趙采芹，王燕碧，唐 宏，邢靜如，石海英，段志強(qiáng)*

(1.貴州大學(xué) 高原山地動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州大學(xué) 貴州省動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025)

腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(TRAF6)是腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子家族(TRAFs)中研究最為廣泛的成員之一。與TRAFs家族其他成員不同的是，TRAF6作為胞內(nèi)重要的多功能銜接分子和E3泛素連接酶，能特異性識(shí)別氨基酸序列，從而參與白介素1受體/Toll樣受體(IL-1/TLR)和腫瘤壞死因子受體家族等炎癥信號(hào)通路，通過(guò)激活信號(hào)通路，對(duì)免疫細(xì)胞的存活和激活及其重要。此外，TRAF6蛋白在人和不同動(dòng)物的組織中廣泛表達(dá)，其中在免疫器官脾臟、胸腺和法氏囊中分布較多，在腦和腿肌中也有表達(dá)。研究證實(shí)TRAF6蛋白不僅介導(dǎo)信號(hào)的傳導(dǎo)，還在免疫應(yīng)答，以及淋巴結(jié)、細(xì)胞分化與凋亡、多種組織生長(zhǎng)發(fā)育等過(guò)程中也起著關(guān)鍵作用。

大量研究表明，基因多態(tài)性與許多疾病的發(fā)生相關(guān)。Strickson等將小鼠野生型TRAF6的第74位氨基酸L突變?yōu)镠，小鼠可以存活5周，之后小鼠因?yàn)槠つw和器官出現(xiàn)炎癥而死亡。與野生型小鼠相比，突變后的L74H沒(méi)有出現(xiàn)骨質(zhì)疏松的現(xiàn)象且與野生型的巨噬細(xì)胞相比，信號(hào)傳導(dǎo)和抗炎因子的分泌都減弱了，在TRAF6敲除的小鼠胚胎來(lái)源的巨噬細(xì)胞中，無(wú)法誘導(dǎo)信號(hào)傳導(dǎo)，也沒(méi)有細(xì)胞因子的產(chǎn)生。陳子文發(fā)現(xiàn)，基因多態(tài)性位點(diǎn)rs5030411、rs5030416可能參與調(diào)節(jié)缺血性中風(fēng)風(fēng)痰癖阻證的炎性反應(yīng)過(guò)程，從而影響缺血性中風(fēng)的發(fā)病機(jī)制。有研究者發(fā)現(xiàn)，位于染色體11p12處的基因與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)和系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)相關(guān)，基因內(nèi)含子處rs540386多態(tài)性與自身免疫疾病表型存在關(guān)聯(lián)，基因rs331457多態(tài)性可降低皮膚惡性黑色素瘤出現(xiàn)的風(fēng)險(xiǎn)。此外，有研究報(bào)道，6基因缺乏會(huì)導(dǎo)致胸腺基質(zhì)異常發(fā)育，從而改變免疫耐受性?？傊?，TRAF6作為一種多功能細(xì)胞因子，以上研究表明TRAF6在多種疾病的免疫應(yīng)答中起著調(diào)控作用。

遺傳變異可能會(huì)改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致各種疾病的發(fā)生，由此可見(jiàn)，遺傳變異與畜禽的抗病育種存在密切關(guān)系。而單核苷酸多態(tài)性(SNP)是遺傳變異的主要形式，預(yù)測(cè)非同義單核苷酸多態(tài)性(nsSNPs)與疾病相關(guān)關(guān)系的研究在近些年也越來(lái)越多。nsSNPs通常被認(rèn)為是導(dǎo)致畜禽表型和基因型變異的重要因素。nsSNPs又可分兩類：若使提前終止蛋白質(zhì)翻譯，而不改變所編碼的氨基酸序，則稱為無(wú)義突變；若導(dǎo)致氨基酸序列發(fā)生改變，則稱為錯(cuò)義突變，突變位點(diǎn)與疾病的發(fā)生相關(guān)。

近年來(lái)，對(duì)的研究多見(jiàn)于人、小鼠和畜禽，此外，也存在于許多非脊椎動(dòng)物如青蛤以及斑馬魚(yú)等魚(yú)類。而目前對(duì)于基因的多態(tài)性研究大多是其表達(dá)對(duì)于人類疾病的影響，而對(duì)禽類基因nsSNPs的功能研究報(bào)道較少。本研究利用生物信息軟件對(duì)雞基因編碼區(qū)nsSNPs進(jìn)行分析，篩選其中可能具有潛在生物學(xué)功能的影響雞抗病育種的候選功能性錯(cuò)義突變位點(diǎn)，并預(yù)測(cè)其可能的作用機(jī)理。篩選和分析與雞免疫相關(guān)的基因nsSNPs位點(diǎn)，為后續(xù)開(kāi)展雞抗病育種工作提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 雞TRAF6基因nsSNPs數(shù)據(jù)的收集

根據(jù)基因的序列號(hào)(ENSGALT0000010 5433)從Ensembl genome browser(http://asia.ensembl.org)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行檢索。由dbSNP(https://ncbiinsights.ncbi.nlm.nih.gov/tag/dbsnp/)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索的信息收集各SNPs在基因中位置，篩選出位于編碼區(qū)的nsSNPs；從dbSNP數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索收集nsSNPs(rs IDs)；從UniProtKB數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.uniprot.org/)檢索氨基酸序列；并使用Origin軟件繪制基因的SNPs分布圖。

1.2 雞TARF6基因功能性nsSNPs預(yù)測(cè)

利用SIFT(http://sift.jcvi.org/)、PROV EAN(http://provean.jcvi.org/seq_submit.php)、

PhD-SNP(https://snps.biofold.org/phd-snp/phd-snp.html)、SNAP2(https://www.rostlab.org/services/SNAP/)四種軟件預(yù)測(cè)分析各nsSNPs對(duì)雞TRAF6蛋白功能的影響，運(yùn)用R語(yǔ)言繪制四種軟件預(yù)測(cè)結(jié)果的韋恩圖。

SIFT是一種主要利用SIFT算法，基于氨基酸序列同源性預(yù)測(cè)氨基酸替代是否影響蛋白功能的軟件。PROVEAN是一款對(duì)單個(gè)或多個(gè)氨基酸替換、插入和缺失進(jìn)行預(yù)測(cè)的開(kāi)放性工具。PhD-SNP是一種支持向量機(jī)的分類器，基于SVM算法，預(yù)測(cè)分析目標(biāo)nsSNPs與疾病是否相關(guān)。SNAP2是一種識(shí)別有影響和中性變異的工具。

1.3 雞TRAF6蛋白質(zhì)穩(wěn)定性分析

利用I-Mutant2.0(https://folding.biofold.org/i-mutant//pages/I-Mutant2.0_TutSeqVal.html)和Mupro(http://mupro.proteomics.ics.uci.edu/)在線軟件預(yù)測(cè)nsSNP引起蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的改編。I-Mutant2.0是一個(gè)基于支持SVM的工具，可以自動(dòng)預(yù)測(cè)單點(diǎn)突變時(shí)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的變化。

1.4 雞TRAF6氨基酸多序列比對(duì)及進(jìn)化保守位點(diǎn)分析

利用Clustal Omega(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)對(duì)TRAF6的氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)，并使用Jalview軟件分析TRAF6氨基酸位點(diǎn)的進(jìn)化保守性。越是保守的位點(diǎn)發(fā)生變異，越可能影響蛋白質(zhì)的功能。

1.5 雞TRAF6基因與疾病表型相關(guān)nsSNPs預(yù)測(cè)

MutPred2(http://mutpred.mutdb.org/)是一款可以用于預(yù)測(cè)突變與疾病相關(guān)性的在線工具。預(yù)測(cè)結(jié)果有兩個(gè)重要分值總分?jǐn)?shù)(g)和屬性分?jǐn)?shù)(P)，其中g(shù)表示氨基酸替換是有害或疾病相關(guān)的概率，P則表示蛋白結(jié)構(gòu)或功能是否有影響。結(jié)合g和P值，預(yù)測(cè)結(jié)果g>0.5且<0.05的被稱為中假設(shè)可信，g>0.75且<0.05的被稱為假設(shè)非?？尚?。

1.6 雞TRAF6蛋白質(zhì)二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

利用Sopma(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)和SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/interactive)在線軟件對(duì)雞TRAF6蛋白及其突變體的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)分別進(jìn)行預(yù)測(cè)，進(jìn)而評(píng)估nsSNPs可能造成的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞TRAF6基因nsSNPs的篩選

..雞基因上的SNPs分布

從Ensembl數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到基因的轉(zhuǎn)錄本TRAF6-203(ENSGALT00000105433)，檢索發(fā)現(xiàn)697個(gè)SNPs被標(biāo)記在雞基因序列中，其中錯(cuò)義突變、同義突變、3′非翻譯區(qū)(3′UTR)變異和5′非翻譯區(qū)(5′UTR)變異分別有8個(gè)、20個(gè)、5個(gè)和1個(gè)；415(含2個(gè)剪接區(qū)變異)個(gè)變異位于內(nèi)含子區(qū)，位于基因上游和下游的變異分別有120個(gè)和128個(gè)。SNPs數(shù)量百分比如圖1所示。

圖1 雞TRAF6基因上的SNPs分布餅圖Fig.1 Pie chart of SNPs distribution on chicken TRAF6 gene

..雞基因編碼區(qū)nsSNPs的分布

從dbSNP和Ensembl數(shù)據(jù)庫(kù)中共篩選出8個(gè)(rs733469223、rs736890315、rs734934585、rs735665 981、rs739156253、rs737140963、rs313558769和rs734774178)nsSNPs位于雞基因的編碼區(qū)。通過(guò)IBS軟件繪制該8個(gè)nsSNPs的分布情況如圖2所示。

圖2 雞TRAF6基因nsSNPs的分布圖Fig.2 Distribution map of chicken TRAF6 gene nsSNPs

2.2 雞TRAF6基因功能性nsSNPs預(yù)測(cè)

..SIFT預(yù)測(cè)功能性nsSNPs

預(yù)測(cè)的得分表示該位點(diǎn)突變對(duì)蛋白質(zhì)序列的影響。得分>0.05，可以耐受；得分≤0.05，有害。結(jié)果顯示“有害”的nsSNPs有2個(gè)，其ID分別為rs734774178、rs736890315；可耐受的nsSNPs有6個(gè)，分別為rs313558769、rs737140963、rs7391562 53、rs735665981、rs734934585、rs733469223(表1)。得分越低，說(shuō)明該nsSNP對(duì)蛋白質(zhì)的功能影響越大。

表1 SIFT預(yù)測(cè)雞TRAF6基因功能性nsSNPsTab.1 Prediction of functional nsSNPs of chicken TRAF6 gene by SIFT

..PROVEAN預(yù)測(cè)功能性nsSNPs

PROVEAN預(yù)測(cè)結(jié)果分為“有害”和“中性”兩類。分?jǐn)?shù)值≤-2.5預(yù)測(cè)為有害，分?jǐn)?shù)值>-2.5預(yù)測(cè)為中性。在所分析的8個(gè)nsSNPs中，“有害”的nsSNPs有1個(gè)，其ID是rs734774178，其余的nsSNPs均為中性(表2)。

表2 PROVEAN預(yù)測(cè)雞TRAF6基因功能性nsSNPsTab.2 Prediction of functional nsSNPs of chicken TRAF6 gene by PROVEAN

..PhD-SNP預(yù)測(cè)功能性nsSNPs

PhD-SNP預(yù)測(cè)結(jié)果分為“疾病”和“中性”兩類，可靠性指數(shù)(RI)在0～9之間。預(yù)測(cè)的結(jié)果中為疾病的nsSNPs有1個(gè)，其ID是rs734774178，表明該位點(diǎn)突變可能致??；其余的7個(gè)nsSNPs均為中性(表3)。

表3 PhD-SNP預(yù)測(cè)雞TRAF6基因功能性nsSNPsTab.3 Prediction of functional nsSNPs of chicken TRAF6 gene by PhD-SNP

..SNAP2預(yù)測(cè)功能性nsSNPs

SNAP2的預(yù)測(cè)結(jié)果分為“有影響”和“中性”兩類，輸出分?jǐn)?shù)值0～100預(yù)測(cè)為有影響，輸出分?jǐn)?shù)值-100～0預(yù)測(cè)為中性。預(yù)測(cè)的結(jié)果如表4所示，其中預(yù)測(cè)為有影響的有2個(gè)，其ID分別是rs734774178和rs734934585，預(yù)測(cè)為中性的有6個(gè)，分別是rs313558769、rs737140963、rs739156253、rs735665981、rs736890315、rs733469223。

..雞TRAF6基因功能性nsSNPs預(yù)測(cè)結(jié)果

通過(guò)R語(yǔ)言的“Venn”package繪制SIFT、PROVEAN、PhD-SNP和SNAP2四種預(yù)測(cè)方法預(yù)測(cè)的韋恩圖(圖3)，四種軟件功能性nsSNPs預(yù)測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分別預(yù)測(cè)到2個(gè)V472E、S17R、1個(gè)V472E、1個(gè)V472E和2個(gè)V472E、C20G nsSNPs位點(diǎn)，其中V472E有4種方法預(yù)測(cè)為有害位點(diǎn)。由此推測(cè)，V472E位點(diǎn)可能為雞基因功能性nsSNPs位點(diǎn)。

圖3 預(yù)測(cè)雞TRAF6基因功能性nsSNPs的韋恩圖Fig.3 The Venn diagram of functional nsSNPs prediction of chicken TRAF6 gene

2.3 雞TRAF6蛋白質(zhì)穩(wěn)定性分析

大多數(shù)疾病相關(guān)的nsSNPs會(huì)影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。利用I-Mutant2.0和Mupro評(píng)估氨基酸替代對(duì)突變蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的影響。自由能變化<0，表示此nsSNPs降低了蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，自由能變化>0，表示此nsSNPs增加了蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。結(jié)果如表5所示，所有突變位點(diǎn)均使TRAF6蛋白質(zhì)穩(wěn)定性下降。其中V472E為之前預(yù)測(cè)的功能性突變位點(diǎn)。

2.4 雞TRAF6蛋白的多序列比對(duì)和進(jìn)化保守性位點(diǎn)預(yù)測(cè)

在UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索TRAF6蛋白在原雞、火雞、綠頭鴨、鴻雁、黑天鵝和日本鵪鶉中的高度同源序列，通過(guò)Clustal Omega軟件對(duì)TRAF6氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)，再使用Jalview軟件進(jìn)行作圖分析(如圖4所示)，在不同物種中不保守的nsSNPs有3個(gè)，分別是D16G、S17R和A307T；在不同物種中保守的nsSNPs有5個(gè)，分別是C20G、S40G、S40R、T42A和V472E。

表4 SNAP預(yù)測(cè)雞TRAF6基因功能性nsSNPsTab.4 Prediction of functional nsSNPs of chicken TRAF6 gene by SNAP

表5 TRAF6蛋白質(zhì)穩(wěn)定性評(píng)估Tab.5 TRAF6 protein stability assessment

圖4 多序列比對(duì)圖Fig.4 Multiple sequence alignment diagram

2.5 TRAF6突變位點(diǎn)可能的功能后果預(yù)測(cè)

MutPred2在線工具預(yù)測(cè)與疾病相關(guān)的表型。得分(g)>0.5且<0.05，為中度假設(shè)可信；g>0.75且<0.05，為假設(shè)非常可信。從表6可以看出，V472E位點(diǎn)的突變會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性改變，且V472E的功能后果預(yù)測(cè)為中度置信假設(shè)，其他位點(diǎn)的突變均無(wú)顯著影響。

表6 MutPred2預(yù)測(cè)雞TRAF6基因功能性nsSNPsTab.6 Prediction of functional nsSNPs of chicken TRAF6 gene by MutPred2

2.6 雞TRAF6突變體蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

利用在線軟件Sopma對(duì)雞TRAF6蛋白的野生型和8種突變體進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表7。野生型TRAF6的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)有，α螺旋(39.45%)、延伸鏈(11.56%)、β轉(zhuǎn)角(2.39%)、無(wú)規(guī)則卷曲(46.61%)4種結(jié)構(gòu)。其中，C20G位點(diǎn)的突變均造成了TRAF6蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變，導(dǎo)致了α螺旋百分比下降和無(wú)規(guī)則卷曲百分比的提高，而A307T位點(diǎn)的突變未能影響α螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲的比例；T42A、S40R、S17R、和D16G位點(diǎn)的突變均導(dǎo)致了α螺旋百分比上升和無(wú)規(guī)則卷曲百分比的下降；除S17R突變未能影響延伸鏈的比例外，其他7處突變都導(dǎo)致延伸鏈百分比下降；V472E和T42A突變都導(dǎo)致β轉(zhuǎn)角比例下降，其余6處突變均導(dǎo)致β轉(zhuǎn)角比例上升。二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化通過(guò)影響蛋白的穩(wěn)定性從而影響蛋白翻譯調(diào)控過(guò)程，其穩(wěn)定性通過(guò)最小自由能表示，最小自由能越低，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性越高。有研究表明，蛋白疏水性會(huì)隨著α螺旋比例的降低而隨著增大，隨β轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲比例的升高而增大。

2.7 雞TRAF6蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

使用SWISS-MODEL在線軟件對(duì)雞TRAF6蛋白的野生型和突變體(V472E)的3D模型進(jìn)行了預(yù)測(cè)分析。結(jié)果如圖5所示，TRAF6蛋白的野生型和突變體(V472E)的三級(jí)結(jié)構(gòu)與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果一致，主要結(jié)構(gòu)是α螺旋和無(wú)規(guī)卷曲。

表7 TRAF6突變體蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Tab.7 Prediction of secondary structure of TRAF6 mutants

注：a為突變前是纈氨酸(Val)；b為突變后是谷氨酸(Glu)。圖5 雞TRAF6蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.5 Tertiary structure prediction of chicken TRAF6 protein

3 結(jié)論與討論

nsSNPs是基因編碼區(qū)可能對(duì)蛋白的結(jié)構(gòu)和功能特性產(chǎn)生重大影響的單個(gè)氨基酸替換。近年來(lái)，隨著生物測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，對(duì)功能型nsSNPs預(yù)測(cè)，已越來(lái)越多地應(yīng)用于人類醫(yī)學(xué)和畜牧學(xué)功能型SNP的研究中。在人類和畜禽生命中，絕大部分nsSNPs會(huì)影響人和畜禽的健康，導(dǎo)致許多疾病發(fā)生。僅有少部分的nsSNPs不會(huì)改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能表達(dá)，不會(huì)影響人和畜禽的健康。在家禽中，有研究者發(fā)現(xiàn)SNPs位點(diǎn)基因型對(duì)三穗鴨的蛋殼品質(zhì)有影響，此外，SNP位點(diǎn)的突變可能影響動(dòng)物的表現(xiàn)型。研究報(bào)道，在人類大部分遺傳病中基因變異是由SNP導(dǎo)致的。例如，Song等通過(guò)對(duì)人TRAF6 mRNA表達(dá)水平與TRAF6內(nèi)含子SNP(rs4755453)基因型的關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，rs475545與膿毒癥誘導(dǎo)人急性肺損傷的易感性顯著相關(guān)，這可能是rs4755453通過(guò)影響TRAF6 mRNA的表達(dá)，來(lái)增加炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而直接導(dǎo)致肺組織損傷。而少汗型外胚層發(fā)育不良(HED)疾病，其特征在于發(fā)育不良、汗?jié)癫蛔?。Fujikawa等研究發(fā)現(xiàn)突變型TRAF6蛋白抑制了野生型TRAF6蛋白質(zhì)與外胚層-A相關(guān)受體死亡域蛋白(EDARADD)之間的相互作用，在外胚層衍生器官發(fā)育過(guò)程中潛在地抑制了EDARADD介導(dǎo)的NF-κB的活性，從而導(dǎo)致HED表型。此外，對(duì)動(dòng)物基因的研究發(fā)現(xiàn)，TARF6是與生長(zhǎng)發(fā)育、免疫調(diào)控相關(guān)的候選基因。研究報(bào)道，TRAF6自身泛素化的關(guān)鍵位點(diǎn)K132的突變抑制了NF-κB的活性，隨之Li等研究發(fā)現(xiàn)，點(diǎn)帶石斑魚(yú)TRAF6的第132位氨基酸K突變?yōu)镽，突變后的K132R通過(guò)激活NF-κB下游信號(hào)通路，從而在宿主抵御寄生蟲(chóng)感染中起著關(guān)鍵作用。張芷毓等在秦川?；虻诹鶅?nèi)含子17 628 bp處檢測(cè)到的SNP位點(diǎn)形成兩種基因型，該突變基因型對(duì)肉牛的育種具有顯著影響。

本研究利用SIFT、PROVEAN、PhD-SNPB和SNAP2四種生物信息學(xué)軟件對(duì)雞基因外顯子區(qū)功能性nsSNPs進(jìn)行預(yù)測(cè)。這些方法既是相互獨(dú)立又是相互補(bǔ)充的，因此，為減少預(yù)測(cè)結(jié)果差異，本研究結(jié)合四種預(yù)測(cè)軟件進(jìn)行預(yù)測(cè)，篩選出S17R、C20G、V472E這3個(gè)nsSNPs，其中V472E是四種軟件共同篩選出的nsSNPs。研究發(fā)現(xiàn)，保守序列一般是生物體的生命所需，其突變常常致病。蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性對(duì)生物學(xué)功能很重要，錯(cuò)義突變會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性降低，而I-Mutant2.0和Mupro是評(píng)估氨基酸替代對(duì)突變蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的影響；MutPred2用于預(yù)測(cè)疾病表型。本研究通過(guò)對(duì)不同物種間的多序列比對(duì)和保守的多態(tài)性位點(diǎn)及其蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，V472E為保守的多態(tài)性位點(diǎn)且V472E位點(diǎn)的突變會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性改變，使蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性下降。此外，MutPred2對(duì)氨基酸替代的功能預(yù)測(cè)與蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果相同，V472E位點(diǎn)的突變均造成了TRAF6蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性改變。由此可知，V472E突變位可能嚴(yán)重影響雞TRAF6蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，而蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)改變會(huì)導(dǎo)致生物體的性狀改變，故推測(cè)V472E突變位點(diǎn)可能是影響雞生長(zhǎng)發(fā)育和抗病育種的主要功能性SNPs。

本研究預(yù)測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：rs734774178(V472E)nsSNPs使纈氨酸(Val)變成谷氨酸(Glu)。Val屬于家禽功能性必需支鏈氨基酸之一，是非極性氨基酸，具有疏水性，在肌肉中氧化代謝。研究發(fā)現(xiàn)，Val可以抑制免疫器官的發(fā)育及免疫球蛋白的合成，從而影響免疫功能，增加Val含量可以增強(qiáng)機(jī)體免疫力和抗氧化能力。王宇波等發(fā)現(xiàn)，低含量Val飼糧增加了肥育豬肌內(nèi)脂肪含量，從而影響肥育豬的生長(zhǎng)性能。而Glu是一種帶負(fù)電荷的極性氨基酸，具有親水性，與多種疾病相關(guān)。一個(gè)氨基酸的疏水性和親水性，極性與非極性都會(huì)影響氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)功能的發(fā)揮及其各種酶和抗體、抗原之間的相互作用。因此，本研究對(duì)V472E突變位點(diǎn)的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)與三級(jí)結(jié)構(gòu)的功能預(yù)測(cè)相符。綜上所述，本研究利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)篩選出致病的基因的nsSNPs位點(diǎn)V472E，故推測(cè)V472突變位點(diǎn)可能影響雞抗病表型的形成，但該位點(diǎn)的具體功能與致病表型之間的關(guān)系需要進(jìn)一步研究。

雞基因的rs734774178(V472E)位點(diǎn)可能是影響雞抗病育種的重要功能性突變位點(diǎn)，該位點(diǎn)突變可能嚴(yán)重影響雞TRAF6蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)從而發(fā)揮蛋白功能。