馬組織是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要組成部分，與多種神經(jīng)功能活動(dòng)相關(guān)，也是對(duì)缺血、缺氧敏感的區(qū)域，因此本研究選擇原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元膠質(zhì)細(xì)胞混合細(xì)胞進(jìn)行研究[10-12]。為了使中藥藥效與中藥成分的研究能協(xié)調(diào)一致，我們首先制備了左歸丸含藥血清。本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，氧糖剝奪導(dǎo)致原代培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞存活率顯著降低，左歸丸含藥血清可以顯著地保護(hù)氧糖剝奪造成的神經(jīng)細(xì)胞凋亡。凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax和Caspase-3的檢測(cè)結(jié)果也與CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，氧糖剝奪后Bcl-2蛋白表達(dá)下降，Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)增加，左歸丸含藥血清干預(yù)后Bcl-2蛋白表達(dá)增加，Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)減少。本研究結(jié)果首次從細(xì)胞水平證實(shí)左歸丸對(duì)缺血性腦損傷能夠起到保護(hù)作用。

研究[13-16]證實(shí)，炎癥、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡和興奮性毒性等機(jī)制參與了腦缺血再灌注損傷過程。我們前期在整體動(dòng)物上的研究也證實(shí)左歸丸的抗腦缺血作用與其對(duì)氧化應(yīng)激、炎癥的調(diào)控作用相關(guān)。因此，本研究在細(xì)胞水平也檢測(cè)了細(xì)胞中氧化應(yīng)激標(biāo)記物GSH-Px、MDA和炎癥因子TNF-α、IL-1β的水平，以及TNF-α、IL-1β蛋白表達(dá)水平。從結(jié)果可以看到，氧糖剝奪可致細(xì)胞中GSH-Px水平顯著下降，MDA、TNF-α、IL-1β水平上升，TNF-α、IL-1β蛋白表達(dá)水平也出現(xiàn)顯著上調(diào)，因此左歸丸含藥血清干預(yù)可以有效地減弱氧糖剝奪造成的氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)。

先前已經(jīng)有多篇研究提示左歸丸具有雌激素樣作用，我們?cè)趧?dòng)物水平的研究中也發(fā)現(xiàn)其對(duì)缺血性腦損傷的保護(hù)作用由ERs/PI3K/AKT信號(hào)通路介導(dǎo)。ERs/PI3K/AKT信號(hào)通路在既往研究[17-20]中也被證實(shí)參與對(duì)缺血性腦損傷的調(diào)控。本研究中，模型組細(xì)胞p-PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)水平顯著下降，含藥血清組細(xì)胞p-PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)水平顯著上升，ER拮抗劑ICI182780干預(yù)可以顯著減弱左歸丸含藥血清在氧糖剝奪過程中對(duì)PI3K/AKT通路的調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，左歸丸含藥血清對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞氧糖剝奪損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制與調(diào)控氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)及PI3K/AKT通路有關(guān)。