王慧敏，陳莉榮，任文杰，鄭春麗，黃怡雯，滕應(yīng)，張鐵軍

（1.內(nèi)蒙古科技大學(xué)能源與環(huán)境學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014010；2.中國(guó)科學(xué)院土壤環(huán)境與污染修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（南京土壤研究所），南京 210008）

多環(huán)芳烴（PAHs）是環(huán)境中普遍存在的一類(lèi)具有“三致”效應(yīng)的持久性有機(jī)污染物，對(duì)人體健康和生態(tài)系統(tǒng)具有極大威脅[1?2]。歐盟和美國(guó)環(huán)境保護(hù)署已把16 種PAHs 列為優(yōu)先控制污染物，其中苯并[a]芘等7種PAHs 也被我國(guó)列入“中國(guó)環(huán)境優(yōu)先污染物黑名單”[3?5]。近年來(lái)，隨著工業(yè)化和城市化的快速發(fā)展，我國(guó)土壤中PAHs 日趨積累[4，6?9]，據(jù)《全國(guó)土壤污染狀況調(diào)查公報(bào)》顯示，土壤中PAHs 的點(diǎn)位超標(biāo)率已達(dá)1.4%，因此PAHs 污染土壤修復(fù)已成為我國(guó)亟待解決的重要環(huán)境問(wèn)題。根際修復(fù)是PAHs 污染土壤綠色經(jīng)濟(jì)的修復(fù)策略[9?10]，但目前修復(fù)周期仍然較長(zhǎng)，因此尋找有效的強(qiáng)化措施、提高根際修復(fù)效率已成為拓展根際修復(fù)應(yīng)用的重要途徑。

碳納米管是一種徑向尺寸為納米量級(jí)的一維量子材料，由于其獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)而在環(huán)保和農(nóng)業(yè)等多個(gè)領(lǐng)域顯示出巨大的應(yīng)用潛力。碳納米管可通過(guò)疏水和π?π 相互作用強(qiáng)烈吸附PAHs[11?12]，從而可能會(huì)影響其在環(huán)境中的生物有效性和歸趨[13?14]。CUI等[15]發(fā)現(xiàn)添加單壁碳納米管（SWCNTs）可以顯著抑制沉積物中菲的生物有效性，進(jìn)而抑制菲的礦化。但目前關(guān)于SWCNTs 對(duì)土壤中有機(jī)污染物降解的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。碳納米管在一定濃度下還可以促進(jìn)植物發(fā)芽生長(zhǎng)，使根長(zhǎng)和側(cè)根數(shù)增加，同時(shí)還可以促進(jìn)植物光合作用[16?17]，增強(qiáng)植物的抗逆性[18]。YUAN 等[19]研究表明，多壁碳納米管（MWCNTs）也可以提高植物莖的伸長(zhǎng)。此外，碳納米管對(duì)土壤微生物群落還具有一定的調(diào)控作用。WU 等[20]發(fā)現(xiàn)SWCNTs可以通過(guò)改變土壤細(xì)菌群落，進(jìn)而影響碳氮循環(huán)。GE 等[21]的研究表明長(zhǎng)期添加MWCNTs 顯著降低了土壤細(xì)菌生物量，改變了土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。HAO 等[22]研究了MWCNTs 對(duì)種植水稻的土壤中細(xì)菌群落的影響，發(fā)現(xiàn)MWCNTs降低了變形菌門(mén)和硝化螺菌屬（Nitrospira）的相對(duì)豐度，并顯著改變了土壤細(xì)菌群落構(gòu)成，進(jìn)而影響土壤氮素循環(huán)。由此可見(jiàn)，碳納米管的這些特性均可能會(huì)影響PAHs 在植物根際的降解過(guò)程，但相關(guān)報(bào)道還比較有限。

本研究選擇南京市棲霞區(qū)某煤制氣廠污染場(chǎng)地土壤（粉砂壤土）作為供試土壤，以已報(bào)道的PAHs 污染土壤典型修復(fù)植物紫花苜蓿和SWCNTs 為供試材料，通過(guò)盆栽試驗(yàn)研究了SWCNTs對(duì)紫花苜蓿根際土壤中PAHs 降解及微生物群落的影響，為探究SW?CNTs在污染土壤根際修復(fù)中的應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 化學(xué)試劑

16種多環(huán)芳烴（PAHs）標(biāo)準(zhǔn)溶液購(gòu)自Sigma?Aldrich公司，乙腈和正己烷（色譜純）購(gòu)自Tedia 公司（Ohio，美國(guó)），二氯甲烷和環(huán)己烷（分析純）購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)，無(wú)水硫酸鈉（分析純）購(gòu)自西隴科學(xué)股份有限公司，硅膠（100～200目）購(gòu)自青島美高集團(tuán)有限公司。

1.2 供試土壤與單壁碳納米管

供試土壤采集南京市棲霞區(qū)某煤制氣廠污染場(chǎng)地。采集的表層土壤（0～20 cm）樣品，經(jīng)過(guò)自然避光風(fēng)干，均質(zhì)化并過(guò)2 mm篩以去除石頭、植物殘?bào)w和其他碎屑。根據(jù)聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織（FAO）世界土壤分類(lèi)系統(tǒng)，該土壤類(lèi)型屬于粉砂壤土。土壤基本理化性質(zhì)測(cè)定參考魯如坤[23]描述的方法，具體指標(biāo)如下：土壤pH 8.51、有機(jī)質(zhì)20.76 g·kg?1、全氮0.52 g·kg?1、全磷0.59 g·kg?1、全鉀16.36 g·kg?1、堿解氮45.33 mg·kg?1、速效磷8.29 mg·kg?1、速效鉀174.67 mg·kg?1、銨態(tài)氮2.50 mg·kg?1、硝態(tài)氮0.77 mg·kg?1、陽(yáng)離子交換量18.48 cmol·kg?1。土壤中PAHs 總量為344.48 mg·kg?1，其中包括芴1.68 mg·kg?1、菲34.13 mg·kg?1、蒽1.88 mg·kg?1、熒蒽61.51 mg·kg?1、芘89.99 mg·kg?1、苯并[a]蒽29.82 mg·kg?123.44 mg·kg?1、苯并[b]熒蒽25.86 mg·kg?1、苯并[k]熒蒽13.64 mg·kg?1、苯并[a]芘33.32 mg·kg?1、二苯并[a，h]蒽2.12 mg·kg?1、苯并[g，h，i]苝27.09 mg·kg?1。

SWCNTs 購(gòu)自深圳市國(guó)恒啟航科技有限公司，分別采用掃描電子顯微鏡（SEM）（Quanta FEG 250，F(xiàn)EI，Hillsboro，美國(guó)）、透射電子顯微鏡（TEM）（FEI Tech?nai，F(xiàn)20，美國(guó)）和比表面積分析儀（BET）（V?Sorb 2800P，Gold APP Instruments Co.，北京，中國(guó)）對(duì)SW?CNTs 的形貌、結(jié)構(gòu)和比表面積進(jìn)行表征；通過(guò)拉曼（Raman）光譜儀（Renishaw 100，新加坡）評(píng)估SW?CNTs 的缺陷程度；通過(guò)傅里葉變換紅外光譜（FTIR）（Nicolet 380，Thermo Fisher Scientific，Waltham，美國(guó)）和X 射線光電子能譜（XPS）（ESCALAB 250Xi spec?trometer，Thermo Scientific，美國(guó)）分析SWCNTs 的表面官能團(tuán)、元素組成及含量。

1.3 紫花苜蓿盆栽試驗(yàn)

稱(chēng)600 g 風(fēng)干土于花盆中，每千克土壤中施加尿素0.214 5 g、Ca（H2PO4）2·H2O 0.284 6 g和K2SO40.187 6 g。設(shè)置4 個(gè)不同SWCNTs 濃度的處理組：0（對(duì)照組）、0.1、0.5、5 g·kg?1，SWCNTs以固體粉末形式加入。紫花苜蓿種子購(gòu)于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，種子先用0.5%的次氯酸鈉溶液消毒10 min，再用95%的酒精溶液殺菌10 min，然后用無(wú)菌水連續(xù)沖洗5 次，最后放入盛有無(wú)菌水的燒杯中浸泡2 h，將浸泡后的種子均勻放于鋪有濕潤(rùn)濾紙的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，并于30 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中催芽24 h 后選取籽粒飽滿的種子均勻播種于花盆中，10 d 后將每盆內(nèi)幼苗間苗到40 株。所有植株置于光照培養(yǎng)室中培養(yǎng)，白天（16 h）溫度為25～30 ℃，夜晚（8 h）溫度為23～25 ℃，每日早晚補(bǔ)充水分，以維持土壤水分為田間持水量的60%，盆栽在光照室中隨機(jī)排位，并間歇性輪換，保證生長(zhǎng)條件一致。每個(gè)處理3 個(gè)重復(fù)，種植70 d 后收獲。用去離子水將紫花苜蓿清洗干凈后用濾紙吸干，測(cè)定其株高、根長(zhǎng)、鮮質(zhì)量。采用四分法取土壤樣品，其中一部分新鮮土壤樣品存放于?20 ℃冰箱中用來(lái)分析微生物群落多樣性，其余土壤冷凍干燥，研磨混勻過(guò)60 目篩后保存于4 ℃冷庫(kù)中，用于測(cè)定土壤中PAHs 含量及土壤的理化性質(zhì)。土壤理化性質(zhì)的測(cè)定參考魯如坤[23]描述的方法，具體包括：土壤pH、總氮、總磷、總鉀、有機(jī)質(zhì)、堿解氮、速效鉀、速效磷、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮、可溶性有機(jī)碳（DOC）和陽(yáng)離子交換量（CEC）等。

1.4 土壤中PAHs含量的測(cè)定

土壤中PAHs 含量的測(cè)定方法參考MAO 等[24]的文章并稍作修改。凍干的土樣通過(guò)60 目篩以均質(zhì)化，然后與無(wú)水硫酸鈉按1∶1 混勻后置于索氏提取管中，量取70 mL 二氯甲烷于茄型瓶中，在54 ℃下連續(xù)提取24 h。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將萃取液濃縮至干，再加入環(huán)己烷（2.0 mL）對(duì)茄形瓶中的物質(zhì)進(jìn)行溶解。采用硅膠柱凈化溶液（0.5 mL），使用正己烷?二氯甲烷混合液（1∶1，V/V）洗滌，收集洗脫液于刻度試管中，用氮?dú)庀却抵? mL，再用乙腈定容至2 mL，重復(fù)該操作3次后過(guò)0.22μm 有機(jī)相濾膜，轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶。采用日本島津高效液相色譜（HPLC）儀測(cè)定溶液中PAHs 濃度，具體設(shè)置條件參考REN等[25]的文章。采用外標(biāo)法定量（R2＞0.999），該方法測(cè)得土壤中PAHs 的加標(biāo)回收率為80.4%～98.2%。

1.5 土壤微生物群落分析

采用FastDNA?Spin Kit for Soil（MP Bio，美國(guó)）試劑盒提取土壤DNA。稱(chēng)取0.5 g 土壤樣品，按說(shuō)明書(shū)的提 取步驟進(jìn)行。用Nanodrop?ND?1000 UV?Vis Spectrophotometer（NanoDrop Technologies，Wilming?ton，DE）檢測(cè)核酸質(zhì)量和純度。將DNA樣品置于?80 ℃冰箱備用。

高通量測(cè)序在廣州美格基因科技有限公司進(jìn)行，對(duì)16S rRNA基因的V5～V7區(qū)進(jìn)行測(cè)序。前端引物序列為AACMGGATTAGATACCCKG，后端引物序列為ACGTCATCCCCACCTTC[26]。利用Quantitative Insights Into Microbial Ecology（QIIME）平臺(tái)對(duì)測(cè)序得到的Fastq數(shù)據(jù)進(jìn)行處理[27]。利用Trimmomatic軟件分別對(duì)雙端的Reads 數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量過(guò)濾[28]。同時(shí)，利用Mothur軟件去除barcode和引物得到質(zhì)控后的paired?end clean reads[29]，使用Usearch軟件得到歸一化（次抽樣）OTU 表，用于后續(xù)數(shù)據(jù)分析[30]。計(jì)算原核生物群落在OTU 水平的α 多樣性指數(shù)（香農(nóng)指數(shù)和Chao 指數(shù)）。基于Bray?Curtis，采用非度量多維尺度法（NMDS）對(duì)β 多樣性進(jìn)行分析。采用Student′st?test檢測(cè)不同類(lèi)群間豐度具有顯著差異的物種，挑選相對(duì)豐度＞0.1%的顯著差異菌屬繪制熱圖。

采用熒光定量PCR方法，對(duì)16S rRNA和PAHs降解基因PAH?RHDα GN 和PAH?RHDα GP 進(jìn)行定量測(cè)定[1]。16S rRNA 和PAH?RHDα 引物序列（見(jiàn)表1）。熒光定量PCR反應(yīng)體系為10μL SYBR Premix Ex Taq（TaKaRa），0.4 μL 的前后引物（10 μmol·L?1），1.0 μL DNA 模板，加入無(wú)菌水補(bǔ)足至20μL。熒光定量PCR時(shí)，以無(wú)菌水代替模板DNA作為陰性對(duì)照。

表1 熒光定量PCR使用的引物序列Table 1 Primer sequences used in real?time PCR

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)為3 個(gè)重復(fù)的平均值，誤差棒表示標(biāo)準(zhǔn)差。采用SPSS 26.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用單因素方差分析分析不同處理之間的顯著差異（P＜0.05），并使用Origin 2019 軟件繪圖。基于Spearman 相關(guān)性分析方法分析土壤中5環(huán)、6環(huán)PAHs殘留率與土壤中細(xì)菌群落相對(duì)豐度的相關(guān)性。

2 結(jié)果與討論

2.1 SWCNTs的表征

通過(guò)BET 測(cè)定，得知SWCNTs 的比表面積為201.4 m2·g?1。圖1 所示為SWCNTs 的SEM、TEM、FT?IR、Raman 和XPS 表征圖。通過(guò)SEM 圖可以直觀看出，SWCNTs 是一種呈管狀結(jié)構(gòu)的材料，聚集且相互纏繞。由TEM 圖可知，SWCNTs的基本結(jié)構(gòu)是單根納米碳管，管壁較薄，其內(nèi)徑4～10 nm，外徑6～14 nm，其中部分納米碳管相互聚集纏繞形成納米碳管束。Ra?man 光譜是一種表征碳納米材料表面晶體結(jié)構(gòu)有序程度的重要手段。SWCNTs 材料表面會(huì)在1 360 cm?1和1 590 cm?1附近出現(xiàn)兩個(gè)特征振動(dòng)峰，分別為D 峰和G峰，D峰是非晶態(tài)碳原子的懸鍵振動(dòng)，G峰是二維六邊形晶格sp2雜化碳原子的E2g振動(dòng)，D 峰和G 峰強(qiáng)度比值（ID/IG）表示碳納米管石墨化程度，其值越低，表明石墨化程度越高[31]。如圖1c所示，SWCNTs 的ID/IG為1.24。采用FTIR 對(duì)SWCNTs 的表面官能團(tuán)進(jìn)行定性分析（圖1d），發(fā)現(xiàn)SWCNTs 在3 463 cm?1處有明顯的吸收峰，這是O—H 鍵的伸縮振動(dòng)，2 922 cm?1和2 853 cm?1處為飽和烴C—H 特征峰，1 697 cm?1處為羧酸或酮中鍵的對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)峰，1 033 cm?1和1 385 cm?1處是羧基中C—O 的特征吸收峰及C—H面內(nèi)彎曲振動(dòng)，1 617 cm?1處出現(xiàn)的吸收峰則是SWCNTs 的鍵的特征峰，這些特征峰說(shuō)明SWCNTs 中含有羧基[32?35]。采用XPS 對(duì)SWCNTs 的元素組成和基團(tuán)進(jìn)行分析（圖1e），發(fā)現(xiàn)SWCNTs中主要含有C 元素（92.50%）和O 元素（6.65%），C 1s 的寬譜出現(xiàn)在286 eV 處，O 1s 的寬譜出現(xiàn)在533 eV 處。C 1s?XPS 峰中包含SWCNTs 石墨結(jié)構(gòu)的C—C 峰、羥基和醚的C—O峰、醛醌酮的＞峰和羧基峰，它們分 別出 現(xiàn)284.8、286.2、287.8 eV 和289.2 eV 處[32，36]。O 1s?XPS 峰可分解為3 類(lèi)表面含O 物種，即、C—OH 和C—O—C，其對(duì)應(yīng)結(jié)合能分別為531.0，532.8 eV和535.1 eV，這與FTIR得出的結(jié)果基本一致。

2.2 SWCNTs對(duì)紫花苜蓿根際降解PAHs的影響

如圖2 所示，添加SWCNTs 在一定程度上抑制了土壤中PAHs 的去除，并且隨著SWCNTs 添加量的增加，抑制程度逐漸增強(qiáng)。當(dāng)SWCNTs 的添加量為0.5 g·kg?1和5 g·kg?1時(shí)，經(jīng)過(guò)70 d的培養(yǎng)，土壤中PAHs的濃度從原始土壤的344.48 mg·kg?1降低到153.22 mg·kg?1和165.46 mg·kg?1，去除率分別為55.52% 和51.97%，相比于無(wú)添加的對(duì)照組（58.95%）顯著降低了3.43 個(gè)和6.98 個(gè)百分點(diǎn)（P＜0.05）。當(dāng)SWCNTs 的添加量為0.1 g·kg?1時(shí)，土壤中PAHs 的殘留量降低到146.24 mg·kg?1，雖仍高于對(duì)照（141.40 mg·kg?1）處理，但與對(duì)照處理無(wú)顯著差異。

供試土壤中PAHs 主要為高分子量PAHs，4 環(huán)和5 環(huán)、6 環(huán)分別占總量的59.44%和29.62%。培養(yǎng)70 d后，添加SWCNTs對(duì)3環(huán)和4環(huán)PAHs的去除無(wú)顯著影響，但顯著抑制了5 環(huán)、6 環(huán)PAHs 的去除（圖2b），尤其當(dāng)SWCNTs 添加量為5 g·kg?1時(shí)，抑制作用最強(qiáng)。培養(yǎng)70 d 后，土壤中3 環(huán)和4 環(huán)PAHs 的殘留率分別在35.24%和46.55%以下，對(duì)于5 環(huán)、6 環(huán)PAHs，當(dāng)添加SWCNTs時(shí)，其殘留率相比于僅種植紫花苜蓿的對(duì)照（37.47%）顯著提高了8.68～18.73 個(gè)百分點(diǎn)（P＜0.05）。此外，3 環(huán)PAHs 更易被降解，殘留率更低（29.58%～35.24%）。SWCNTs 對(duì)土壤中高分子量PAHs 去除的抑制作用，一方面可能是因?yàn)橄啾扔诘头肿恿縋AHs，高分子量PAHs 具有更強(qiáng)的疏水性，更容易被碳納米材料吸附[37]，從而降低土壤中高分子量PAHs的生物可利用性，抑制微生物對(duì)高分子量PAHs的獲取[4]，例如，SHRESTHA 等[13]發(fā)現(xiàn)添加碳納米管可以顯著降低土壤中PAHs 及其他有機(jī)污染物的生物可利用性。另一方面可能是因?yàn)樘砑覵WCNTs 改變了土壤微生物群落組成，抑制了相關(guān)PAHs 降解微生物的相對(duì)豐度[20]。

2.3 SWCNTs對(duì)紫花苜蓿生長(zhǎng)的影響

碳納米材料因其在調(diào)控植物生長(zhǎng)方面的有效作用而受到生物技術(shù)專(zhuān)家的廣泛關(guān)注[18]。本研究通過(guò)測(cè)量植物的株高、根長(zhǎng)并稱(chēng)取其地上部及根部鮮質(zhì)量，發(fā)現(xiàn)添加SWCNTs 對(duì)紫花苜蓿的生長(zhǎng)并未呈現(xiàn)出毒害效應(yīng)，相反，在一定濃度下對(duì)紫花苜蓿的地上部或根部生長(zhǎng)還具有一定的促進(jìn)作用（圖3）。當(dāng)SWCNTs的添加量為0.1 g·kg?1時(shí)，紫花苜蓿的株高與對(duì)照相比提高了19.62%（P＜0.05），但隨著添加量繼續(xù)增大，其對(duì)紫花苜蓿株高的影響不顯著；當(dāng)SW?CNTs 的添加量為5 g·kg?1時(shí)，顯著促進(jìn)了紫花苜蓿的根長(zhǎng)、地上部鮮質(zhì)量和根鮮質(zhì)量（P＜0.05），與對(duì)照相比分別增加了21.44%、49.13%和100.00%（圖3）。也有研究報(bào)道添加一定濃度的碳納米管可以顯著促進(jìn)紫花苜蓿根部伸長(zhǎng)[38]，認(rèn)為紫花苜蓿可以將碳納米管感知為脅迫因子，從而改變它們的基因表達(dá)并激活它們的生長(zhǎng)，研究也表明SWCNTs 對(duì)土壤中PAHs 去除的抑制效應(yīng)與其對(duì)植物生長(zhǎng)的調(diào)控作用關(guān)系較小。

2.4 SWCNTs對(duì)土壤理化性質(zhì)的影響

土壤中大量元素的供給，如氮和磷含量的提高可以增加異養(yǎng)微生物菌群的數(shù)量，從而促進(jìn)對(duì)PAHs的生物降解[39?40]。本研究發(fā)現(xiàn)添加SWCNTs使部分理化指標(biāo)發(fā)生顯著變化，且不同濃度SWCNTs對(duì)土壤理化指標(biāo)的影響不同。如圖4 所示，相比于對(duì)照，當(dāng)SWCNTs 的添加量為0.1 g·kg?1時(shí)，土壤中pH 和全氮含量顯著降低，全鉀、速效磷、速效鉀、銨態(tài)氮和硝態(tài)氮的含量顯著升高（P＜0.05）；當(dāng)SWCNTs 的添加量為0.5 g·kg?1時(shí)，土壤中pH 顯著降低（P＜0.05），總鉀、速效磷、速效鉀、氨氮和DOC 含量顯著升高（P＜0.05）；當(dāng)SWCNTs 的添加量為5 g·kg?1時(shí)，土壤中總氮含量顯著降低（P＜0.05），總鉀、有機(jī)質(zhì)、速效磷、速效鉀、氨氮和DOC含量顯著升高（P＜0.05）。

土壤中5環(huán)、6環(huán)PAHs的去除率降低可能是因?yàn)镾WCNTs 導(dǎo)致土壤中全氮含量降低[41]。有研究表明碳、氮和磷的物質(zhì)的量之比、氮素形態(tài)、pH 等因素都可能影響PAHs 的消減[42?43]。關(guān)于SWCNTs 導(dǎo)致的土壤理化性質(zhì)的變化與PAHs 降解的關(guān)系還需進(jìn)一步研究。

2.5 SWCNTs 對(duì)土壤細(xì)菌生物量、功能基因和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

微生物降解被認(rèn)為是土壤中PAHs 消減的主要途徑[44]。本研究采用熒光定量PCR（qPCR）測(cè)定了培養(yǎng)70 d 后不同處理下總細(xì)菌（16S rRNA 基因）和PAHs 環(huán)羥基化雙加氧酶（PAH?RHDα）GP 和GN 基因的表達(dá)量，結(jié)果如圖5a～圖5c 所示。添加SWCNTs時(shí)，16S rRNA、PAH?RHDα GP 和PAH?RHDα GN 的基因表達(dá)量相比于對(duì)照均無(wú)顯著差異，表明添加SWCNTs 并未影響土壤中細(xì)菌生物量以及PAHs降解功能基因豐度，這與目前大多數(shù)研究報(bào)道有一定區(qū)別。已有研究表明，添加SWCNTs可以顯著降低土壤酶活性和細(xì)菌生物量[45]。同樣，CHUNG等[46]的研究也表明，添加一定濃度的碳納米管可以降低土壤中的大部分酶活性和總體細(xì)菌生物量。這種差異可能是由于已報(bào)道研究中采用的SWCNTs與本研究供試SWCNTs的制備方法不同，從而導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)和表面組成不同[20，47]。

為了進(jìn)一步探究SWCNTs 對(duì)土壤中細(xì)菌群落的影響，本研究通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)，在OTU 水平采用Chao 指數(shù)和Shannon 指數(shù)評(píng)估了SWCNTs 對(duì)細(xì)菌豐富度和多樣性的影響。如圖5d 和圖5e 所示，SWCNTs 對(duì)土壤細(xì)菌群落的豐富度和多樣性無(wú)顯著影響，這可能是由于細(xì)菌群落對(duì)碳納米材料具有一定的抗逆性，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)菌群落受SWCNTs的影響逐漸減弱，直至恢復(fù)。RODRIGUES 等[48]的研究表明，在培養(yǎng)3 d 時(shí)SWCNTs 對(duì)土壤細(xì)菌群落產(chǎn)生的顯著影響在14 d 后消失。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，石墨烯在培養(yǎng)4 d時(shí)能顯著促進(jìn)土壤細(xì)菌生物量，但在21 d 后又恢復(fù)到對(duì)照水平[47]?；贐ray?Curtis距離的NMDS 排序?qū)Ζ?多樣性進(jìn)行分析（圖5f），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，每個(gè)處理的平行樣本都能夠較好地團(tuán)聚在一起，且隨著SWCNTs 添加量增加，各處理與對(duì)照的距離越來(lái)越遠(yuǎn)（stress=0.032），但在統(tǒng)計(jì)學(xué)上不存在顯著差異（P＞0.05）。土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化與土壤類(lèi)型、碳納米管類(lèi)型及濃度有關(guān)。SHRESTHA 等[13]的研究發(fā)現(xiàn)，在砂質(zhì)黏壤土中添加MWCNTs 對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)無(wú)顯著影響，但在砂質(zhì)壤土中添加高濃度的MWCNTs可以顯著改變土壤微生物群落的結(jié)構(gòu)。

2.6 SWCNTs對(duì)土壤微生物群落組成的影響

通過(guò)對(duì)土壤微生物群落更加細(xì)致的分析，發(fā)現(xiàn)添加SWCNTs 改變了土壤中一些門(mén)類(lèi)和屬類(lèi)微生物的相對(duì)豐度，但主要的門(mén)類(lèi)和屬類(lèi)組成并未發(fā)生改變。如圖6a 所示，在門(mén)水平上，對(duì)照組中相對(duì)豐度較高的微生物類(lèi)群主要包括變形菌門(mén)（Proteobacteria，59.72%）、放線菌門(mén)（Actinobacteria，15.00%）、髕骨細(xì)菌門(mén)（Patescibacteria，12.51%）、酸桿菌門(mén)（Acidobacte?ria，3.54%）和綠彎菌門(mén)（Chloroflexi，3.49%）。當(dāng)添加SWCNTs 時(shí)，變形菌門(mén)的相對(duì)豐度隨著SWCNTs 添加量的升高逐漸降低，各處理相比于對(duì)照降低了1.99%～13.53%，已有報(bào)道表明變形菌門(mén)廣泛存在于PAHs污染土壤中，被認(rèn)為是具有菲、芘以及苯并[a]芘降解潛力的主要微生物門(mén)類(lèi)[49?51]。

進(jìn)一步比較各處理中微生物群落在屬水平上的變化，如圖6b 和圖7 所示。從圖6b 可以看出，對(duì)照土壤中相對(duì)豐度較高的微生物屬類(lèi)主要包括Ramli?bacter（12.11%）、Lysobacter（6.62%）和Pseudarthrobac?ter（3.33%）等。當(dāng)添加SWCNTs 時(shí)，不同添加量處理的土壤中Ramlibacter的相對(duì)豐度較對(duì)照相比均有所降低，降低了2.67%～3.08%，而Pseudarthrobacter的相對(duì)豐度較對(duì)照提高了1.43%～5.76%，此外，當(dāng)添加0.1 g·kg?1和0.5 g·kg?1SWCNTs 時(shí)，Lysobacter的相對(duì)豐度分別提高了2.24%和1.83%，而當(dāng)SWCNTs 添加量為5 g·kg?1時(shí)，該屬類(lèi)微生物的相對(duì)豐度降低了0.13%。Lysobacter在油田和PAHs 污染的土壤中經(jīng)常被發(fā)現(xiàn)，且其相對(duì)豐度變化直接影響著PAHs 的降解[52?53]。多項(xiàng)研究已經(jīng)證實(shí)Lysobacter可以促進(jìn)碳轉(zhuǎn)化和固氮過(guò)程，從而增強(qiáng)PAHs的生物修復(fù)作用[54?55]。

為了更加直觀地比較各微生物屬的變化，采用相對(duì)豐度＞0.1%且具有顯著差異（P＜0.05）的菌屬繪制熱圖，如圖7 所示。當(dāng)SWCNTs 的添加量為0.1 g·kg?1時(shí)，土壤中受SWCNTs 影響的顯著差異菌屬有7 個(gè)（富集6 個(gè)，抑制1 個(gè)）；當(dāng)SWCNTs 的添加量為0.5 g·kg?1和5 g·kg?1時(shí)，分別有4 個(gè)（富集3 個(gè)，抑制1 個(gè)）和11個(gè)（富集4個(gè)，抑制7個(gè)），表明隨著SWCNTs添加量的增加，其對(duì)土壤細(xì)菌菌屬種類(lèi)及豐度的抑制作用增強(qiáng)。如Phenylobacterium、Reyranella和Brevundimonas的相對(duì)豐度在SWCNTs 添加量為0.1 g·kg?1和0.5 g·kg?1的處理無(wú)顯著變化，而在添加量為5 g·kg?1的處理中被顯著抑制（P＜0.05），分別是對(duì)照處理相對(duì)豐度的63%、32%和36%，其中，Phenylobacterium和Reyranel?la的相對(duì)豐度與土壤中5環(huán)、6環(huán)PAHs殘留率呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01）（表2）。已有研究也表明Phenylobac?terium相對(duì)豐度的變化與土壤中PAHs 的去除直接相關(guān)[25，56?58]。另外，本課題組前期研究采用穩(wěn)定同位素核酸探針（DNA?SIP）技術(shù)也發(fā)現(xiàn)屬于變形菌門(mén)的Ramlibacterd、Phenylobacterium和Lysobacter對(duì)苯并[a]芘具有降解功能[51]。此外，Pseudorhodoferax的相對(duì)豐度與對(duì)照相比也顯著降低了62%（P＜0.01）。Reyranella、Brevundimonas和Pseudorhodoferax也被多項(xiàng)研究認(rèn)為是具有PAHs 降解能力的菌屬[59?60]。本研究發(fā)現(xiàn)添加5 g·kg?1SWCNTs 顯著降低了Phenylobac?terium、Reyranella、Brevundimonas和Pseudorhodoferax的相對(duì)豐度，表明較高含量的SWCNTs可以抑制污染土壤中PAHs 降解菌的數(shù)量，從而抑制PAHs 的去除。然而添加SWCNTs 對(duì)PAHs 降解基因PAH?RHDα GP和PAH?RHDα GN 的豐度均無(wú)顯著影響，表明利用通用引物設(shè)計(jì)的潛在PAHs 降解菌的相對(duì)豐度沒(méi)有發(fā)生顯著變化，如Terrabacter和Bacillus，這與添加SWCNTs 對(duì)土壤微生物群落的分析結(jié)果一致，主要原因可能在于SWCNTs 改變的這幾類(lèi)具有降解潛力的微生物對(duì)PAHs 降解的途徑或表達(dá)基因不一樣。同時(shí)，添加一定濃度的SWCNTs 顯著抑制了土壤中Bryobacter、Microvirga、Actinotalea和Sphingoaurantia?cus的相對(duì)豐度（圖7），且Microvirga和Sphingoauranti?acus相對(duì)豐度的變化也與5環(huán)、6環(huán)PAHs 殘留率呈顯著負(fù)相關(guān)（表2，P＜0.01和P＜0.05），說(shuō)明添加SWCNTs不僅抑制了與PAHs 降解相關(guān)菌屬的相對(duì)豐度，還抑制了其他菌屬的相對(duì)豐度。此外，碳納米管因具有較大的比表面積，對(duì)PAHs 具有較高的吸附親和力[11?13]，因此當(dāng)土壤中存在SWCNTs 時(shí)，一些高分子量的PAHs 可能競(jìng)爭(zhēng)性地吸附到其表面，從而降低了其對(duì)PAHs 降解微生物的生物可利用性，進(jìn)而微生物降解受到抑制，導(dǎo)致土壤中PAHs去除率降低[37，61]。

表2 Spearman相關(guān)性分析Table 2 Spearman correlation analysis

3 結(jié)論

（1）盆栽培養(yǎng)70 d 后，添加SWCNTs 處理顯著抑制了土壤中5 環(huán)、6 環(huán)PAHs 的去除，其在土壤中的殘留率相比于未添加SWCNTs 處理顯著增加了8.68%～18.73%（P＜0.05），且隨著SWCNTs 添加量提高，抑制作用增強(qiáng)。添加SWCNTs 對(duì)紫花苜蓿生長(zhǎng)并未產(chǎn)生毒害作用。

（2）添加SWCNTs 對(duì)土壤細(xì)菌生物量、細(xì)菌群落豐度和多樣性無(wú)顯著影響，但改變了土壤細(xì)菌群落組成。5 g·kg?1的SWCNTs 顯著抑制了PAHs 潛在降解菌 屬Phenylobacterium、Reyranella、Brevundimonas和Pseudorhodoferax的相對(duì)豐度。