夏明亮，任川川，李云龍，朱海松，張超 ，李軍

前列腺癌是因前列腺上皮細胞惡性增生引起的惡性腫瘤，可引起男性患者排尿異常、盆腔不適和陰莖勃起障礙，其發(fā)病機制尚未完全闡明，目前認為年齡、遺傳、環(huán)境、肥胖等因素可能與前列腺癌發(fā)病有關[1]。早期前列腺癌患者可以通過根治術或者根治性放療等方式進行治療，但大部分前列腺癌早期患者臨床癥狀不明顯，導致確診時病情已經惡化，甚至病灶已經擴展至前列腺外，導致傳統(tǒng)治療方式無法取得預想治療效果[2-3]。因此，探究前列腺發(fā)病機制對提高靶向治療、免疫檢查點治療等具有重要意義。叉頭框蛋白（forkhead box protein，F(xiàn)OX）家族涵蓋多種轉錄因子，這些轉錄因子參與細胞增殖、分化等過程，F(xiàn)OX家族成員具有多種DNA結合域，從而引起轉錄抑制或激活[4]。叉頭框蛋白O（forkhead box protein O，F(xiàn)OXO）是FOX家族的亞組，在細胞增殖、活性、應激反應中發(fā)揮重要作用，叉頭框 轉 錄 因 子 O3a（forkhead box O3a，F(xiàn)OXO3a）是FOXO成員之一。FOXO3a不僅參與胚胎、組織細胞發(fā)育進程[5]，還參與細胞凋亡、增殖、免疫應答[6]、DNA損傷等生理過程，廣泛參與多種疾病發(fā)生和進展，其中包括乳腺癌、肝癌、結腸癌、膀胱癌、前列腺癌和鼻咽癌等惡性腫瘤。FOXO3a在癌細胞系中常因其基因突變或蛋白胞質隔離而失活，其蛋白失活與癌癥發(fā)生、進展具有密切關系，F(xiàn)OXO3a表達水平異?？梢杂绊懩[瘤細胞增殖、侵襲性、上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），有學者[7]認為FOXO3a在正常生理和癌癥進展中的作用對研制有效的治療策略產生巨大挑戰(zhàn)?；诖耍狙芯孔?020年1―8月通過構建FOXO3a過表達前列腺癌細胞系，旨在探討FOXO3a對前列腺癌細胞EMT的影響及其可能作用機制，希望能為前列腺癌治療策略提供參考價值。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

1.1.1 材料 pcDNA-FOXO3a、pcDNA-NC均由上海吉瑪制藥技術有限公司設計和構建，人正常前列腺上皮細胞RWPE-1和前列腺細胞系LNCaP、DUl45、PC-3均由美國典型菌種保藏中心提供。

1.1.2 試劑 SFM培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司，RPMI 1640培養(yǎng)基購自拿大Life Technologies公司，Lipofecamine TM2000脂質轉染試劑、TRIzol試劑盒、反轉錄試劑盒購自美國ThermoFisher公司，SYBR PCR Master Mix試劑盒購自日本TOYOBO公司，Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司，細胞活性噻唑藍（MTT）試劑盒購自北京美科美生物技術開發(fā)有限公司，鈣黏附蛋白E（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、神經型鈣黏附蛋白（N-cadherin）、c-Myc、細胞周期蛋白D1（cyclin D1）、Bcl-2相關X（Bax）、B細胞淋巴瘤-2（Bcl-2）、Wnt1抗體購自武漢益普生物科技有限公司，剪切型胱天蛋白酶-3（Cleaved-Cas-3）抗體購自愛必信（上海）生物科技有限公司，Snail、β-連環(huán)蛋白（β-catenin）抗體購自上海恒斐生物科技有限公司，辣根過氧化物酶（HRP）羊抗兔IgG、HRP羊抗鼠IgG購于美國Thermo公司，細胞裂解液、ECL化學發(fā)光試劑個購自北京索萊寶科技有限公司。

1.1.3 儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱購自日本SanYo公司，電泳儀購自美國Bio-red，凝膠成像系統(tǒng)購自以色列DNR公司，逆轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）儀購自美國Thermo公司，SpectraMax iD3多功能酶標儀購自美國Molecular Devices公司，DMi8-電動熒光顯微鏡購自奧地利徠卡，Aurora 3～5 L流式細胞儀購自美國Cytek Biosciences公司，相關儀器耗材購于德國eppendorf公司，transwell小室、細胞劃痕組件、相關耗材購于北京索萊寶科技有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)RWPE-1細胞置于K-SFM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，LNCaP、DUl45、PC-3細胞置于RPMI 1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）培養(yǎng)，二氧化碳培養(yǎng)箱條件為37℃、5%二氧化碳飽和濕度，隔天換液，細胞融合度達75%時進行傳代，細胞傳代3次達穩(wěn)定狀態(tài)時用于研究。

1.3 RT-PCR依據(jù)TRIzol試劑盒提取細胞的總RNA，檢測RNA濃度和純度，運用cDNA反轉錄試劑盒進行第一條鏈cDNA合成，采用SYBR PCR Master Mix對細胞中的FOXO3a水平進行檢測，PCR程序參數(shù)設置參考試劑盒說明書，95℃30 s，95℃5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 10 s，42個循環(huán)，以U6作為內參基因，采用 2-ΔΔCt法分析待測基因表達量[8]，所用引物均由上海生工提供。RT-PCR結果顯示LNCaP、DUl45、PC-3細胞中FOXO3a水平均呈顯著降低，并且其中LNCaP細胞中FOXO3a水平是3個前列腺癌細胞系中最低，由此選擇LNCaP細胞系作為后續(xù)細胞轉染材料。

1.4 細胞轉染調整對數(shù)生長期LNCaP細胞濃度為1×106/mL，取2 mL細胞懸浮液置于6孔板中，采用不含血清的培養(yǎng)基于37℃，5%二氧化碳培養(yǎng)至細胞密度達到60%，然后采用參照LipofecamineTM2000試劑說明書將pcDNA-FOXO3a、pcDNANC轉染至LNCaP細胞中并分別記為FOXO3a過表達細胞系（pc-FOXO3a）和陰性對照（NC），未進行轉染的LNCaP細胞記為Control。轉染48 h后，收集各組細胞，并采用RT-PCR炎癥為FOXO3a表達水平，步驟同1.3。

1.5 細胞活性檢測采用MTT法檢測LNCaP細胞活性，以1×106/mL、每孔100 μL方式接種96孔板于1.2細胞培養(yǎng)條件培養(yǎng)48 h，然后加入0.5 g/L MTT溶液（每孔 100 μL），培養(yǎng) 4 h，吸棄上清液再加入DMSO（每孔200 μL）孵育30 min，多功能酶標儀波長570 nm處檢測各孔吸光值（A值），計算細胞存活率，細胞存活率=（實驗組的A值-空白孔A值）/（對照組的A值-空白孔A值）×100%。

1.6 流式細胞檢測細胞凋亡采用Annexin VFITC/PI雙染流式細胞法檢測LNCaP細胞凋亡情況，將細胞以5×105/mL、每孔 400 μL方式接種至6孔板，培養(yǎng)條件和時間同1.5，收集細胞，1 000 r/min、5 min，PBS洗滌2遍，棄上清液，加入300 μL 1×Binding Buffer，重懸 細胞 ，加 入 5 μL Annex-inV/FITC、10μl PI混合，室溫避光孵育15 min，流式細胞儀上樣，CellQuest軟件統(tǒng)計分析細胞凋亡率。

1.7 細胞侵襲實驗調整pc-FOXO3a、NC、Control LNCaP細胞密度為1×105/mL，Transwell小室預先用Matrigel膠包被，下層加入含血清培養(yǎng)基，將LNCaP細胞轉至上層無血清培養(yǎng)，每組3個復孔，37℃，5%二氧化碳孵育培養(yǎng)48 h，無菌棉簽擦去小室內未侵襲的細胞，結晶紫染色侵襲至下層細胞，每孔采用隨機數(shù)字表法選取7個視野統(tǒng)計計數(shù)，實驗至少重復3次。

1.8 細胞劃痕將劃痕實驗插件置于24孔板，調整 pc-FOXO3a、NC、Control LNCaP 細胞量為 5×105個，同1.2細胞培養(yǎng)條件孵育過夜（約16 h），小心移去劃痕實驗插件，用完全培養(yǎng)基潤洗3次，加入10 μmol/L絲裂霉素，孵育2 h，更換新鮮完全培養(yǎng)基，顯微鏡下計時拍照，首次拍照為0 h，繼續(xù)培養(yǎng)24 h拍照分析細胞的遷移情況。

1.9 蛋白質印跡法（Western blotting）檢測收集1.5、1.6中的細胞置于1.5 mL離心管，加入細胞裂解液冰浴裂解30 min，取上清液用于細胞總蛋白提取，Bradford法調整蛋白濃度一致性，經過12%SDSPAGE電泳分離、濕轉法將蛋白轉至硝酸纖維素膜上，4℃條件依次加入封閉液孵育2 h，加入Bax、Bcl-2、E-cadherin、Vimentin、N-cadherin、c-Myc、cyclin D1、Wnt1、Cleaved-Cas-3、Snail、β-catenin 一抗孵育過夜（稀釋比例均為1∶1 000），TBST漂洗40 min，二抗孵育2 h（稀釋比例均為1∶5 000），ECL化學發(fā)光試劑顯色，在凝膠成像系統(tǒng)檢測分析蛋白條帶，用Image J對蛋白質條帶進行半定量分析目標條帶灰度值。

1.10 氯化鋰作用于pc-FOXO3a LNCaP細胞細胞培養(yǎng)條件同1.2，調整pc-FOXO3a LNCaP細胞密度為1×106/mL，接種96孔板、每孔100 μL，預培養(yǎng)24 h，向細胞培養(yǎng)基中加入氯化鋰（Wnt/β-catenin信號通路激活劑）是其終濃度為25 mmol/L（LiCl-pc-FOXO3a），對照組pc-FOXO3a LNCaP細胞（LiCl-pc-FOXO3a-Ctrl）中加入等體積的二甲基亞砜（DMSO），繼續(xù)培養(yǎng)24 h，采用1.5～1.9法分析細胞活性、凋亡和上皮間質轉換（EMT）情況。

1.11 統(tǒng)計學方法用統(tǒng)計軟件GraphPad Prism 5對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以±s表示，組間差異用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用SNK-q檢驗的方法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 FOXO3a在 RWPE-1、LNCaP、DUl45、PC-3細胞中表達情況通過RT-PCR檢測結果顯示LNCaP、DUl45、PC-3細胞中的FOXO3a表達量顯著低于RWPE-1（P<0.05），并且LNCaP細胞在3種前列腺癌細胞系中FOXO3a表達量最低（表1）。

表1 RWPE-1、LNCaP、DUl45、PC-3細胞中FOXO3a表達水平/±s

表1 RWPE-1、LNCaP、DUl45、PC-3細胞中FOXO3a表達水平/±s

注：①與RWPE-1比較，P<0.05。

細胞系 重復次數(shù)FOXO3a RWPE-13 1 LNCaP30表達水平（2-ΔΔCt）DUl453 PC-33 F值P值.02±0.08.23±0.04①0.53±0.05①0.42±0.06①289.87 0.000

2.2 FOXO3a過表達對LNCaP細胞活性和凋亡的影響通過RT-PCR檢測結果pc-FOXO3a LNCaP細胞中的 FOXO3a表達量（6.35±0.14）顯著高于 NC LNCaP細胞（1.01±0.05）（P<0.05），表明FOXO3a過表達LNCaP細胞構建成功。pc-FOXO3a LNCaP細胞和LiCl-pc-FOXO3a-Ctrl LNCaP細胞的活性和Bcl-2水平顯著低于NC LNCaP細胞（P<0.05），而細胞凋亡率、Cleaved-Cas-3和Bax水平顯著高于NC LNCaP細胞（P<0.05）；LiCl-pc-FOXO3a LNCaP細胞活性和Bcl-2水平顯著高于LiCl-pc-FOXO3a-Ctrl LNCaP細胞（P<0.05），而細胞凋亡率、Cleaved-Cas-3和Bax水平顯著低于LiCl-pc-FOXO3a-Ctrl LNCaP細胞（P<0.05）（表2，表3，圖1）。

表2 FOXO3a過表達對LNCaP細胞活性和凋亡的影響/（%，±s）

表2 FOXO3a過表達對LNCaP細胞活性和凋亡的影響/（%，±s）

注：①與NC比較，P<0.05。②與pc-FOXO3a比較，P<0.05。

重復次數(shù)3 3 3 3 3組別control NC pc-FOXO3a LiCl-pc-FOXO3a LiCl-pc-FOXO3a-Ctrl F值P值細胞存活率100.00±0.00 100.00±0.00 57.65±4.59①78.58±5.14②58.32±4.98①274.78 0.000凋亡率1.19±0.32 1.20±0.34 48.63±5.11①23.98±5.04②48.52±4.92①332.67 0.000

表3 FOXO3a過表達對LNCaP細胞中Cleaved-Cas-3、Bax、Bcl-2蛋白表達的影響/±s

表3 FOXO3a過表達對LNCaP細胞中Cleaved-Cas-3、Bax、Bcl-2蛋白表達的影響/±s

注：Cleaved-Cas-3為剪切型胱天蛋白酶-3，Bax為Bcl-2相關X，Bcl-2為B細胞淋巴瘤-2。①與NC比較，P<0.05。②與pc-FOXO3a比較，P<0.05。

組別 重復次數(shù)Bax Bcl-2 Cleaved-Cas-3 0.22±0.03 0.23±0.04 0.82±0.06①0.49±0.05②0.81±0.05①3 3 3 3 3 0.23±0.04 0.21±0.04 0.76±0.05①0.42±0.09②0.78±0.05①1.18±0.06 1.19±0.05 0.35±0.05①0.76±0.05②0.36±0.05①570.01 0.000 control NC pc-FOXO3a LiCl-pc-FOXO3a LiCl-pc-FOXO3a-Ctrl F值P值353.64 0.000 212.16 0.000

圖1 Western blotting檢測LNCaP細胞凋亡率及凋亡蛋白表達

2.3 FOXO3a過表達對LNCaP細胞侵襲、遷移能力的影響pc-FOXO3a LNCaP細胞和LiCl-pc-FOXO3a-Ctrl LNCaP細胞的單個視野細胞侵襲數(shù)目、劃痕遷移率顯著低于NC LNCaP細胞（P<0.05），LiCl-pc-FOXO3a LNCaP細胞單個視野細胞侵襲數(shù)目、劃痕遷移率顯著高于LiCl-pc-FOXO3a-Ctrl LNCaP細胞（P<0.05）（表4）。

表4 FOXO3a過表達對LNCaP細胞侵襲、遷移的影響/±s

表4 FOXO3a過表達對LNCaP細胞侵襲、遷移的影響/±s

注：①與NC比較，P<0.05。②與pc-FOXO3a比較，P<0.05。

組別劃痕遷移率/%重復次數(shù)單個視野細胞侵襲數(shù)control NC pc-FOXO3a LiCl-pc-FOXO3a LiCl-pc-FOXO3a-Ctrl F值P值82.36±4.25 82.41±4.36 42.12±5.14①67.87±5.63②43.21±5.01①149.75 0.000 3 3 3 3 3 95.65±2.35 95.12±3.62 62.49±5.08①79.65±4.88②62.98±5.33①124.14 0.000

2.4 FOXO3a過表達對LNCaP細胞中EMT相關蛋白水平的影響pc-FOXO3a LNCaP細胞和LiClpc-FOXO3a-Ctrl LNCaP細胞Vimentin、N-cadherin、Snail、c-Myc、cyclin D1水平顯著低于NC LNCaP 細胞（P<0.05），而E-cadherin水平顯著高于NC LNCaP細胞（P<0.05）；LiCl-pc-FOXO3a LNCaP細胞 imentin、N-cadherin、Snail、c-Myc、cyclin D1水平顯著高于LiCl-pc-FOXO3a-Ctrl LNCaP細胞（P<0.05），而 E-cadherin水平顯著低于LiCl-pc-FOXO3a-Ctrl LNCaP細胞（P<0.05）（表5，圖2）。

表5 FOXO3a過表達對LNCaP細胞中EMT相關蛋白水平的影響/±s

表5 FOXO3a過表達對LNCaP細胞中EMT相關蛋白水平的影響/±s

注：E-cadherin為鈣黏附蛋白E，Vimentin為波形蛋白，N-cadherin為神經型鈣黏附蛋白，cyclin D1為細胞周期蛋白D1。①與NC比較，P<0.05。②與pc-FOXO3a比較，P<0.05。

組別control NC pc-FOXO3a LiCl-pc-FOXO3a LiCl-pc-FOXO3a-Ctrl F值P值cyclin D1 0.98±0.04 0.99±0.03 0.18±0.03①0.68±0.04②0.19±0.03①1234.30 0.000重復次數(shù)3 3 3 3 3 E-cadherin 0.20±0.03 0.21±0.04 0.91±0.05①0.62±0.05②0.92±0.06①513.93 0.000 Vimentin 1.09±0.04 1.08±0.04 0.31±0.05①0.72±0.04②0.32±0.05①681.11 0.000 N-cadherin 1.16±0.05 1.17±0.05 0.22±0.04①0.81±0.05②0.23±0.04①940.25 0.000 Snail 0.98±0.04 1.01±0.05 0.15±0.04①0.51±0.05②0.16±0.04①814.45 0.000 c-Myc 1.24±0.05 1.25±0.05 0.26±0.03①0.76±0.05②0.25±0.03①1185.82 0.000

圖2 Western blotting檢測EMT相關蛋白表達

2.5 FOXO3a過表達對LNCaP細胞中Wnt/βcatenin信號通路的影響Western blot檢測結果顯示pc-FOXO3a LNCaP細胞中的β-catenin、Wnt1水平顯著低于NC LNCaP細胞（P<0.05）（表6，圖3）。

表6 FOXO3a過表達對LNCaP細胞中Wnt/β-catenin信號通路的影響/±s

表6 FOXO3a過表達對LNCaP細胞中Wnt/β-catenin信號通路的影響/±s

注：①與NC比較，P<0.05。

組別control NC pc-FOXO3a F值P值Wnt 1.10±0.06 1.07±0.05 0.52±0.06①296.81 0.000重復次數(shù)3 3 3 β-catenin 1.05±0.05 1.09±0.06 0.62±0.06①189.00 0.000

圖3 Western blotting檢測Wnt、β-catenin信號通路蛋白表達

3 討論

FOXO3a是由110AA折疊形成的ɑ螺旋（3個）與翅膀形狀答環(huán)結（2個）DNA結合域，F(xiàn)OX03a在多種生物中均有分布，小鼠該基因定位于10號染色體，人類該基因定位于6號染色體。FOXO3a可以通過調控下游靶基因參與自噬、凋亡、細胞分化、免疫應答等多種生理過程，還參與乳腺癌、肝癌、前列腺癌等惡性腫瘤發(fā)病有關。近年來研究表明FOXO3a在多種癌癥疾病中起著抑癌作用，在癌細胞系中可表現(xiàn)為基因突變或其蛋白胞質隔離失活，此狀態(tài)與癌癥發(fā)生、進展有關[9]。本研究通過RT-PCR檢測正常前列腺上皮細胞RWPE-1和前列腺癌不同細胞系（LNCaP、DUl45、PC-3）中FOXO3a表達量，發(fā)現(xiàn)LNCaP、DUl45、PC-3細胞中FOXO3a表達量均顯著低于RWPE-1細胞，并且LNCaP細胞中的FOXO3a表達量降低最顯著，本研究結果與前人研究趨勢相似，表明FOXO3a表達異常可能參與前列腺癌發(fā)病過程。

本研究通過構建FOXO3a表達升高LNCaP細胞系，發(fā)現(xiàn)pc-FOXO3a LNCaP細胞活性降低，而細胞凋亡率升高，表明FOXO3a表達升高可以降低前列腺癌LNCaP細胞活性，促進細胞凋亡。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)pc-FOXO3a LNCaP細胞中的cyclin D1、Bcl-2水平顯著減低，而Cleaved-Cas-3、Bax水平顯著升高。Caspases-3位于Caspases級聯(lián)反應的末端，在Caspases介導凋亡途徑中充當執(zhí)行者[10]。Bcl-2可抑制DNA損傷產生的細胞凋亡信號活化，是線粒體膜電位發(fā)生變化，阻礙氧自由基、脂質過氧化物合成，負向調控細胞凋亡[11-12]。Bax是對細胞膜通透性具有增強效果的Bcl-2相關蛋白，對Caspases級聯(lián)反應中相關因子有活化作用，促進細胞凋亡級聯(lián)反應進行，Bax、Bcl-2在正常生理條件下處于動態(tài)平衡狀態(tài)，其中比值能夠反應細胞凋亡情況[13-14]。β-arrestin1可以通過Akt、ERK1/2途徑抑制FOXO3a的轉錄活性，促進前列腺癌細胞增殖和EMT[15]。雌激素受體ERβ表達升高會促進細胞凋亡，推測是因為ERβ經轉錄調控FOXO3a表達量升高，F(xiàn)OXO3a可促進凋亡因子PUMA表達上調，從而激活線粒體、Caspase級聯(lián)介導的凋亡活化，從而促進細胞凋亡[16]。cyclin D1為細胞周期蛋白，參與細胞周期運行過程，與CDK4結合后活化誘導細胞從G1期進入S期，在細胞增殖過程中起著促進作用，由此推測FOXO3a表達升高降低LNCaP細胞活性可能與降低cyclin D1表達細胞周期正常運轉有關，其中機制還需深入研究。

FOXO3a在多種惡性腫瘤中呈現(xiàn)出表達量降低趨勢，其失活可促進腫瘤細胞EMT，對腫瘤細胞侵襲、轉移有促進效果，認為FOXO3a有望成為惡性腫瘤預后、腫瘤轉移的生物標志生物[17]。正常的上皮細胞為單層并由粘附蛋白固定，防止細胞移動，而在惡性腫瘤進展過程中，上皮細胞可以進行EMT，EMT 在肺癌[18]、宮頸癌[19]、胃癌[20]、乳腺癌[21]、前列腺癌[22]等惡性腫瘤進展中起著重要作用，促進腫瘤細胞向病灶外轉移。當細胞發(fā)生EMT時，上皮細胞標志物E-鈣黏蛋白（E-cadherin）表達水平降低，而間質細胞標志物N-鈣黏蛋白（N-cadherin）以及波形蛋白（Vimentin）的表達含量升高[23]。Snail蛋白為EMT過程中的關鍵調控因子，與許多腫瘤EMT的發(fā)生發(fā)展密切相關[24]。本研究結果發(fā)現(xiàn)pc-FOXO3a LNCaP細胞的侵襲和遷移能力、N-cadherin、Vimentin、Snail、c-Myc水平降低，而E-cadherin水平升高，由此表明FOXO3a表達升高會抑制LNCaP細胞的侵襲能力，可能與影響EMT相關蛋白水平有關。

已有文獻[25]表明FOXO可以協(xié)調多種EMT相關通路或相關轉錄因子參與EMT調節(jié)過程。Wnt/β-catenin信號通路參與調控胚胎發(fā)育、組織器官形成以及多種疾病發(fā)病過程，其在多種惡性腫瘤中常處于激活狀態(tài)，并且與惡性腫瘤的EMT存在密切關系[26]。本研究結果顯示pc-FOXO3a LNCaP細胞的β-catenin、Wnt1水平顯著降低，Wnt1是 Wnt/βcatenin信號通路胞外調控的重要蛋白，β-catenin主要參與細胞內信號傳遞過程[27]，由此表明FOXO3a表達升高可能會影響Wnt/β-catenin信號通路活化。有研究[28]表明沉默F(xiàn)OXO3a可誘導鼻咽癌細胞的EMT和Wnt/β-catenin信號通路激活，增強鼻咽癌細胞的放射抵抗，還有學者[29]認為FOXO3a可以調節(jié)Wnt/β-catenin信號通路并對EMT產生抑制作用。為了驗證FOXO3a表達升高是否會抑制Wnt/βcatenin信號通路激活，本研究采用Wnt/β-catenin信號通路激活劑（LiCl）[30]作用 pc-FOXO3a LNCaP 細胞，發(fā)現(xiàn)LiCl可以緩解FOXO3a表達升高引起的細胞活性和侵襲能力降低、細胞凋亡增加，并對凋亡相關蛋白水平和EMTC相關蛋白水平也存在一定緩解作用。由此表明，F(xiàn)OXO3a表達升高可能通過抑制Wnt/β-catenin信號通路活化從而抑制前列腺LNCaP細胞的EMT。

綜上所述，F(xiàn)OXO3a表達升高可降低前列腺癌LNCaP細胞活性、促進細胞凋亡，可能與調節(jié)c-Myc、cyclin D1、Cleaved-Cas-3、Bax、Bcl-2水平有關；FOXO3a表達升高還可降低前列腺癌LNCaP細胞侵襲和遷移能力，可能與提高E-cadherin水平，降低Vimentin、N-cadherin、Snail水平以及抑制 Wnt/βcatenin信號通路活化有關。本研究觀點是通過體外細胞實驗所得，在動物體內是否存在相似趨勢尚不清楚，還需深入研究。