張美玲，趙肖梅，許德萬，李永忠 ，劉雅婷

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；3.文山學(xué)院 三七醫(yī)藥學(xué)院，云南 文山 663000）

番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt orthotospovirus，TSWV）是正番茄斑萎病毒屬（Orthotospovirus）的代表種[1]，于1915 年在澳大利亞被首次報道，隨后在美國、法國和意大利等國相繼被發(fā)現(xiàn)[2]。中國于20 世紀(jì)90 年代在四川省發(fā)現(xiàn)TSWV；于海芹等[3]于2014 年 2 月— 2018 年 7月在云南省采集到566 份疑似感染正番茄斑萎病毒屬的煙株、煙田周圍作物和田間雜草樣品，TSWV 檢出率為43.88%。TSWV 已從最初被發(fā)現(xiàn)的四川和云南向國內(nèi)其他地區(qū)快速擴散，目前已在遼寧、天津、安徽、福建、河南、海南、云南、貴州、四川、重慶、山西、甘肅、上海、北京、山東和青海等地被發(fā)現(xiàn)[4-5]。TSWV 可侵染辣椒、番茄、萵苣、芹菜、馬鈴薯、花生、煙草、菊花、鳶尾、洋桔梗和朱頂紅等多種農(nóng)作物和花卉[6]，造成巨大經(jīng)濟損失。其中，辣椒是中國重要的經(jīng)濟作物，據(jù)聯(lián)合國糧食和農(nóng)業(yè)組織（Food and Agriculture Organization of the United Nations，F(xiàn)AO）統(tǒng)計，2018 年全世界辣椒播種面積199.04 萬hm2，總產(chǎn)量3 677.15 萬t，中國辣椒播種面積和產(chǎn)量分別占38.7%和49.5%，是世界上辣椒種植面積最大的國家[7]，但TSWV 頻發(fā)給辣椒生產(chǎn)帶來了巨大損失，防治辣椒TSWV 具有重要意義。

與動物不同，在外界脅迫來臨時，植物不能改變自身的生存位置來躲避傷害，因此，植物進(jìn)化出一系列的防御反應(yīng)來應(yīng)對生物或非生物脅迫帶來的傷害。胼胝質(zhì)沉積是植物抵御外界傷害的反應(yīng)之一[8]。胼胝質(zhì)（callose）是一種由β-1,3 鍵結(jié)合的線性葡聚多糖，廣泛存在于高等植物中。通常情況下，它以細(xì)胞壁多糖的形式存在，是植物細(xì)胞壁以及細(xì)胞壁偶聯(lián)和附屬結(jié)構(gòu)的專有成分[9]；在特定的生長和分化階段，胼胝質(zhì)是特殊細(xì)胞壁或細(xì)胞壁相關(guān)結(jié)構(gòu)的組成部分[10]。胼胝質(zhì)可通過對植株胞間連絲進(jìn)行修飾，或與木質(zhì)素一起在細(xì)胞膜和細(xì)胞壁之間形成乳狀突起，以抑制病原體擴散，對病原體入侵產(chǎn)生免疫應(yīng)答[11]。丁旭[12]研究表明：脫落酸抑制劑氟啶草酮能促進(jìn)褐飛虱的取食行為，并抑制胼胝質(zhì)沉積。許有友[13]研究發(fā)現(xiàn)：脫落酸處理感、抗蟲品種水稻葉鞘后，胼胝質(zhì)主要沉積在木質(zhì)部，其次沉積于導(dǎo)管周圍；褐飛虱取食水稻汁液后，抗蟲品種水稻的表皮組織、維管束鞘和機械組織中出現(xiàn)胼胝質(zhì)，表明脫落酸增加了褐飛虱取食后抗蟲品種水稻中胼胝質(zhì)的沉積；脫落酸處理并接蟲后，胼胝質(zhì)沉積面積較不接蟲處理增加，表明脫落酸處理和褐飛虱取食可進(jìn)一步促進(jìn)抗蟲品種水稻胼胝質(zhì)沉積。當(dāng)泡桐叢枝病菌侵染泡桐時，篩管內(nèi)胼胝質(zhì)的積累對泡桐叢枝病菌的擴增和繁殖具有抵抗作用，因此，由泡桐叢枝病菌引發(fā)的篩管胼胝質(zhì)過量積累是抵御泡桐叢枝病菌擴增的重要原因[14]。為研究TSWV 與寄主植物辣椒互作時的防御反應(yīng)，以易感TSWV 的湘研十一號辣椒為試驗材料，研究TSWV 侵染辣椒后，葉片胼胝質(zhì)的沉積情況及超微細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化，以期為防治辣椒TSWV 提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗植物寄主：辣椒（Capsicum annuumL.）品種湘研十一號；病毒繁殖寄主：一點紅[Emilia sonchifolia（L.）DC]；番茄斑萎病毒（TSWV）毒源（JC-6）由本實驗室在一點紅上進(jìn)行傳代培育，并置于防蟲網(wǎng)中作為活體毒源。

1.2 病毒接種和RT-PCR 檢測及測序

用漂浮盤培育辣椒，在長出2 片真葉后移栽，在2～4 葉期進(jìn)行摩擦接種，試驗處理分為2 組：接種TSWV（TSWV 組）和接種緩沖液對照組（CK 組）。接種病毒21 d 后采集植株系統(tǒng)葉片，進(jìn)行RT-PCR 檢測。

運用Clone Assistant 1.0 在TSWV 的3 條RNA鏈上設(shè)計引物，分別為：TSWV-NP-F：ATGTYTAAGGTTAAGCTCACTAAG，TSWV-NP-R：TTAAGCAAGTTCTGTGAGTTTTGCC，750 bp；TSWV-Nsm1-F：TGGCAACGGGAAGCAAAATG，TSWV-Nsm1-R：TCTGCTTCTCACTGTTTCCCT，491 bp；TSWV-RdRp1-F：TTGCTGGGATGCCAATCACT，TSWV-RdRp1-R：TTTGTCGGCGATATGCTGGT，431 bp。應(yīng)用TransZol Plant（Trans-Gen Biotech，北京）試劑盒法提取植物總 RNA，然后選用PrimeScriptTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa，北京）試劑盒反轉(zhuǎn)獲得cDNA。PCR體系配置以及反應(yīng)條件：cDNA 1 μL，10 mmol/L上游引物 1 μL，10 mmol/L 下游引物1 μL，Prime STAR Max DNA Polymerase 10 μL，加ddH2O 至總量為20 μL；反應(yīng)程序：98 ℃，10 s；98 ℃20 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35 個循環(huán)；72 ℃10 min。通過1.2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，送PCR產(chǎn)物測序并通過NCBI-BLAST 比對，鑒定結(jié)果。

1.3 苯胺藍(lán)染色法檢測胼胝質(zhì)

于TSWV 接種后第1、3、7、14 和21 天采集上方系統(tǒng)葉片（對應(yīng)編號分別為T1、T2、T3、T4和T5），用FAA 固定液（福爾馬林—乙酸—乙醇混合液）固定，后于脫色液（V乙酸∶V乙醇=1∶3）中脫色至無色狀態(tài)，用150 mmol/L 的K2HPO4進(jìn)行漂洗，再于0.01%苯胺藍(lán)染液中染色，用掃描儀（Pannoramic MIDI）掃描后觀察胼胝質(zhì)，利用Image J 軟件計算胼胝質(zhì)的平均熒光強度。

1.4 透射電子顯微鏡觀察寄主細(xì)胞病理變化

于TSWV 接種后第1、3、7、14 和21 天采集上方系統(tǒng)葉片（對應(yīng)編號分別為T1、T2、T3、T4和T5），用戊二醛—鋨酸雙重固定，再依次用30%、50%、70%、90% 和100% 乙醇梯度脫水，脫水后將葉片修剪為1 mm×3 mm 的長方形，于環(huán)氧樹脂Epon812（SPI 公司）包埋劑中包埋，將樣品的超薄切片用醋酸鈾和檸檬酸鉛溶液進(jìn)行雙重染色，后在透射電子顯微鏡（JEOL TEM 1200EXⅡ型）80 kV 加速電壓下進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 RT-PCR 鑒定結(jié)果

TSWV 接種處理21 d 后對辣椒進(jìn)行RTPCR 檢測，PCR 產(chǎn)物電泳后的目標(biāo)條帶分別與預(yù)期片段大小一致（圖1），測序結(jié)果通過NCBIBLAST 比對發(fā)現(xiàn)，所擴增序列與TSWV 高度同源，相似值均達(dá)到95%以上，說明在辣椒上成功接種TSWV 病毒。

圖1 電泳檢測結(jié)果Fig.1 Results of electrophoresis detection

2.2 胼胝質(zhì)沉積觀察

由圖2、3 可知：TSWV 侵染辣椒后，第1 天胼胝質(zhì)主要沉積在葉脈篩管上，氣孔上也有少量胼胝質(zhì)累積；第3 天胼胝質(zhì)沉積數(shù)量持續(xù)增多，篩管、氣孔及葉邊緣均出現(xiàn)胼胝質(zhì)沉積；第7 天時，主要沉積于葉脈篩管處；到接種后第14 和21 天，胼胝質(zhì)沉積量呈上升趨勢，前一時期可在葉脈篩管、氣孔和表皮細(xì)胞壁中觀察到胼胝質(zhì)沉積，后一時期主要在葉脈篩管中觀察到胼胝質(zhì)。接種TSWV 后，5 個時期均有胼胝質(zhì)以點狀沉積于辣椒葉片，胼胝質(zhì)總體變化呈“N”字型。表明TSWV 侵染辣椒后，胼胝質(zhì)在氣孔、細(xì)胞間和葉脈篩管上均會出現(xiàn)沉積。

圖2 胼胝質(zhì)熒光圖Fig.2 Fluorescence of callose

2.3 透射電子顯微鏡觀察TSWV 侵染后寄主細(xì)胞病理變化

圖3 胼胝質(zhì)平均熒光強度表達(dá)量Fig.3 Average fluorescence intensity of callose

由圖4 可知：健康辣椒葉片葉綠體呈紡錘型，其中淀粉粒較多，基粒片層和基質(zhì)片層分布于整個葉綠體中且排列緊密；接種TSWV 后第1 天，葉綠體出現(xiàn)較多病毒粒子，且病毒粒子存在之處的片層被破壞，葉綠體外出現(xiàn)大小不一的囊泡；接種后第3 天，細(xì)胞死亡，葉綠體已失去生命活力，呈漁網(wǎng)狀懸浮于細(xì)胞中，胞內(nèi)存在較多囊泡結(jié)構(gòu)；接種后第7 天，細(xì)胞內(nèi)囊泡明顯增多，葉綠體外膜稍有溶解；接種后第14 天，病毒粒子主要靠近葉綠體膜分布，在淀粉粒周圍也觀察到病毒粒子且被病毒占據(jù)之處的片層結(jié)構(gòu)消失，葉綠體形狀改變，局部有空腔出現(xiàn)，基質(zhì)片層稀少；接種后第21 天，細(xì)胞出現(xiàn)質(zhì)壁分離，病毒粒子存在于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中，且葉綠體外出現(xiàn)囊泡結(jié)構(gòu)，但葉綠體中片層結(jié)構(gòu)完好。

圖4 接種TSWV 辣椒的透射電鏡圖Fig.4 Transmission electron micrograph of pepper inoculated with TSWV

3 討論

在感染部位早期有效地形成乳狀突，可幫助植物抵御病原菌及病毒的侵害[15]。本研究中，可以觀察到有大顆粒的胼胝質(zhì)熒光點，推測這是胼胝質(zhì)與木質(zhì)素結(jié)合形成的乳突。大豆花葉病毒侵染大豆后，胼胝質(zhì)出現(xiàn)的時間與大豆抗病級別相關(guān)，抗病性越強的品種在侵染點可越早發(fā)現(xiàn)胼胝質(zhì)的積累，在抗病性為0 級的大豆組合中，葉脈、葉柄和莖部可發(fā)現(xiàn)胼胝質(zhì)積累，而在抗病級別為5 的組合中，卻一直未能觀察到胼胝質(zhì)熒光[16]。在水稻條紋病毒脅迫下，抗病水稻葉片中胼胝質(zhì)熒光強度增強，且其大維管束中的維管束鞘內(nèi)層厚壁細(xì)胞、木質(zhì)部和韌皮部以及維管束鞘延伸的厚壁組織、小維管束、表皮細(xì)胞以及葉肉細(xì)胞均有較強的胼胝質(zhì)熒光出現(xiàn)[17]。而本研究中，接種TSWV 后24 h 觀察到胼胝質(zhì)在葉片、葉脈篩管和氣孔上積累，試驗開始的24 h 內(nèi)胼胝質(zhì)沉積是否已在葉片上產(chǎn)生值得進(jìn)一步探討。此外，本研究僅采葉片觀察胼胝質(zhì)沉積，并未采集根部和莖部樣本進(jìn)行研究，這些部位胼胝質(zhì)是否也發(fā)生沉積需要進(jìn)一步探討。

除胼胝質(zhì)沉積外，植物被TSWV 侵入后，葉綠體片層會變得疏松，葉綠體內(nèi)、外有囊泡出現(xiàn)，且線粒體增多或聚集，病毒粒子主要分布于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中[18-19]。在本研究中，葉綠體片層排列疏松甚至葉綠體解體，葉綠體外出現(xiàn)大量囊泡結(jié)構(gòu)，與前人研究結(jié)果一致，由此可確定，TSWV侵染植株后會對植物的葉綠體結(jié)構(gòu)造成嚴(yán)重傷害，推測這是染病植株葉片褪綠的主要原因。

本研究中也出現(xiàn)大量大小不一的囊泡。囊泡可分為胞外囊泡與胞內(nèi)囊泡，前者由細(xì)胞膜直接分泌或通過多囊泡體與細(xì)胞膜融合釋放產(chǎn)生，可選擇性包裹蛋白與核酸等物質(zhì)；后者由高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等內(nèi)膜系統(tǒng)產(chǎn)生，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是內(nèi)膜系統(tǒng)的核心部分，具有運輸細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的功能[20-22]。很多RNA 病毒通過侵染內(nèi)質(zhì)網(wǎng)來形成內(nèi)含體，這種內(nèi)含體是病毒復(fù)制中心和蛋白合成中心，供病毒完成復(fù)制并裝配成運動復(fù)合體；運動復(fù)合體從復(fù)制中心轉(zhuǎn)運到胞間連絲最直接、最有效的方法就是隨著內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜運動[22-23]。Orthotospovirus屬病毒的胞間運動方式有3 種，分別是單個病毒粒體沿內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜運動、包裹病毒粒體的囊泡沿內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜運動以及包裹病毒顆粒的囊泡與其他囊泡協(xié)同從細(xì)胞液泡的一端運動到另一端并向細(xì)胞壁附近聚集[24]。此外，研究已證實Orthotospovirus屬病毒編碼的運動蛋白NSm 為膜蛋白，可誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)的改變并產(chǎn)生與病毒相關(guān)的囊泡結(jié)構(gòu)[25-26]。本研究觀察到大量胞內(nèi)、外囊泡，進(jìn)一步證實Orthotospovirus屬病毒侵染植物后細(xì)胞內(nèi)會產(chǎn)生大量囊泡，但由于試驗并未開展進(jìn)一步的觀察，未在囊泡中發(fā)現(xiàn)病毒粒子，其運動方式還需進(jìn)一步研究。此外，本研究發(fā)現(xiàn)：病毒粒子除分布于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)外，還分布于葉綠體中靠近葉綠體膜和淀粉粒的位置，且病毒粒子聚集之處葉綠體片層消失，葉綠體內(nèi)出現(xiàn)空白區(qū)域等病變現(xiàn)象。這與同屬的番茄環(huán)紋斑點病毒（Tomato zonate spot virus，TZSV）侵染番茄葉片后葉綠體呈空泡化[27]相似。病毒粒子主要靠近細(xì)胞器膜或細(xì)胞膜分布，進(jìn)一步加大了病毒粒子是通過囊泡等膜結(jié)構(gòu)完成其擴散侵染的可能性。

4 結(jié)論

番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt orthotospovirus，TSWV）侵染其寄主植物辣椒后，植物啟動胼胝質(zhì)沉積反應(yīng)；其葉綠體結(jié)構(gòu)被破壞，出現(xiàn)大量囊泡，且TSWV 會破壞植物細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。