陳 虎，謝俊康，陸晶宇，譚健暉，李 鵬，楊章旗

（1.廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學研究院 國家林業(yè)和草原局馬尾松工程技術研究中心 廣西馬尾松工程技術研究中心 廣西優(yōu)良用材林資源培育重點實驗室，廣西南寧 530002；2.廣西師范大學，廣西桂林 541001）

萜類化合物是植物次生代謝物中最豐富的一類，在植物防御中起重要作用。萜類合成途徑中，法尼基焦磷酸（FPP）和牻牛兒牻牛兒基二磷酸（GGPP）等前體直接影響萜類合酶（Terpene syn?thase, TPS）形成萜類化合物的種類[1]。萜類已成為植物與環(huán)境互作中的重要信號分子，是參與植物防御反應的植保素及調控植物部分激素的物質[1-2]。激素信號轉導途徑有利于增加植物萜類物質，從而提高植物抗性。茉莉酸（Jasmonic acid，JA）和茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate，MeJA）途徑可調控萜類物質代謝，提高植物抗蟲能力[1,3-4]。水楊酸（Salicylic acid，SA）途徑有利于植物萜類物質積累；赤霉素（Gibberellin，GA）代謝途徑中，GAOsCPS1基因參與萜類物質的合成[5]。在針葉樹中，JA 途徑增加了冷杉（Abies fabri）根部萜類物質合成能力，提高白云杉（Picea glauca）萜類物質合成能力和相關表達量[6-7]；MeJA 途徑能明顯提高西加云杉（Picea sitchensis）莖中萜類物質合成能力[8]；SA 途徑可明顯提高擬南芥（Arabidopsis thaliana）的抗蟲能力[9]，超量表達萜類合成酶基因，提高亞麻萜類物質含量，并參與亞麻薺（Camelina sativa）GA途徑提高抗蟲性[10]。

馬尾松（Pinus massoniana）是我國重要的速生用材樹種。在有關馬尾松的相關研究中，馬尾松萜類化合物響應干旱脅迫，馬尾松體內多種萜類物質與松材線蟲脅迫表達呈正相關，萜類物質不同抗蟲性材料差異顯著[11-14]。課題組前期研究表明，外源激素處理對馬尾松揮發(fā)性萜類物質含量產生影響，但馬尾松PmFPP和PmGGPP基因是否受到激素和鈣離子信號結合調控還不清楚。本研究在已獲得的PmFPP和PmGGPP基因基礎上，開展生物信息學分析和外源信號物質處理對基因表達調控的研究，以期為探索馬尾松萜類合成途徑基因功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

植物材料為馬尾松0.5年生全同胞幼苗，苗木參照DB 45∕T 2384-2021[15]培育。選擇苗高、地徑基本一致，無損傷和病蟲害的苗木作為試驗材料。

1.2 試驗處理

設置11 個處理，配置75 mg∕L 脫落酸（Abscisic acid，ABA）、50 mg∕L 水楊酸、100 mg∕L MeJA 和150 mg∕L GA，5個處理為單獨激素溶液，5個處理為在激素溶液中分別加入100 mg∕LCaCl2溶液，1 個處理為100 mg∕LCaCl2溶液，以蒸餾水為對照（CK），每處理噴施200 mL 溶液。噴施前在溶液中加入3 滴1%吐溫-20。每天上午9 點噴施1 次，均勻噴施于苗木；連續(xù)處理5 天；停止處理后第1、3 和5 天采集同部位成熟針葉，每個處理采集6株，等量混合后放入液氮保存。

1.3 試驗方法

1.3.1 基因序列獲得

PmFPP和PmGGPP基因序列來自課題組前期開展馬尾松抗蟲[14]、花發(fā)育、側枝發(fā)育[16]和逆境脅迫獲得的轉錄組數(shù)據(jù)。收集相關基因序列和信息，通過NCBI 比對，確定基因cDNA 開放閱讀框核酸序列。

1.3.2 RNA提取，逆轉錄

采用天根公司（北京，中國）生產的多酚多糖植物RNA提取試劑盒提取所有材料的RNA；采用寶生物公司（大連，中國）M-MLV 逆轉錄酶，具體步驟參照說明書。RNA 提取和cDNA 逆轉錄完成后，進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，采用紫外分光光度計檢測濃度，再將所有樣品濃度稀釋至50 μg∕μL。

1.3.3 生物信息學分析

采用Expasy（https:∕∕www.expasy.org∕）在線軟件分析基因的亞細胞定位、等電點、蛋白分子量和二級結構，采用Geneious（https:∕∕www.geneious.com∕）軟件進行進化樹聚類，采用T-Coffee 軟件進行基因氨基酸序列比對，采用NCBI、Motif Scan 軟件對結構域進行分析，采用String（https:∕∕string-db.org∕cgi）進行蛋白互作預測，采用MEME（https:∕∕meme-suite.org∕meme∕）分析序列保守基序。

1.3.4 基因表達分析

采用Primer 5 軟件設計熒光定量引物，以PmC?YP基因作為內參[17]。PmCYPF：CAAGGGTTCGTC?GTTCCAC，PmCYPR：GGCAAACTTCTCGCCGTA；Pm?GGPPF:GCCAATGCCATCAATGAAGCTCTG，PmGG?PPR:AGCCAGAAGCGAATACCTCATTGC；PmFPPF:GTGCTTGGCTGGTGTATTGAATGG，PmFPPR:AAC?AAGGTTGTCCACGCCTA GTG。采用熒光定量PCR技術，對PmFPP和PmGGPP基因在MeJA、GA、ABA和SA等激素處理和激素與Ca2+共同處理下的表達進行分析。根據(jù)SYBR Premix Ex Taq II（Prefect real-time）TaKaRa試劑盒說明書進行熒光定量PCR體系構建和擴增（Light Cycle 480II PCR儀），3次生物學重復，根據(jù)2-ΔΔCt法計算相對表達量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 軟件作圖，采用SPSS 軟件進行方差分析并對基因表達量進行差異性檢驗。

2 結果與分析

2.1 生物信息學分析

PmFPP和PmGGPP基因分別編碼347和385個氨基酸，分子量分別為39.85 和42.18 kDa，等電點分別為5.08 和5.86，跨膜結構分別有2 和4 個，亞細胞分別定位于線粒體和葉綠體、質體。兩個基因均存在Ser、Thr 和Tyr 磷酸化位點，PmFPP 的Tyr 磷酸化位點較多，PmGGPP 只有1 個；兩個基因有共同的cdc2、CKII、DNAPK、PKA、PKC 和unsp 磷酸化酶結合位點，PmFPP 具有特有的EGFR，PmGGPP 具有特有的ATM、cdk5、CKI 和P38mapk 磷酸化酶結合位點。二級結構預測中，α-螺旋占比最高，其次為隨機卷曲，β-轉角占比最小。

PmFPP 和PmGGPP 基因結構域均含有聚戊烯合成酶特征1（95 ～ 109 和170 ～ 186 aa）、聚戊烯合成酶特征2（229 ～ 241 和303 ～ 315 aa）和十聚異戊二烯二磷酸合成酶（39～310和121～381 aa）；PmFPP具有細胞因子受體1 類家族特異性結構域（236 ～291 aa）和Pseudomurein-binding（假細胞質）重復結構域（181～191 aa）；PmGGPP 具有細菌胞外溶質結合蛋白（71 ～ 105 aa）和Big-1（bacterial Ig-like do?main 1）結構域（1～6 aa）。

表1 PmFPP和PmGGPP蛋白生物信息學分析Tab.1 Bioinformatics analysis of PmFPP and PmGGPP protein

2.2 聚類分析

通過NCBI 分別比對PmFPP和PmGGPP基因的同源基因，選取19 個物種構建進化樹（圖1）。結果表明，PmFPP基因核酸序列和氨基酸序列與火炬松（P. taeda）相似性最高，分別為98.37%和99%；PmGGPP基因核酸序列和氨基酸序列與挪威云杉相似性最高，分別為93.52%和100%。通過對PmFPP 和PmGGPP 序列進行保守基序分析，PmFPP的motif 4 含有保守區(qū)RXXS，motif 1 含有保守區(qū)FARM（DDxxD），motif 2 含有保守區(qū)SARM（DDxxD）；PmGGPP 的motif 1 含有保守區(qū)FARM（DDxxxxD）和CxxxC，motif 2含有保守區(qū)SARM（DDxxD）（圖2）。

圖1 馬尾松與其他物種FPP和GGPP基因進化樹分析Fig.1 Phylogenetic analysis of FPP and GGPP of P.massoniana and other plants

圖2 氨基酸序列比對Fig.2 Alignment of amino acid sequences

2.3 功能預測

將 PmFPP 與擬南芥同源蛋白 SQS1（AT4G34640.1）、AT1G77580（AT1G77580.2）和AT1G21810（AT1G21810.1），PmGGPP與擬南芥同源蛋白G4（AT3G51820.1）、GA1（AT4G02780.1）、GA2（AT1G79460.1）和TPS03（AT4G16740.1）進行蛋白互作網(wǎng)絡分析。結果表明，PmFPP 和PmGGPP 通過1個吡啶核苷酸二硫鍵氧化還原酶（AT1G74470.1）作為連接蛋白完成互作（圖3）。

圖3 PmFPP和PmGGPP蛋白三維結構和基因互作網(wǎng)絡分析Fig.3 Three-dimensional structures of PmFPP and PmGGPP protein and interaction network of genes

在互作網(wǎng)絡中，PmFPP（SQS1）能將presqualene diphosphate（PSPP）前體磷酸化轉化為2 個FPP，是甾醇生物合成的關鍵酶之一。PmGGPP（TPS03）是三環(huán)萜合酶，該基因轉錄水平增加對JA處理或脅迫的響應。GA1 在GA 途徑中催化GGPP 到二萜；GA2在GA 途徑將GGPP 轉化為copalyl pyrophosphate（CPP）；G4 具有葉綠素合酶活性，可執(zhí)行葉綠素（a和b）的酯化反應，這是葉綠素生物合成最后一步，可使GGPP 作為底物；GA3 是貝殼杉烯氧化酶，在GA合成中起關鍵作用。

PmGGPP（TPS03）未與其他蛋白直接互作，而是和編碼3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A 還原酶HMG1（AT1G76490.1）互作，在類異戊二烯生物合成的第一步中發(fā)揮作用，在葉片黑暗處理中表達被激活。

PmFPP 和PmGGPP 蛋白三級結構預測表明，PmFPP 與杜仲（Eucommia ulmoides）的FPS（7bux.1.

A）結構為模板，PmFPP 與模板的一致性為73.68%，GMQE 分值為0.80；以Mint heterotetrameric GPP（3krp.3）結構為模板，PmGGPP 與模板的一致性為70.07%，GMQE 分值為0.68，說明同源建模構建的蛋白三維結構是可靠的。PmFPP 具有中心疏水通道的二聚體結構，是萜類生物合成的關鍵，參與種子發(fā)育和成熟過程。薄荷（Mentha canadensis）GPPS的LSU 和SSU 分別負責催化和調控，與PmGGPP同源，共同作用形成香葉酰焦磷酸，是單萜類物質合成的前提。

2.4 基因表達分析

Ca2+處理的第1天和第5 天，PmFPP基因表達量顯著高于CK（P＜0.05），第3 天顯著低于CK（P＜0.05），總體提高了基因的表達量（圖4）。MeJA、GA和SA 處理從第3 天開始和ABA 處理的第5 天，PmFPP基因表達量顯著高于CK（P＜0.05）；激素+Ca2+處理后，MeJA 和GA 在第5 天、ABA 從第1 天開始及SA 從第3 天開始基因表達量顯著高于CK（P＜0.05）。激素和激素+Ca2+的處理在第3天和第5 天基因表達量顯著高于Ca2+處理（P＜0.05）。Ca2+和激素ABA能正向調控目的基因。

圖4 PmFPP基因在不同處理下的表達模式Fig.4 Expression of PmFPP gene under different treatments

Ca2+處理的PmGGPP基因表達量與CK 相比顯著下調（P＜0.05）（圖5）。在第5天，MeJA、GA、ABA和SA 處理的PmGGPP基因表達量均顯著高于CK（P＜0.05）；從第1天開始，所有激素處理的PmGGPP基因表達量均顯著高于Ca2+處理（P＜0.05）。除Me?JA+Ca2+處理在第5天PmGGPP基因表達量高于Me?JA 處理外，其他激素+ Ca2+處理的PmGGPP基因表達量均顯著低于激素處理（P＜0.05）。Ca2+可以降低目的基因表達；MeJA、GA、ABA 和SA 激素可以緩解Ca2+對目的基因的抑制，能正調控目的基因表達。

圖5 PmGGPP基因在不同處理下的表達模式Fig.5 Expression of PmGGPP gene under different treatments

3 討論與結論

本研究獲得編碼347 和385 個氨基酸的馬尾松萜類合成途徑關鍵酶PmFPP和PmGGPP基因，序列分析發(fā)現(xiàn)這兩個基因與其他物種，尤其是與針葉樹種具有高度相似性。PmFPP 具有2 個DDxxD 典型結構域，PmGGPP 具有DDxxxxD、CxxxC 和DDxxD 典型結構域，不同物種FPP和GGPP的典型結構域均高度保守，說明這兩個基因在進化過程中較為穩(wěn)定。DDxxD 結構域被認為是酶與底物的結合位點，是一類酶催化活性中心，在協(xié)調二價金屬離子和酶底物基團結合時起關鍵作用[18]。但PmFPP 兩個DDxxD 在結構上相互依賴，不能作為完全獨立的活性中心，萜類代謝途徑中的酶在轉錄水平上常呈相關性，這些酶的表達可能受同一個轉錄因子的調控，因此萜類代謝途徑中可能有轉錄因子存在[19-20]。

大部分FPP基因亞細胞定位于葉綠體，而PmF?PP定位于線粒體，可能是由于PmFPP 存在1 個62個氨基酸的RXXS 保守區(qū)，參與萜類化合物生物合成；PmGGPP 定位于質體，主要合成胡蘿卜素、赤霉素、ABA 和葉綠素等物質[21-24]。橡膠草（Taraxacumkoksaghyz）和人參（Panax ginseng）等FPP基因無跨膜結構[25-26]。本研究中，PmFPP 和PmGGPP 基因分別有2 和4 個跨膜結構，大多數(shù)裸子植物中的萜類合成酶家族不同于被子植物[22,27]。序列比較和系統(tǒng)發(fā)育構建也揭示裸子植物萜類合成酶起源關聯(lián)性比被子植物更為密切，裸子植物控制樹脂合成的萜類合成酶系統(tǒng)發(fā)育樹是一個獨立分支，本研究聚類和同源序列比對結果也進一步說明針葉樹在長期演化過程中形成了獨特的防御系統(tǒng)[26]。

本研究中，與CK 相比，PmFPP和PmGGPP分別在MeJA 處理的第3天和第5天表達量上升，MeJA能誘導植物中單萜和二萜合成酶轉錄水平表達增加，提高萜類合成酶活性，促進萜烯化合物積累[22]。MeJA 誘導2 天后FPP 基因才表達增加，誘導三萜含量增加[28]，并與萜烯類物質作為信號分子防御外界傷害[29]，與本研究對PmFPP功能預測相同。

SA 處理下，PmFPP和PmGGPP基因與對照相比，第1 天和第5 天表現(xiàn)出較高表達量；GA 處理提高了PmFPP和PmGGPP的表達量。GA處理對黃花蒿中倍半萜含量無顯著影響[30]，MYC2通過與JA 和GA 信號途徑的因子互作來整合外源和內源生長發(fā)育信號協(xié)調花中單萜和倍半萜的合成與揮發(fā)[31]，結合功能預測結果，推測GA 途徑調控PmGGPP影響二萜類物質的合成[32]。與對照和激素處理相比，Ca2+處理、激素與Ca2+處理的兩個基因表達量均下降。細胞外Ca2+螯合劑可以抑制萜類物質誘導下防御基因的表達[33]，Ca2+是否通過負調控激素信號途徑參與萜類合成途徑，還有待進一步研究。