劉宏宇，丁 野

(1.貴州省農(nóng)作物品種資源研究所,貴州 貴陽 550000;2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護研究所,海南 ?？?570100;3.海南省熱帶生態(tài)循環(huán)農(nóng)業(yè)重點實驗室,海南 ?？?570100)

秀珍菇()，又稱肺形側(cè)耳，又稱鳳尾菇、印度鮑魚菇，屬木腐型真菌，隸屬擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、蘑菇綱(Agaricomycetes)、蘑菇目(Agaricales)、側(cè)耳科(Pleurotaceae)、側(cè)耳屬()；主要生長在溫帶和亞熱帶針葉林的硬木上，其菌肉肥嫩、味鮮爽口，且營養(yǎng)豐富。秀珍菇有高蛋白、低脂肪的特征，經(jīng)常食用可提高人體的免疫力。秀珍菇富含β-D-葡聚糖，有良好的鎮(zhèn)痛和消炎作用；其多糖對肝臟具有良好的抗炎癥和抗氧化作用，是具有開發(fā)為護肝產(chǎn)品潛力的真菌。據(jù)相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，秀珍菇的水提產(chǎn)物、醇提產(chǎn)物不僅具備良好的抑制、延遲癌細(xì)胞擴散作用，還具有抑制組胺釋放治療花粉過敏的作用。

秀珍菇是一種兼食用和藥用功能的的真菌。但因其在國內(nèi)的栽培品種較少，對于多品種的適應(yīng)性和營養(yǎng)利用規(guī)律研究相對匱乏。本研究針對廣泛收集到的菌種進行了營養(yǎng)利用規(guī)律及出菇特性研究，明確了其適應(yīng)性和最適配方，為生產(chǎn)者選擇合適的菌種及配方提供了參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

本試驗中11個秀珍菇菌株來源見表1。

1.2 試驗培養(yǎng)基

試驗材料及pH、溫度設(shè)置見表2。

菌絲的復(fù)壯及擴繁(PDA)：馬鈴薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂粉20 g/L。

溫度試驗培養(yǎng)基(CPDA)：馬鈴薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂粉20 g/L、硫酸鎂1.5 g/L、磷酸二氫鉀3 g/L。

碳源試驗培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L、碳源20 g/L、瓊脂粉20 g/L、硫酸鎂1.5 g/L、磷酸二氫鉀3 g/L。

氮源試驗培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、氮源3 g/L、瓊脂粉20 g/L、硫酸鎂1.5 g/L 、磷酸二氫鉀3 g/L。

pH試驗培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂粉20 g/L、硫酸銨1.5 g/L、磷酸二氫鉀3 g/L,用1 mol/L的鹽酸及固體氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值。

1.3 試驗方法

菌絲生長速度及長勢的測定：將15 mL的培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿(φ=90 mm)中，接種直徑為8 mm的接種塊，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱(溫度試驗時將培養(yǎng)皿分別放入15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃恒溫培養(yǎng)箱)中黑暗培養(yǎng)，接種后24 h開始采用十字交叉劃線法測量菌絲生長速度，每隔24 h測量菌絲生長量，連續(xù)測量直至菌絲直徑長至6.5～7 cm，每個處理4個重復(fù)。計算菌絲日平均生長速度，觀察拍照記錄菌絲長勢。

表1 供試菌株Tab.1 The source of test strains

表2 試驗材料Tab.2 Experimental material

1.4 栽培試驗

按照木腐菌常規(guī)栽培料中的“782011”原則，確定培養(yǎng)料配方：78%木屑、20%麥麩、1%石灰、1%石膏。

1.5 培養(yǎng)條件

將滅菌后的菌袋于超凈工作臺中接種，將培養(yǎng)皿中菌株用直徑8 mm打孔器于菌絲邊緣打孔20～25個，每個菌袋接入10粒菌種，每個菌株10個重復(fù)。將接種后的菌袋置于26～28 ℃的培養(yǎng)室內(nèi)黑暗條件發(fā)菌，待菌絲長滿菌袋，將菌袋移入溫度26～28 ℃、濕度80%～90%、自然光條件下出菇。記錄菌絲滿袋時間、第一個子實體到最后一個子實體采收間隔、子實體顏色。

1.6 數(shù)據(jù)處理及分析

采用SPSS 25.0軟件對數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 ITS菌株鑒定

對收集的12個菌株的ITS區(qū)段進行PCR擴增，獲得DNA片段，將獲得的序列與NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)核酸數(shù)據(jù)庫進行比對，其中11株與秀珍菇序列相似度高達(dá)99%；1株與糙皮側(cè)耳相似度高達(dá)99%；下載序列AY696300.1: 秀珍菇()、AY540332.1: 糙皮側(cè)耳()和AY540321.1: 泡囊側(cè)耳泡囊側(cè)耳()作為標(biāo)準(zhǔn)序列，使用MEGA7軟件以ML法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。其中11個菌株與肺型側(cè)耳聚為一支，另有1個菌株與糙皮側(cè)耳聚為一支，后續(xù)將以其中的11個菌株為試驗材料繼續(xù)試驗(圖1)。

2.2 不同碳源對秀珍菇菌株菌絲生長的影響

所有秀珍菇菌株的菌絲在所有供試碳源培養(yǎng)基上均能良好生長，菌絲整體潔白濃密，但11個菌株的生長速度存在顯著差異，秀珍菇對供試碳源的偏好性為：葡萄糖>糊精>蔗糖>可溶性淀粉>無糖>D-果糖(表3;圖2)；4號和11號菌株對不同碳源的適應(yīng)性均較好，生長速度較快活力較高，11號菌株據(jù)有最好的碳源適應(yīng)性，在各碳源上長勢均表現(xiàn)良好(表3;圖3)。添加D-果糖的培養(yǎng)基，11株秀珍菇菌株除1和5外，其余9株菌株菌絲生長速度均明顯低于無糖或與無糖的無差異，表明D果糖的添加對秀珍菇菌絲生長不僅無促進作用反而均有一定的抑制作用；葡萄糖在秀珍菇菌株菌絲培養(yǎng)過程中，除菌株10低于蔗糖、菌株11略低于其他部分碳源培養(yǎng)基外，其余9株菌株均明顯或略高于其他碳源培養(yǎng)基(表3)，由此建議在選擇秀珍菇菌種培養(yǎng)基制作中應(yīng)首選葡萄糖為主要碳源，盡量避免含D-果糖碳源物質(zhì)的加入。

圖1 ML法構(gòu)建的基于肺型側(cè)耳和其他側(cè)耳屬ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 The phylogenetic dendrogram of Pleurotus pulmonarius and other Pleurotus spp.constructed by using Maximum likehood (ML) method based on the ITS sequences

表3 不同碳源對秀珍菇菌絲生長的影響Tab.3 Effect of different carbon sources on mycelia growth of Pleurotus pulmonarius

圖2 不同碳源對秀珍菇菌絲生長的影響Fig.2 Effects of different carbon sources on mycelium growth of Pleurotus pulmonarius

圖3 不同秀珍菇菌株對碳源的適應(yīng)性Fig.3 Adaptability of different strains of Pleurotus pulmonarius to carbon source

2.3 不同氮源對秀珍菇菌株菌絲生長的影響

所有菌株的菌絲在所有的供試氮源培養(yǎng)基上均能正常生長，11個菌株在不同氮源培養(yǎng)基上生長態(tài)勢并不一致，存在顯著差異，秀珍菇對供試氮源的偏好性順序為：豆粉>硝酸鈉>牛肉膏>麥麩>硫酸銨>蛋白胨>硝酸銨>氯化銨>硝酸鈣>尿素(表4;圖4))；9號和11號菌株具較廣的氮源適應(yīng)性，在不同氮源上長勢均較好，活力較高；2號、11號菌株不能在尿素培養(yǎng)基上萌發(fā)；2號不能在氯化銨培養(yǎng)基上萌發(fā)；硫酸銨適合大部分菌株生長，且長勢良好，6號菌株的氮源適應(yīng)性處在所有菌株中游，適應(yīng)性較好，硫酸銨對6號菌株抑制，使其未能萌發(fā)(表4;圖5)。綜上所述，9號秀珍菇菌株為氮源適應(yīng)性最好的菌株；豆粉、硝酸鈉為秀珍菇菌株廣范適應(yīng)的氮源；尿素、氯化銨不適合作為秀珍菇培養(yǎng)基氮素的來源。

表4 不同氮源對秀珍菇菌絲生長的影響Tab.4 Effects of different nitrogen sources on mycelia growth of Pleurotus pulmonarius

圖4 不同氮源對秀珍菇菌絲生長的影響Fig.4 Effects of different nitrogen sources on the mycelium growth of Pleurotus pulmonarius

圖5 不同秀珍菇菌株對氮源的適應(yīng)性Fig.5 Adaptability of different strains of Pleurotus pulmonarius to nitrogen source

2.4 不同pH對秀珍菇菌株菌絲生長的影響

所有菌株在供試pH范圍內(nèi)菌絲均能正常萌發(fā)生長，11個菌株在不同初始pH培養(yǎng)基上長勢不一致，存在顯著差異。秀珍菇對pH的適應(yīng)性為：秀珍菇生長的最適pH值為9(表5;圖6)；而菌株4號、7號和11號菌株具較好的pH適應(yīng)性，在不同pH條件下均能較好的生長(表5;圖7)。

圖6 不同pH對秀珍菇菌絲生長的影響Fig.6 Effects of different pH on the mycelium growth of Pleurotus pulmonarius

圖7 不同秀珍菇菌株對pH的適應(yīng)性Fig.7 Adaptability of different strains of Pleurotus pulmonarius to pH

表5 不同pH值對秀珍菇菌絲生長的影響Tab.5 Effect of different initial pH on the mycelia growth of Pleurotus pulmonarius

2.5 不同溫度對秀珍菇菌株菌絲生長的影響

所有菌株在20～30 ℃之間均能良好生長，15 ℃下菌株菌絲生長緩慢，35 ℃下11號菌株可正常萌發(fā)生長，但生長速度較為緩慢(表6)；35 ℃下1號、2號、3號、4號、5號、6號、8號菌株菌絲未萌發(fā)生長，35 ℃下10 d后將平板重新置于25 ℃下48 h后菌絲可重新萌發(fā)生長，表明35 ℃并未使1號、2號、3號、4號、5號、6號、8號菌株秀珍菇菌株死亡，僅是溫度過高，抑制其萌發(fā)生長。25～30 ℃條件下秀珍菇菌株生長速度最快，但其極差值較大,不具有穩(wěn)定性(圖8)，得知其不穩(wěn)定性有菌株差異導(dǎo)致，其對單一菌株具有較高的穩(wěn)定性，因此,25～30 ℃為秀珍菇發(fā)菌最好的溫度范圍(表6)；10號、11號菌株具較高的生長速度，但11號菌株極差值低于10號菌株，既11號菌株的穩(wěn)定性優(yōu)于10號菌株，通過表6可知11號菌株在不同溫度的平均生長速度顯著優(yōu)于10號菌株，因此，11號菌株為溫度范圍適應(yīng)性最好的菌株(圖9)。

2.6 不同秀珍菇菌株的栽培

11個菌株在統(tǒng)一的栽培條件下均能正常出菇，但萌發(fā)時間、發(fā)菌時間和采收間隔各不相同。其中菌株6號、10號、11號萌發(fā)時間、發(fā)菌時間較短，采收間隔期較短，生育期比較一致，菌蓋顏色均為淺灰白色，為秀珍菇市場認(rèn)可度較高的顏色(表7)。

圖8 不同溫度對秀珍菇菌絲生長的影響Fig.8 Effects of different temperature on the mycelium growth of Pleurotus pulmonarius

圖9 不同秀珍菇菌株溫度的適應(yīng)性Fig.9 Adaptability of different strains of Pleurotus pulmonarius to temperatures

表6 不同溫度對秀珍菇菌絲生長的影響Tab.6 Effect of different temperatures on the mycelia growth of Pleurotus pulmonarius

表7 不同秀珍菇菌株栽培出菇特性Tab.7 Effect of different strains on characteristics cultivation growth

3 結(jié)論與討論

不同的食用菌菌株有不同的營養(yǎng)偏好，且具有不同的生物學(xué)特性，廣泛培養(yǎng)可選擇通用的PDA培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，單一品種培養(yǎng)時應(yīng)選擇對其菌株最適的培養(yǎng)基進行專一培養(yǎng)。

通過對碳源、氮源、pH、溫度、農(nóng)藝性狀測定試驗表明，秀珍菇菌株的最適碳源為葡萄糖，與郭煒等對秀珍菇菌絲生長最適碳源一致；在秀珍菇菌絲對碳源的利用中，單糖效果優(yōu)于二糖和多糖，與多數(shù)大型真菌碳源選擇上一致，醛糖優(yōu)于酮糖，可能是由于葡萄糖和果糖在秀珍菇中的代謝方式不一樣導(dǎo)致的，具體原因有待進一步研究。

秀珍菇的最適氮源為豆粉和硝酸鈉，郭煒等研究的最適氮源為蛋白胨，在本研究中蛋白胨在5、8、10三個菌株中與其試驗結(jié)果一致，表明蛋白胨為部分秀珍菇菌株的最適氮源，但其在不同的秀珍菇菌株的適應(yīng)性不同，在不考慮硝酸鈉和尿素的情況下，有機氮明顯優(yōu)于無機氮，與前人試驗結(jié)果基本一致，可能是由于有機氮源中含維生素、蛋白質(zhì)(氨基酸)等物質(zhì)，對菌絲生長具較好的促進作用。在不同pH值的培養(yǎng)基中培養(yǎng)可以看出秀珍菇最適為pH值為9，故秀珍菇菌絲在偏堿性條件下生長較好。

以往類似的研究多為單一菌株的生物學(xué)特性研究，可明確得出單一菌株的最適培養(yǎng)條件；本研究同時比較同一菌株不同品種的生物學(xué)特性，明確了11個品種最適的培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基組成，同時探明了廣適性的培養(yǎng)基組成。在不明確其最適培養(yǎng)基的情況下，可選擇葡萄糖作為最適碳源，豆粉作為最適氮源，初始pH值為9的培養(yǎng)基來培養(yǎng)不同品種的秀珍菇。本研究得到11號菌株在碳源、氮源、pH、溫度的適應(yīng)型上均屬良好，其生物活性好，出菇產(chǎn)量穩(wěn)定，可作為廣適性品種進行示范推廣。下一步將以11號菌株為主要推廣對象進行小試和中試，進一步完善配套的栽培和管理技術(shù)。

本研究通過11株不同的秀珍菇菌株驗證了不同的菌株最適培養(yǎng)條件具有明顯差異，試驗結(jié)果表明，同一食用菌物種的不同品種具明顯生物學(xué)特性差異，且本身的生物學(xué)特性不同，因此我們可以明確每一個生產(chǎn)用品種，為使其發(fā)菌階段良好、具有較好的活性，篩選其最適培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基是必要的研究內(nèi)容。