李生慶，張西云，胡國元，阿寶地，劉懷新，韓生義，李長云，祁果，李淑萍，石田

(1.青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，西寧810016;2.青海省玉樹市畜牧獸醫(yī)站，玉樹815000;3.青海省海晏縣畜牧獸醫(yī)站，海晏812220;4.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，西寧810016)

產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridum perfringens)又稱魏氏梭菌(Clostridum welchii)，依據(jù)其主要致死性毒素與其抗毒素中和試驗，可將此菌分為A、B、C、D、E 5個 型［1］。其中C型產(chǎn)氣莢膜梭菌的主要毒力因子為α、β1和β2毒素，這3種毒素毒力均很強，且均具有良好的免疫原性［2，3］。是引起動物出血性、壞死性腸炎和腸毒血癥的主要病原菌。臨床表現(xiàn)為羊猝死癥，其發(fā)病急、病程短、死亡率高，給養(yǎng)殖業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失［4，5］。

目前，對于該病主要采取疫苗免疫預(yù)防為主。然而，在青海曾多次發(fā)生免疫羊只發(fā)病的現(xiàn)象，結(jié)合彭小兵等［6］對預(yù)防猝狙的梭菌類疫苗的總產(chǎn)量及效檢結(jié)果的統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，C型產(chǎn)氣莢膜梭菌各組分不合格的占21批(63.6%)的調(diào)查結(jié)果［6］，推測是疫苗免疫力差導(dǎo)致羊猝疽的連續(xù)發(fā)生。為了提高羊猝疽疫苗的免疫保護力，本研究對病死羊體內(nèi)分離的19株C型產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株進行16S rDNA分子鑒定，并通過產(chǎn)毒試驗及免疫試驗，篩選出具有代表性的1株海C1菌株，在提高該菌株產(chǎn)毒素能力的基礎(chǔ)上，研制成羊猝疽菌苗，進行了家兔及本動物免疫試驗，以期有效地預(yù)防和控制綿羊羊猝疽的發(fā)生和流行。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株1974—1990年，由本試驗室分離鑒定的羊源C型產(chǎn)氣莢膜梭菌19株，菌株名稱暫定為C8016、C805、C8老、CP8、WLC、海C2、C6802、WCJ、海C1、他1、C691、海溶小、C592、C721、CD2、WB1、B4、C591、B12。

1.1.2 試劑細菌基因組DNA提取試劑盒及質(zhì)粒提取試劑盒購自寶生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 實驗動物昆明系小白鼠，體重16～18g，購自青海省地方病研究所小動物繁殖基地;實驗用家兔，體重1.5～2 kg，購自青海省互助縣家兔養(yǎng)殖基地;實驗用羊，體重20～22 kg，由青海省海晏縣獸醫(yī)站協(xié)助提供。

1.1.4 培養(yǎng)基配制自制培養(yǎng)基，115℃滅菌50 min，壓下pH值8.5。

1.2 方法

1.2.1 分離菌株生物學(xué)特性分析

1.2.1.1 菌株產(chǎn)毒能力評估將19株C型產(chǎn)氣莢膜梭菌分別接種至自制的VF復(fù)合培養(yǎng)基中，37℃厭氣培養(yǎng)24 h后，將上述培養(yǎng)物4 mL轉(zhuǎn)移至離心管中，4000 r離心10 min，上清液用1.0%蛋白胨水遞倍稀釋后，用16～18g昆明系小白鼠靜脈注射測定毒力。

1.2.1.2 分離菌株16S rRNA鑒定及系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建分別取1.2 mL上述菌株24 h純培養(yǎng)物于1.5 mL dorf管中，12000r/min離心1 min，棄去上清液，按DNA提取試劑盒要求提取基因組DNA。采用16S rRNA通用引物P3和P4，引物序列分別為

P1:5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3;P2:5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3。以提取的基因組DNA為模板進行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng) 在50 μL體系中進行，擴增條件為95℃5 min、95℃30s、54℃45s、72℃1 min，30個循環(huán)后，72℃延伸10 min。利用OMEGA公司購買的Gel Extraction Kit按說明書提取目的片段，電泳檢測后送樣測序。通過NCBI提供的BLAST在線搜索服務(wù)軟件獲取其他產(chǎn)氣莢膜梭菌16S RNA基因組核酸序列。使用MEGA5.0軟件的系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建功能對基因序列進行分析，選擇鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析不同分離株基因間的進化關(guān)系。

1.2.2 提高C型產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)毒能力將篩選出的地方菌株通過最佳培養(yǎng)基配方、調(diào)整pH值以及確定最佳產(chǎn)毒時間等參數(shù)，最終確定C型產(chǎn)氣莢膜梭菌高產(chǎn)毒最優(yōu)培養(yǎng)方式。

1.2.2.1 不同培養(yǎng)條件下不同培養(yǎng)時間菌株產(chǎn)毒能力分析將制備好的不同菌株種子按2%的比例分別無菌接種至10000 mL 4種不同配方VF培養(yǎng)基中(Ⅰ組:胰蛋白胨+糊精+調(diào)pH值;Ⅱ組:胰蛋白胨+糊精+不調(diào)pH值;Ⅲ組:示胨+葡萄糖+調(diào)pH值;Ⅳ組:示胨+葡萄糖+不調(diào)pH值)，37℃厭氣培養(yǎng)，自接種后3 h開始抽樣，每隔1 h抽樣，4000 r離心10 min，上清液用1.0%蛋白胨水遞倍稀釋后，用16～18 g昆明系小白鼠靜脈注射測定毒力。分析不同培養(yǎng)條件下不同培養(yǎng)時間菌株產(chǎn)毒能力，篩選最優(yōu)培養(yǎng)方法。

1.2.2.2 生長過程中調(diào)節(jié)pH值對菌株產(chǎn)毒的影響在上述實驗的基礎(chǔ)上，在菌株培養(yǎng)過程中培養(yǎng)物中定時滴加20%的NaOH溶液，調(diào)整培養(yǎng)液的酸堿度，并抽樣檢測毒力，判定生長過程中調(diào)節(jié)pH對菌株產(chǎn)毒的影響。

1.2.3 羊瘁狙地方菌株菌苗的制備及免疫效果檢測

1.2.3.1 菌苗制備利用高產(chǎn)毒海C1地方菌株，結(jié)合篩選的最優(yōu)培養(yǎng)基配方進行大瓶培養(yǎng)，生長6～8h后，按0.5%的劑量加入甲醛，置于37℃殺菌、脫毒72h，經(jīng)無菌檢驗后按菌液4份+鋁膠1份，每毫升菌苗含氫氧化鋁膠為7 mg，按萬分之一的量加入1%硫柳汞溶液，充分混合后，分裝。

1.2.3.2 家兔免疫攻毒試驗取1.5～2.0 kg家兔10只，免疫組8只(每組4只)，分為1.0 mL和0.2 mL兩個免疫組，均為肌肉注射;對照組2只。免疫21d后，按家兔最小致死量300 MLD/mL(小白鼠靜注)攻毒，記錄死亡情況。

1.2.3.3 本動物免疫攻毒試驗及血清效價測定將羊只隨機分為2組，每組4只，每批菌苗按0.5 mL、2.0 mL分別免疫1組，免疫21d后頸靜脈采血3～5 mL，置4℃冰箱過夜，待血清析出后，按組別吸出血清待用;同時進行攻毒試驗，觀察記錄死亡情況。

2 結(jié)果

2.1 菌株形態(tài)及毒力測定

在VF培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h，革蘭氏染色呈陽性，菌體兩端鈍圓，呈粗桿狀(見圖1);19株菌中毒力達4000 MLD/mL(小白鼠靜注)1株(海C1株);3000 MLD/mL的4株(721、海C2、海溶小、他1);2000 MLD/mL 3株(691、烏B1、591);1000 MLD/mL 4株(P8、8016、6802、達2);500 MLD/mL 1株(592);200 MLD/mL 2株(烏蘭羔、B12);100 MLD/mL 1株(B4)(見圖2)。

圖1 常規(guī)培養(yǎng)下的菌體形態(tài)圖

圖2 19株C型產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)毒能力比較圖

2.2 基因組16S rRNA基因擴增與序列分析結(jié)果

對其中9株菌獲取的菌體DNA經(jīng)16S rRNA通用引物PCR擴增后，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示均在1450bp處出現(xiàn)條帶，與預(yù)期的片段大小一致(如圖3所示)。將PCR擴增得到的產(chǎn)物送基因公司測序，并利用DNA Star軟件將得到的序列與GenBank公布的C型產(chǎn)氣莢膜梭菌、肉毒梭菌參考毒株進行比對，并進行同源性分析，結(jié)果表明，其中的高產(chǎn)毒海C1菌株的基因與制苗用參考菌株(C691株)(Clostridium novyi)基因高度同源，同源性均在99.5%以上(如圖4所示)。

圖3 9株地方分離菌株16S rRNA擴增結(jié)果

圖4 菌株系統(tǒng)進化樹示意圖

2.3 不同培養(yǎng)方式下菌株產(chǎn)毒素能力分析

2.3.1 4種培養(yǎng)組合方式下的產(chǎn)毒分析 培養(yǎng)基中加胰蛋白胨和示胨的產(chǎn)毒效果相同，碳源以糊精或葡糖糖均可。調(diào)整pH值后，產(chǎn)毒均能達到5000～6000 MLD/mL，并對毒素毒力的維持具有一定效果，但毒素在24h后降解嚴重(見圖5)。

圖5 海C1菌株在四種培養(yǎng)組合方式下的產(chǎn)毒分析

2.3.2 生長過程中調(diào)pH值對產(chǎn)毒的影響調(diào)pH值組，2h產(chǎn)毒為2000 MLD/mL(小白鼠靜注);3～6h，毒力為5000～6000 MLD/mL(小白鼠靜注);不調(diào)pH值組，3～4h產(chǎn)毒為2000 MLD/mL(小白鼠靜注);5h即降至2000 MLD/mL(小白鼠靜注)以下。實驗結(jié)果證明，調(diào)pH值不僅可提高產(chǎn)毒量，且可在3～6h內(nèi)保持較高毒素水平(見圖6)。

圖6 生長過程中調(diào)pH值對產(chǎn)毒的影響示意圖

2.4 疫苗免疫試驗結(jié)果

2.4.1 家兔攻毒試驗結(jié)果2.0 mL免疫組，可抵抗1.5 MLD/mL家兔致死量(4/4保護);1.0 mL免疫組，可抵抗1.0 MLD/mL家兔致死量(4/4保護);0.5 mL免疫組，可抵抗1 MLD/mL家兔致死量(3/4保護);對照組2只家兔攻1個家兔致死量均死亡(見表1)。

表1 201901批羊猝狙氫氧化鋁菌苗效力檢驗結(jié)果表

2.4.2 綿羊攻毒試驗結(jié)果試驗測得綿羊最小致死量為1500 MLD/mL(綿羊靜脈注射)。攻毒試驗結(jié)果顯示，2.0 mL免疫組，最高可抵抗16個羊單位的毒素攻擊，0.5 mL免疫組，最高可抵抗4個羊單位的毒素攻毒(1/2保護)(見表2)。

表2 羊瘁狙自制菌苗對綿羊的攻毒試驗結(jié)果

2.4.3 綿羊免疫血清抗體測定結(jié)果按照《中華人民共和國獸藥典》的方法測定血清對C型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素的中和效價［7］。免疫21d后，2.0 mL免疫組0.1 mL血清可中和12 MLD的毒素量，0.5 mL免疫組0.1 mL血清可中和8 MLD的毒素量(見表3)。

表3 綿羊疫苗免疫21d后免疫血清中和效價測定結(jié)果

結(jié)果判定:2 mL免疫組血清0.5 mL可中和60 MLD的毒素，即0.1 mL血清可中和12 MLD的毒素;0.5 mL免疫組血清0.5 mL可中和40 MLD的毒素，即0.1 mL血清可中和8 MLD的毒素。

3 結(jié)論

從19株分離的地方菌株中篩選出1株(海C1菌株)C型菌株，該菌株具有良好的產(chǎn)毒性能，在含1.0%葡萄糖，pH值8.4～8.6的VF培養(yǎng)基中，通過生長過程中調(diào)整pH值，36℃3～6 h產(chǎn)毒最高可達7000 MLD/mL;利用該菌株研制的滅活菌苗對家兔的免疫保護力是1～1.5 MLD/mL(家兔靜注)，對綿羊的免疫保護力是4～16 MLD/mL(綿羊靜注)。免疫羊血清抗體效價達8～12 MLD/mL(小鼠靜注)。該分離株具有較強的產(chǎn)毒穩(wěn)定性和較好的免疫原性，可作為羊猝疽疫苗生產(chǎn)備用菌株。

4 討論

4.1 在由產(chǎn)氣莢膜梭菌所引起的眾多家畜“猝死癥”的研究報道中，外毒素一直被認為是致動物死亡的主要原因之一［8］。目前，我國用于預(yù)防羊猝狙的疫苗主要有羊快疫、猝狙、腸毒血癥三聯(lián)滅活疫苗和羊梭菌病多聯(lián)干粉滅活苗等。Haagsma［9］指出，產(chǎn)氣莢膜梭菌致病是由于它們分泌的毒素和代謝產(chǎn)物導(dǎo)致，無毒素產(chǎn)生就不會出現(xiàn)臨床癥狀。柴同杰等［10］也提出同樣的觀點，即腸源毒血癥是該病快速發(fā)病死亡的主要原因。免疫接種是保護的首選措施，疫苗的抗原成分應(yīng)為類毒素，才能達到可靠的保護效果［11］。因此，C型產(chǎn)氣莢膜梭菌疫苗的預(yù)防重點應(yīng)當在對其所分泌外毒素研究的基礎(chǔ)上，研制類毒素疫苗。首先要求制苗菌液中毒素的毒力達到一定標準，才能得到高效疫苗，獲得良好的免疫效果。本研究對分離的19株菌株及1株制苗菌株的產(chǎn)毒能力進行了對比分析，在合適的培養(yǎng)基上，TB05菌株的產(chǎn)毒能力遠遠高于其他菌株的產(chǎn)毒能力，且產(chǎn)毒穩(wěn)定性高，平均能達到7000 MLD/mL，遠高于現(xiàn)用疫苗規(guī)程規(guī)定1000 MLD/mL的產(chǎn)毒最低要求［12］，用此菌株所產(chǎn)毒素制成的羊猝疽菌苗對家兔及綿羊具有良好的免疫保護力。

4.2 C型產(chǎn)氣莢膜梭菌雖同屬于產(chǎn)氣莢膜梭菌，但其培養(yǎng)及產(chǎn)毒特性與其他菌存在明顯差異，本實驗在確定了疫苗候選株之后，對培養(yǎng)條件以及培養(yǎng)基成分進行了摸索和改良。本實驗通過對產(chǎn)毒過程的觀察研究分析以及間斷性取樣毒力測定，確定在培養(yǎng)后3～5 h毒素量達到高峰期，隨后毒力快速下降(見圖6)，但通過生長過程中調(diào)整pH值，可適當減緩毒素的降解速率。另外，毒素快速降解對于最終抗原濃度的變化以及疫苗免疫效果的影響還需進一步研究。