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水楊酸誘導(dǎo)三七抗三七圓斑病的機(jī)理研究*

2022-01-24 03:39王慧玲李佳洲郭力維杜云龍何霞紅
關(guān)鍵詞:抗病性誘導(dǎo)活性

楊 寬,王慧玲,戴 蕾,李佳洲,羅 成,郭力維,杜云龍,何霞紅

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué),云南生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,云南 昆明 650201;2.西南林業(yè)大學(xué),云南 昆明 650244)

三七圓斑病由子囊菌門(Ascomycota)暗色菌科(Dematiaceae)菌刺孢屬(Mycocentrospora)槭菌刺孢[Mycocentrospora acerina(Hartig)Deighton]引起,該病于1993 年在云南文山首次被發(fā)現(xiàn)[1],是危害三七地上部的主要病害,若防治不及時(shí),極端年份發(fā)病率可達(dá)80.00%,甚至毀園,嚴(yán)重影響三七產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[2-3]。槭菌刺孢主要分布于歐洲和北美洲,寄主范圍廣,可寄生于槭樹科、十字花科和茄科等16 科植物。在中國可引起細(xì)辛葉枯病和三七圓斑病,均屬于毀滅性病害[4-6]。三七圓斑病主要集中在雨季發(fā)生,由于其喜低溫高濕且傳染性強(qiáng),雨季來臨時(shí),常造成大規(guī)模的流行和傳播[7-8],目前生產(chǎn)上仍以化學(xué)防治為主,常用的藥劑主要有戊唑醇、代森錳鋅和多抗霉素等[9-10]。然而,使用化學(xué)殺菌劑存在農(nóng)藥殘留、病原菌產(chǎn)生抗藥性以及環(huán)境污染等問題,因此,尋求一種綠色防控措施將是控制三七圓斑病的必要途徑。

植物的誘導(dǎo)抗病性是植物在外界物理因子(高溫和紫外線等)、化學(xué)因子(水楊酸和茉莉酮酸等)和生物因子(真菌、細(xì)菌和病毒等)刺激下產(chǎn)生抗病性的現(xiàn)象[11-13],且不影響其自身遺傳,因此可通過外源因子誘導(dǎo)植物自身免疫力,從而減少化學(xué)農(nóng)藥的使用[11],是一種綠色高效的植物病蟲害防治方法[12-17]。水楊酸(salicylic acid,SA)是植物抗病反應(yīng)的重要信號分子之一,植物體內(nèi)SA 的積累被認(rèn)為是抗病性提高的標(biāo)志。SA 不僅參與植物的過敏反應(yīng)和系統(tǒng)獲得抗性反應(yīng),也是病原物侵染植物后引起防衛(wèi)反應(yīng)提高信號傳遞過程中的重要組成成分[18]。SA 主要通過誘導(dǎo)植物防御相關(guān)酶活性、誘導(dǎo)病程相關(guān)蛋白合成以及抑制病原致病性酶活性等方式來提高植物抗病防御反應(yīng)[19-21]。高倩倩[22]研究表明:外源添加SA 可以通過提高植物體內(nèi)抗氧化酶活性、增強(qiáng)滲透調(diào)節(jié)能力和提高細(xì)胞活性氧清除能力來有效提高不結(jié)球白菜對根腫病的抗性。NURAMALEE 等[23]研究表明:SA 誘導(dǎo)后,橡膠樹的棕櫚疫霉病發(fā)病嚴(yán)重程度顯著降低41%,過氧化氫酶(CAT)和過氧化物酶(POD)活性顯著提高,HbCAT1、HbPAL和HbPR1j基因表達(dá)上調(diào),提高了橡膠樹的抗病性。

SA 誘導(dǎo)植物抗病性已有很多研究,但SA 在三七生長中的作用和誘導(dǎo)抗病性鮮有報(bào)道。本研究以三七為試驗(yàn)材料,以三七圓斑病為研究對象,開展SA 調(diào)控三七與槭菌刺孢相互作用的機(jī)制研究,明確SA 誘導(dǎo)三七抗圓斑病的機(jī)理,為防治三七圓斑病提供新途徑和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試植株

健康的一年生三七植株均采自云南農(nóng)業(yè)大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)教育科研基地;槭菌刺孢由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 供試試劑

水楊酸(SA)和二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma 公司;美國Omega 公司生產(chǎn)的真菌總DNA 提取試劑盒;蘇州科銘生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的過氧化氫試劑盒(微量法)、過氧化物酶試劑盒(微量法)、超氧化物岐化酶試劑盒(微量法)、苯丙氨酸解氨酶試劑盒(微量法)、丙二醛試劑盒(微量法)和脯氨酸試劑盒(微量法)。

1.2 方法

1.2.1 SA 對槭菌刺孢侵染三七葉片的影響

分別用濃度為0.1、0.5、1.0、2.0、4.0 和6.0 mmol/L 的SA 溶液噴灑健康三七植株,以葉片上液滴不滴落為宜,3 d 后噴灑槭菌刺孢孢子懸浮液于葉片上,套袋保濕;以含有等體積的DMSO 無菌水噴灑三七后接種孢子懸浮液為對照。分別于處理6 和18 h 后剪取大小為0.5 cm×0.5 cm 的葉片置于血清瓶中,加入乙醇乳酚脫色液3 mL,用注射器抽真空直至葉片完全沒入脫色液中,于室溫靜止72 h,直至葉綠素全部脫除。取出葉片,用50%乙醇漂洗2~3 次,用無菌水沖洗2~3 次,將沖洗干凈的葉片置于棉蘭染液中染色10 min,取出,用無菌水沖洗1 次,置于載玻片上,滴加50%甘油后蓋上蓋玻片保存,在徠卡顯微鏡下用可見光觀察,拍照,統(tǒng)計(jì)并計(jì)算分生孢子的萌發(fā)率、芽管分枝率及附著胞產(chǎn)生率。

1.2.2 SA 對三七抗圓斑病的誘導(dǎo)效果測定

配制0.1、0.5、1.0、2.0 和4.0 mmol/L 的SA溶液,用微孔濾膜(0.22 μm)過濾備用。選擇12 盆長勢一致的一年生健康三七苗,每個(gè)處理2 盆,分別用上述配制好的SA 溶液噴灑三七苗,以噴灑含等體積DMSO 的無菌水為對照。5 d 后用接種針挑取在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d 的圓斑病菌,并接種于三七葉片中間靠近葉脈處,每棵苗接種2 片葉片,套袋保濕,每天噴無菌水保濕,出現(xiàn)明顯病斑后測量病斑直徑,觀察發(fā)病情況。

1.2.3 SA 誘導(dǎo)三七抗圓斑病的生理生化機(jī)制

選擇40 盆長勢一致、生長1 年的健康三七苗,每盆種植7 株三七苗,隨機(jī)分成4 組,每組10 盆(即為1 個(gè)處理),設(shè)置以下4 個(gè)處理:①噴灑最佳濃度的SA 溶液;② 噴灑含DMSO 的無菌水;③只接種槭菌刺孢,每棵苗接種2 個(gè)葉片;④ 噴灑最佳濃度的SA 溶液5 d 后再接種槭菌刺孢,每棵苗接種2 個(gè)葉片;③和④接菌后套袋,每天噴灑無菌水保濕。分別于處理后1~7 d 剪取同一葉位的三七葉片,液氮速凍后于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

參照SIMA 等[24]的方法測定過氧化氫酶(CAT)活性;參照MARKKOLA 等[25]的方法測定過氧化物酶(POD)活性;超氧化物岐化酶(SOD)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性以及丙二醛(MDA)含量的測定均參照鄒芳斌等[26]的方法;脯氨酸(Pro)含量的測定參照曹廣黎[27]的方法。

1.2.4 SA 誘導(dǎo)三七抗圓斑病的基因表達(dá)

選擇20 盆長勢一致、生長1 年的健康三七苗,每盆種植7 株三七苗,隨機(jī)分成2 組,每組10 盆(即為1 個(gè)處理),設(shè)置以下2 個(gè)處理:①噴灑最佳濃度的SA 溶液,5 d 后接種槭菌刺孢,每棵苗接種2 個(gè)葉片;② 噴灑含DMSO 的無菌水,5 d 后接種槭菌刺孢,每棵苗接種2 個(gè)葉片。在噴灑SA 溶液和無菌水后的第3 和5 天分別進(jìn)行第1、2 次葉片采樣,在第2 次采樣結(jié)束后立即接種槭菌刺孢并套袋,每天噴灑無菌水保濕,在接種后2 d進(jìn)行第3 次采樣。3 次采樣均在同一時(shí)間進(jìn)行,采集的三七葉片用液氮速凍,-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(1)三七葉片RNA 的提取

三七葉片RNA 的提取采用普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的EastepTM總RNA提取試劑盒。

(2)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 測定基因的表達(dá)水平

①cDNA 合成:利用Fermentas 公司生產(chǎn)的RevertAidTMFirst-Strand cDNA synthesis kit 試劑盒將RNA 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 第1 鏈,試驗(yàn)方法參照試劑盒說明書進(jìn)行。

② 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 引物設(shè)計(jì):利用Primer Express 軟件(Applied Biosystems,F(xiàn)oster City,CA,USA)設(shè)計(jì)三七抗病基因PnPR10-1實(shí)時(shí)熒光定量PCR 引物。PCR 產(chǎn)物長度 200~250 bp,G+C 含量為 40%~60%,3′端不能連續(xù)有3 個(gè)G 或C,產(chǎn)物不能形成二級結(jié)構(gòu),正反向引物間均不能有連續(xù)的4 個(gè)互補(bǔ)堿基,引物長度一般為17~25 bp,退火溫度約60 ℃??共』騊nPR10-1引物序列為:PnPR10-1-F:5′-ATGGGTGTCCAAAAGACCGAAG-3′,PnPR10-1-R:5′-CCAAGAGTGACGAGCTTGACGG-3′;內(nèi)參基因Actin的引物序列為:Actin-F:5′-AGAGATTCCGTTGCCCAGAA-3′,Actin-R:5′-CAATTGATGGGCCAGACTCG-3′。引物合成委托北京擎科生物科技有限公司完成。

③實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測:利用Light Cycler?96 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀進(jìn)行。具體方法參照Roche 公司生產(chǎn)的FastStart Essential DNA Green Master 試劑盒說明書進(jìn)行,實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)體系為20 μL:模板cDNA 5 μL,前后引物各1 μL,Master Mix 10 μL,PCR 級純水3 μL。采用相對定量常用方法處理數(shù)據(jù),即2t-ΔΔC法。RT-PCR 流程如下:95℃預(yù)變性6 min;95℃變性10 s,60 ℃退火10 s,72 ℃延伸10 s,循環(huán)45 次;溶解曲線反應(yīng)條件為:95 ℃ 10 s,65 ℃1 min,97 ℃維持。

2 結(jié)果與分析

2.1 SA 處理對槭菌刺孢侵染的影響

由圖1、2 可知:在SA 處理過的三七葉片上噴灑分生孢子,6 h 后對照葉片表面的分生孢子開始萌發(fā),孢子萌發(fā)率為55.11%;用0.1、0.5、1.0 和2.0 mmol/L SA 處理的三七葉片表面分生孢子萌發(fā)率分別為26.45%、11.32%、8.90%和3.10%;而用4.0 和6.0 mmol/L SA 處理的三七葉片表面的分生孢子萌發(fā)率均為0,說明不同濃度的SA 處理三七葉片表面后,葉片表面的孢子萌發(fā)率會(huì)下降,且呈濃度效應(yīng)。18 h 后對照葉片和處理葉片表面分生孢子產(chǎn)生的芽管與6 h 產(chǎn)生的芽管相比明顯伸長,芽管數(shù)量增多,且部分芽管頂端產(chǎn)生了附著胞,對照葉片表面分生孢子萌發(fā)率為86.24%,芽管分枝率為83.33%,附著胞產(chǎn)生率為78.15%;用0.1、0.5、1.0、2.0、4.0 和6.0 mmol/L SA 處理的三七葉片表面分生孢子萌發(fā)率、芽管分枝率和附著胞產(chǎn)生率均隨著SA 濃度的增加而降低。

圖1 水楊酸(SA)處理三七植株后槭菌刺孢的分生孢子在三七葉片表面的萌發(fā)情況Fig.1 Germination of Mycocentrospora acerina on the leave surface of Panax notoginseng after sprayed by different concentrations of salicylic acid(SA)on the plant

圖2 水楊酸(SA)處理三七植株后對分生孢子萌發(fā)的抑制作用Fig.2 Inhibitory effects of salicylic acid(SA)on the germination of inoculum conidium of P.notoginseng

2.2 SA 對三七抗圓斑病的誘導(dǎo)效果

不同濃度SA 處理后,三七圓斑病的病斑直徑均顯著減?。≒<0.05)。接種7 d 后,對照組的病斑直徑為1.65 cm,0.1、0.5、1.0、2.0和4.0 mmol/L SA 處理后的病斑直徑分別為1.51、1.48、1.47、1.49 和1.49 cm,分別減小0.14、0.17、0.18、0.16 和0.16 cm。其中,1.0 mmol/L SA 處理后病斑直徑最小,說明SA 能誘導(dǎo)三七對圓斑病的抗性,且濃度為1.0 mmol/L 的SA 誘導(dǎo)效果最好。

2.3 SA 誘導(dǎo)三七抗圓斑病的生理生化機(jī)制

2.3.1 SA 對三七葉CAT 活性的影響

由圖3 可知:對照組采樣期內(nèi)CAT 活性無明顯變化;1.0 mmol/L SA 處理三七后,三七葉片中的CAT 活性與對照組相比明顯提高,處理第4 天CAT 活性最大,為1 031.22 U/g,是對照組的1.94 倍;接種槭菌刺孢的葉片中CAT 活性呈迅速上升趨勢,第4 天活性最高,為1 214.82 U/g,是對照組的2.28 倍,4 d 后CAT 活性迅速下降,第7 天活性為52.02 U/g,低于對照組;SA 處理5 d 后再接種槭菌刺孢的葉片,其第4 天的CAT 活性最高,為對照組的3.16 倍,且直到第7 天CAT 活性依然高于對照組。說明SA 處理能夠提高三七體內(nèi)過氧化氫酶的活性,清除病原物侵染時(shí)產(chǎn)生的活性氧,提高三七的抗病性。

2.3.2 SA 對三七葉POD 活性的影響

由圖3 可知:1.0 mmol/L SA 處理后,三七葉片內(nèi)的POD 活性明顯升高,在整個(gè)采樣期間均高于對照組,處理第5 天POD 活性最大,為8 000 U/g,是對照組的1.59 倍;對照組處理的三七葉片中POD 活性呈先緩慢上升后下降的趨勢,處理第5 天活性最大,為5 025 U/g;接種槭菌刺孢后,三七葉片內(nèi)的POD 活性有所升高,在第4 天酶活性最大,為6 408 U/g,是對照組的1.45 倍,但處理期間的POD 活性均低于SA 處理;經(jīng)SA 處理5 d 后再接菌的葉片,其POD 活性在整個(gè)采樣期間均高于對照組和只接菌處理,且在處理第4 天POD 活性最大,為8 241 U/g,是對照組的1.86 倍,是只接菌處理的1.29 倍。說明SA 處理能使三七葉片內(nèi)的POD 活性增強(qiáng),從而提高三七植株的抗病性。

2.3.3 SA 對三七葉SOD 活性的影響

由圖3 還可知:對照組處理在整個(gè)采樣期內(nèi)SOD 的活性無明顯變化。1 mmol/L SA 處理后,三七葉片中的SOD 活性變化呈現(xiàn)雙峰曲線且均高于對照組,分別在第3 天和第5 天達(dá)到最大值(258.45 和269.54 U/g);接種槭菌刺孢的葉片中SOD 活性先升高后下降,在處理第5 天SOD 活性最大,為300.59 U/g,是對照組的1.79 倍;經(jīng)SA 處理5 d 后再接菌的葉片中SOD 活性先升高后下降,在處理第5 天SOD 活性達(dá)到最大,為371.77 U/g,是對照組的2.21 倍,是只接菌處理的1.24 倍,且試驗(yàn)期間其SOD 活性均高于對照組和只接菌處理。說明SA 處理能提高SOD 活性,有利于抑制槭菌刺孢侵染導(dǎo)致的氧自由基增加帶來的傷害,從而提高三七對圓斑病的抗性。

圖3 不同處理三七葉片中部分生理指標(biāo)的變化Fig.3 Changes of some physiological indexes in P.notoginseng leaves of different treatments

2.3.4 SA 對三七葉PAL 活性的影響

由圖3 可知:1 mmol/L SA 處理后,三七葉片內(nèi)PAL 活性高于對照組,處理第6 天PAL 活性最高,為71.8 U/g,是對照組的1.35 倍,且處理第7 天的PAL 活性高于第1 天;只接種槭菌刺孢葉片中PAL 活性比對照組高,處理第2 天PAL 活性最高,為67.17 U/g,是對照組的1.48 倍,隨后PAL 活性下降,處理第7 天降到最低,為48.99 U/g,低于其他處理;經(jīng)SA 處理5 d 后再接菌的葉片中PAL 活性也高于對照組,處理3 d后PAL 活性高于只接菌處理,處理第5 天PAL 活性最大,為61.4 U/g,是對照組的1.41 倍。SA 處理后PAL 活性增強(qiáng)說明苯丙烷類代謝是三七抗三七圓斑病的代謝途徑之一,SA 處理能夠提高三七對圓斑病的抗性。

2.3.5 SA 對三七葉Pro 含量的影響

圖3 顯示:1 mmol/L SA 處理后,三七葉片中Pro 含量上升,處理第3 天Pro 含量最高,為156.8 μg/g,是對照組的1.52 倍,隨后Pro 含量開始緩慢下降,但下降速率沒有對照組快;接種槭菌刺孢的葉片Pro 含量較低,第4 天含量最高,為80.15 μg/g,但始終低于其他處理;經(jīng)SA 處理5 d 后再接菌的葉片Pro 含量比只接菌處理高。說明SA 處理能有效提高三七葉片的Pro 含量,從而誘導(dǎo)三七對圓斑病菌的侵染產(chǎn)生快速高效的反應(yīng)。

2.3.6 SA 對三七葉MDA 含量的影響

由圖3 還可知:1 mmol/L SA 處理后,三七葉片MDA 含量始終保持較低水平,且處理期間均低于對照組。只接種槭菌刺孢的葉片MDA含量升高,處理第4 天含量最高,為42.83 nmol/g,是對照組的1.39 倍,隨后下降,但一直保持在較高水平;經(jīng)SA 處理5 d 后再接菌的葉片中MDA 含量與對照組相比有所升高,但整體均低于只接菌處理。說明SA 處理能降低三七葉片中MDA 含量,有利于增加三七抗病性。

2.4 SA 誘導(dǎo)三七抗病基因PnPR10-1 的表達(dá)

由圖4 可知:SA 處理三七后,三七葉片中的PnPR10-1基因上調(diào)表達(dá)。SA 處理3 d 后,Pn-PR10-1基因的表達(dá)量為1.325,顯著高于對照組(0.994)(P<0.05);SA 處理5 d 后,PnPR10-1基因的表達(dá)量為1.166,高于對照組(1.082)(P>0.05);SA 處理5 d 后再接種槭菌刺孢2 d,PnPR10-1基因的表達(dá)量高于對照組(P>0.05),且低于SA 處理3 和5 d 后的表達(dá)量。因此,SA 能誘導(dǎo)早期三七葉片內(nèi)抗病基因PnPR10-1的表達(dá),從而誘導(dǎo)三七對圓斑病的抗性。

圖4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 分析PnPR10-1基因的相對表達(dá)水平Fig.4 Quantitative real-time PCR ayalysis for expression levels of the PnPR10-1

3 討論

槭菌刺孢是三七圓斑病的病原菌,主要危害三七地上部分,造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。SA 是一種重要的植物內(nèi)源激素,在植物生長、發(fā)育和抗逆誘導(dǎo)等方面具有重要的生理功能。本研究以三七為試材,施用外源SA 和接種三七圓斑病菌,探究SA 參與調(diào)控三七與槭菌刺孢相互作用的機(jī)制。結(jié)果表明:外源添加SA 顯著提高三七對圓斑病的抗性。李紅杰[28]的研究表明:外源噴施SA 可降低冬瓜枯萎病病情指數(shù),提高防治效果,以150 g/mL 處理效果最優(yōu),防治效果達(dá)到78.02%;常雪花等[29]研究了采前SA 處理對甜瓜采后病害及抗性相關(guān)酶和防衛(wèi)物質(zhì)誘導(dǎo),發(fā)現(xiàn)與對照相比,1.0 mmol/L SA 可以明顯推遲甜瓜發(fā)病時(shí)間,降低發(fā)病率和病情指數(shù);王錚等[30]比較不同濃度SA 對田間煙草抗病性的影響,結(jié)果表明:SA 誘導(dǎo)的抗性具有廣譜性,且防效隨著SA 濃度的增加而增加??梢?,SA 對不同植物誘導(dǎo)抗性的最佳濃度不同,但總體而言均表現(xiàn)出低濃度可以誘導(dǎo)植物的抗病性,并且對病原菌的生長沒有影響。本研究結(jié)果與以上研究結(jié)果相似,且發(fā)現(xiàn)1 mmol/L SA 處理三七的效果最好,可能是由于高濃度SA 對三七產(chǎn)生了毒害作用,具體原因有待進(jìn)一步探究。

植物感染病原菌后,體內(nèi)活性氧的代謝平衡受到破壞,過剩的活性氧可引發(fā)和加劇膜脂過氧化作用,細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞,代謝系統(tǒng)紊亂,嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致植物細(xì)胞死亡[31]。因此,植物自身擁有活性氧清除系統(tǒng),主要由SOD、CAT 和POD 等防御酶組成[32]。PAL 是植物苯丙烷類代謝途徑的關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶,可使L-苯丙氨酸加速形成反式肉桂酸,是抗菌物質(zhì)(木質(zhì)素、植保素、黃酮素類色素和酚類物質(zhì))合成途徑的重要限速酶[33]。陳亮等[31]研究表明:對西瓜單一接種枯萎病菌后,植株體內(nèi)細(xì)胞的SOD、POD、CAT 和PAL 活性增高,且其活性變化與西瓜抗病性密切相關(guān);侯茜等[34]研究了西瓜幼苗根系防御酶活性變化與枯萎病抗性的關(guān)系,表明POD、PAL 和CAT 活性與西瓜植株的抗病性呈正相關(guān);石亞莉等[35]研究了SA 處理后蘋果灰霉病發(fā)生情況及與抗病性相關(guān)指標(biāo)的變化,發(fā)現(xiàn)SA 處理能夠明顯提高果肉組織中防御酶(POD 和PAL)的活性。本研究中,三七葉片經(jīng)1 mmol/L SA 處理后,其SOD、POD、CAT 和PAL 活性均高于對照;SA 處理5 d 后再接菌的葉片SOD 和POD 活性均高于對照組和只接菌處理,CAT 活性在接種槭菌刺孢后第4 天高于對照和只接菌處理,PAL 活性在處理3 d 后高于只接菌處理,處理第5 天PAL 活性達(dá)到最大。這與前人的研究較為一致,說明SA 增加了三七的抗病性。

MDA 是膜脂過氧化的產(chǎn)物,與植物對病原體反應(yīng)有關(guān)的氧化應(yīng)激所造成的細(xì)胞損傷程度可以用膜脂過氧化產(chǎn)物來估計(jì),其含量代表細(xì)胞膜的損傷程度[36],所以MDA 常被用做植物受損的生理指標(biāo)。Pro 在脅迫條件下植物的滲透調(diào)節(jié)中發(fā)揮適應(yīng)性作用,與植物的抗逆性密切相關(guān)[37]。本研究表明:1 mmol/L SA 處理三七植株后,其葉片中MDA 含量與對照組相比下降,Pro 含量與對照組相比增加;SA+槭菌刺孢的處理與直接接種槭菌刺孢的處理相比,MDA 和Pro 含量也呈現(xiàn)同樣的規(guī)律。說明SA 處理能降低MDA 含量,從而減少對細(xì)胞膜的傷害,同時(shí)SA 處理能夠提高三七葉片中Pro 含量,與湯曉莉等[38]和石亞莉等[35]的研究結(jié)果一致。

PR-10 蛋白是植物受到各種生物和非生物脅迫后產(chǎn)生的一類病程相關(guān)蛋白,在植物生長發(fā)育階段和應(yīng)激外界逆境環(huán)境時(shí)發(fā)揮重要作用,PR-10基因幾乎可在所有植物器官中表達(dá),響應(yīng)病原體的入侵和感染[39]。唐美瓊等[40]人工接種三七根腐病病原菌后,PnPR10-1基因在三七根組織中的表達(dá)量顯著增加,并且PnPR10-1基因在三七葉和莖中表達(dá)量很高,因此推測該蛋白可能具有廣譜抗病性。本研究對SA 處理后的三七葉片進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 發(fā)現(xiàn):葉片中PnPR10-1基因表達(dá)量顯著高于對照,說明SA 處理有助于促進(jìn)三七葉片中PnPR10-1基因的表達(dá),從而誘導(dǎo)三七對圓斑病產(chǎn)生抗性。楊丹等[41]研究發(fā)現(xiàn):PnPR10-2基因?qū)θ吒〔【ょ牭毒‵usarium solani)和毀滅柱孢菌(Cylindrocarpon destructans)具有一定的抑制作用,推測該基因同樣參與三七抗根腐病的防御反應(yīng)。

4 結(jié)論

本研究利用外源添加SA 及人工接種圓斑病菌的方法,驗(yàn)證了SA 能顯著提高三七對圓斑病的抗性,還能誘導(dǎo)提高三七防御相關(guān)酶活性,有助于促進(jìn)三七葉片中PnPR10-1基因的表達(dá),且以1 mmol/L SA 處理的效果最佳。研究結(jié)果為SA 應(yīng)用于三七圓斑病的綠色防控奠定了基礎(chǔ),對于提升三七品質(zhì)和提高經(jīng)濟(jì)效益具有重要意義。

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