盧仁泉，柳光宇，楊文濤，郭 林，關 明，邵志敏，徐大志，倪 明，唐 峰，王朝夫，婁加陶，孫奮勇，邢金良，潘躍銀

乳腺癌患者中20%～30%人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）陽性，該類型乳腺癌具有惡性程度高、侵襲性強、預后差等特點?？笻ER2靶向藥物能有效地降低HER2陽性乳腺癌患者復發(fā)和轉移的風險，延長生存期，改善預后［1］，HER2狀態(tài)是乳腺癌重要的預后評估指標和抗HER2治療選擇的主要預測指標。眾多國內(nèi)外指南和共識［2-7］均推薦可獲取腫瘤組織的乳腺癌患者采用免疫組織化學法（immunohistochemistry，IHC）檢測HER2受體蛋白的水平，采用熒光原位雜交法（fluorescencein situhybridization，F(xiàn)ISH）檢測HER2基因的擴增水平。

但由于腫瘤的時空異質性廣泛存在，腫瘤組織的取樣可能造成組織檢測結果不能反映腫瘤全貌，僅對主要病灶進行IHC檢測可能影響部分患者的治療決策［8-9］。部分組織樣本不可得的晚期乳腺癌患者，由于無法進行組織活檢，亦可能錯過靶向治療的機會。另外，組織樣本處理欠規(guī)范、IHC和FISH檢測技術自身的挑戰(zhàn)也可能導致組織檢測出現(xiàn)假陰性結果，從而導致這部分患者無法接受靶向治療并從中獲益［10-11］。循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）能夠反映短時間內(nèi)的體內(nèi)腫瘤負荷，實時、動態(tài)監(jiān)測藥物療效，可作為組織樣本檢測的有效補充，有助于避免由于腫瘤異質性帶來的組織樣本檢測假陰性結果，并且由于液體活檢樣本易獲取，對于不能獲取組織樣本的晚期乳腺癌患者，可通過ctDNA進行療效的動態(tài)監(jiān)測和管理，優(yōu)化治療方案，對緩解晚期乳腺癌患者的臨床癥狀、延長生存期及改善生活質量有重要意義［12-14］。

從大量循環(huán)游離DNA（circulating-free DNA，cfDNA）、血細胞中篩選出腫瘤相關DNA存在一定難度，數(shù)字聚合酶鏈反應（digital polymerase chain reaction，dPCR）是近年來發(fā)展起來的一種定量分析技術，該技術具有靈敏度高、特異度高和絕對定量的優(yōu)勢［7，15-16］，外周血HER2基因檢測（dPCR法）作為一種輔助診斷的手段，有望使更多的患者從靶向治療中獲益。結合最新的研究數(shù)據(jù)和理念，專家就HER2基因擴增檢測（dPCR法）在乳腺癌治療中使用的目的與適應證、操作規(guī)范與質控標準、臨床價值與展望等方面的熱點問題進行深入研討，聯(lián)合發(fā)布本共識，旨在讓臨床醫(yī)師更好地利用HER2基因檢測（dPCR法）結果，使更多患者從HER2靶向治療中獲益。

1 HER2基因擴增檢測（dPCR法）的目的與適應證

1.1 HER2基因擴增檢測（dPCR法）的目的

專家組首先明確了在當前臨床實踐中，外周血HER2基因擴增檢測（dPCR法）應從實際的臨床需求出發(fā)，以為組織檢測提供有效補充為目的。HER2基因擴增檢測（dPCR法）具有較高的檢測準確度和精密度：使用HER2基因擴增檢測試劑盒（dPCR法）檢測HER2基因擴增系列參考品的結果與其預期拷貝數(shù)的線性相關系數(shù)R=0.999 9，系列參考品檢測結果的變異系數(shù)均不超過3%［15］。其檢測結果能準確地反映HER2狀態(tài)，適用于乳腺癌患者伴隨診斷和動態(tài)監(jiān)測。

1.2 適合進行HER2基因擴增檢測（dPCR法）的對象

HER2基因擴增檢測試劑盒（dPCR法）可用于乳腺癌患者抗HER2治療的伴隨診斷和抗HER2治療過程中的動態(tài)監(jiān)測。此外，也適用于其他腫瘤患者抗HER2治療的檢測需求，檢測樣本類型為組織和外周血樣本，具體如下。

1.2.1 組織樣本檢測結果陰性或組織樣本不可得的初治晚期或復發(fā)轉移乳腺癌患者，可使用HER2基因擴增檢測試劑盒（dPCR法）檢測外周血樣本中的HER2基因狀態(tài)

由于腫瘤的時空異質性，組織樣本HER2檢測的陰性結果也許并不能反映腫瘤的全貌?；仡櫺匝芯浚?7］表明，HER2在乳腺癌原發(fā)灶和轉移灶中表達的不一致率高達18.7%，這種情況在腫瘤較大或體內(nèi)存在多個腫瘤的情況下更為明顯，在發(fā)生遠處轉移的乳腺癌患者中，HER2擴增狀態(tài)在原發(fā)灶和轉移灶之間的不一致率高達30.0%［10，17］。且原發(fā)灶HER2檢測結果陰性，后續(xù)HER2檢測結果為陽性的患者，在基礎治療方案上增加了抗HER2的靶向治療后，其無病生存期（disease-free survival，DFS）顯著長于對照組（P＜0.000 1）［18］。另外，Neratinib的一項Ⅱ期單臂臨床試驗［19］結果顯示，從轉移性乳腺癌患者ctDNA中檢測HER2基因狀態(tài)，與組織檢測結果相比，其靈敏度可達79%，特異度為100%。這不僅說明腫瘤液體活檢的必要性，也是腫瘤液體活檢測檢作為伴隨診斷的有力證據(jù)。液體活檢較傳統(tǒng)的組織活檢具有良好的依從性、標本易獲取、檢測周期短、可進行動態(tài)監(jiān)測的優(yōu)勢［13］。對于組織結果陰性或組織不可得的初治晚期或復發(fā)轉移乳腺癌患者，推薦在ctDNA中檢測基因突變的情況，有助于患者獲得更準確的伴隨診斷結果，進行動態(tài)管理及尋找可能的治療方案［12］。

HER2基因擴增檢測（dPCR法）最新臨床研究結果［20］顯示，晚期乳腺癌患者外周血樣本dPCR檢測結果與同源組織樣本IHC聯(lián)合FISH的檢測結果的陽性符合率可達43.75%，陰性符合率為84.38%，總符合率為66.96%。組織檢測結果陰性的部分樣本中有15.87%的外周血樣本檢測結果為陽性（表1）。將患者分為初診Ⅲ期、初診Ⅳ期和復發(fā)轉移3組，3組患者ctDNA dPCR檢測結果與同源組織樣本IHC聯(lián)合FISH檢測結果的一致性（表2）：檢測靈敏度由初診Ⅲ期受試者的37.93%上升到初診Ⅳ期的41.67%，復發(fā)轉移受試者的靈敏度最高，為51.61%，表明受試者體內(nèi)腫瘤負荷情況會影響外周血檢測結果，腫瘤負荷越高，外周血檢測靈敏度越高。dPCR檢測特異度由初診Ⅲ期受試者的92.68%降到初診Ⅳ期的85.96%，復發(fā)轉移受試者的特異度最低，為67.86%。由此可見，由于腫瘤的空間異質性，對于復發(fā)轉移的患者，如果只選取單一或某些病變組織部位的樣本進行檢測也許并不能反映患者體內(nèi)整體的腫瘤基因表達情況，可能會造成片面的診斷結果。

表1 dPCR檢測外周血樣本結果與同源組織IHC聯(lián)合FISH檢測結果的一致性分析Tab.1 Consistency analysis between the results of peripheral blood samples detected by dPCR and the results of homologous tissue IHC combined with FISH

表2 不同疾病分期患者數(shù)字PCR檢測外周血樣本結果與同源組織IHC聯(lián)合FISH檢測結果的一致性分析Tab.2 Consistency analysis of peripheral blood samples detected by dPCR and homologous tissue IHC combined with FISH in patients with different disease stages

專家建議：①HER2基因擴增檢測試劑盒（dPCR法）與組織樣本檢測金標準（IHC聯(lián)合FISH）檢測對組織樣本檢測具有同等作用，同樣適用于乳腺癌患者組織樣本中HER2狀態(tài)的檢測。② 對于初治晚期（Ⅲ、Ⅳ期）的乳腺癌患者，組織檢測陰性或組織樣本不可得時，可使用HER2基因擴增檢測試劑盒（dPCR法）在外周血中進行檢測。術后復發(fā)或轉移乳腺癌患者，同樣可使用HER2基因擴增檢測試劑盒（dPCR法）在外周血中進行檢測，檢測結果為醫(yī)師提供參考，為患者尋找可能的治療方案，避免錯失治療時機。

1.2.2 有實時、動態(tài)監(jiān)測乳腺癌患者體內(nèi)HER2基因狀態(tài)或藥物療效需求的患者，可使用HER2基因擴增檢測試劑盒（dPCR法）檢測外周血樣本中HER2基因狀態(tài)

ctDNA能夠反映短時間體內(nèi)腫瘤負荷的變化，實時、動態(tài)監(jiān)測藥物療效，同時在保證高靈敏度和特異度的同時，能夠早于影像學評估病情進展時間，在HER2陽性患者的腫瘤負荷監(jiān)測、藥物療效監(jiān)測等方面發(fā)揮重要作用［5，21-22］。多項研究［19，22］證實，在ctDNA中檢測HER2基因狀態(tài)的可行性，并且在HER2靶向治療過程中，ctDNA中HER2擴增水平的變化與療效相關，且早于影像學評估的進展時間［15］。，提示HER2基因擴增檢測試劑盒（dPCR法）對ctDNA的檢測結果，評估進展的時間不晚于影像學評估的進展時間。

專家建議：①HER2基因擴增檢測（dPCR法）可用于多線治療的HER2陽性乳腺癌患者療效的動態(tài)監(jiān)測，為判斷患者能否從靶向治療中獲益提供參考。② 對于未行HER2靶向治療的HER2陰性患者，每個隨訪周期也可使用HER2基因擴增檢測試劑盒（dPCR法）在外周血中進行檢測，通過對ctDNA的監(jiān)測，盡早發(fā)現(xiàn)HER2基因擴增狀態(tài)，可為患者治療方案的管理提供參考。

1.2.3 適用于其他腫瘤患者抗HER2治療的檢測需求

胃癌是全球常見的惡性腫瘤，近年來，分子靶向治療的興起為胃癌患者提供了新的治療策略和方法［23］，對于HER2陽性的胃癌患者，抗HER2治療效果顯著優(yōu)于單純化療，且安全性好［24］。IHC和FISH是目前檢測胃癌患者組織樣本中HER2狀態(tài)的推薦方法［23］。HER2基因擴增檢測（dPCR法）臨床研究［25］中，261例胃癌受試者組織樣本dPCR檢測結果與組織樣本檢測金標準（IHC聯(lián)合FISH）檢測的一致性分析結果顯示，dPCR檢測的靈敏度達96.15%，特異度為94.26%，總體符合率分別為94.64%，提示胃癌患者組織樣本HER2基因擴增檢測（數(shù)字PCR法）與組織樣本檢測金標準具有同等效果。

抗體藥物偶聯(lián)物（antibody drug conjugate，ADC）型藥物DS-8201目前已經(jīng)被批準用于治療前期接受過兩種或兩種以上抗HER2治療的HER2陽性晚期復發(fā)轉移的乳腺癌、胃癌和肺癌患者的后線治療。DS-8201對于HER2陽性的乳腺癌、HER2低表達的乳腺癌、晚期胃癌、HER2表達的結直腸癌、HER2表達/突變的非小細胞肺癌和其他實體瘤等均療效顯著［26］。HER2基因擴增檢測（dPCR法）滿足相關腫瘤患者的HER2基因狀態(tài)檢測需求以及對DS-8201療效動態(tài)監(jiān)測的需求。

專家建議：①對于組織檢測陰性或復發(fā)轉移的胃癌患者，如臨床或病理學檢查認為有可能因樣品預處理過程等原因造成假陰性，可使用HER2基因擴增檢測試劑盒（dPCR法）在外周血中進行再次檢測。② 其他晚期多線治療的腫瘤患者，臨床有抗HER2治療的需求時，亦可使用HER2基因擴增檢測試劑盒（dPCR法）在組織和外周血中進行HER2基因狀態(tài)的檢測。

2 HER2基因擴增檢測（dPCR法）的操作規(guī)范與質控標準

2.1 檢測實驗室總體要求

開展HER2基因擴增檢測試劑盒（dPCR法）檢測HER2基因擴增的實驗室應符合中國國家衛(wèi)生健康委員會《臨床基因擴增檢驗實驗室工作規(guī)范》，原則上dPCR臨床檢測實驗室應分為3個隔開的工作區(qū)域：①試劑貯存和準備區(qū)，②標本制備區(qū)，③dPCR擴增區(qū)和擴增產(chǎn)物分析區(qū)。每一區(qū)域都應有專用的儀器設備。與上述特定實驗區(qū)有關的各個房間及設備物品必須有明確的標識，以避免不同工作區(qū)內(nèi)的設備物品，如加樣器、試劑等的移出或不同的工作區(qū)間發(fā)生混淆。進入各個工作區(qū)必須按單一方向進行，即從試劑貯存和準備區(qū)到標本制備區(qū)再到dPCR擴增區(qū)和擴增產(chǎn)物分析區(qū)。實驗室各區(qū)應制定相應標準操作規(guī)程和嚴格的質控文件。由省級臨床基因擴增實驗室驗收合格的實驗室方可進行試驗。

2.2 檢測流程及操作規(guī)范

HER2基因擴增檢測試劑盒（dPCR法）適用于HER2基因擴增的檢測，其檢測過程分為樣本采集、核酸純化及定量、dPCR檢測和出具報告4個階段。用戶需根據(jù)產(chǎn)品使用說明書針對整個操作流程形成標準操作流程（standard operation procedure，SOP）并對SOP進行驗證，驗證后對操作人員進行培訓后方可開展檢測。

2.2.1 樣本采集、保存及轉運

甲醛溶液固定、石蠟包埋組織樣本要求腫瘤含量不低于10%，需采用4%甲醛溶液固定，嚴格按照《臨床技術操作規(guī)范病理學分冊》進行石蠟包埋。每例樣本切5～10 μm的切片10張，其中1張切片用于確定腫瘤組織樣本中腫瘤細胞比例，可采用臨床常用方法；余下的1～9張切片用于提取樣本DNA。切片及刮取腫瘤組織過程中，要避免不同病例組織間的交叉污染。

外周血樣本由于常規(guī)采血管中cfDNA的半衰期僅2 h，需使用PAXgene Blood ccfDNA Tube（德國Qiagen公司）以保持cfDNA的穩(wěn)定。按使用說明書采集血樣，采集到血樣之后立即輕輕翻轉采血管混合8～10次。常溫條件下可以保存5 d。

2.2.2 核酸純化

核酸純化和定量應使用廠家使用說明書中推薦的、經(jīng)臨床驗證的產(chǎn)品，以保證提取到的核酸的純度及穩(wěn)定性。純化及定量過程因樣品量而異，通常為2～3 h。已純化的核酸建議當天進行定量和檢測，避免凍融。若核酸濃度較低，需濃縮后再行dPCR檢測。剩余核酸應在-20 ℃保存。

2.2.3 dPCR檢測

芯片式dPCR檢測包括檢測反應液的配制，上樣至dPCR芯片上并密封。PCR過程在平板式PCR擴增儀上完成，擴增時間約3 h。完成擴增的樣品在芯片閱讀儀上讀取結果。

核酸樣本的起始用量對于檢測結果的準確性和可靠性至關重要。在使用HER2基因擴增檢測試劑盒（dPCR法）檢測時，應使每個微孔中只獲得單個模板分子。故以5 ng DNA為核酸用量為佳［15］，在此上樣量下，目標區(qū)域的拷貝數(shù)在200～2 000拷貝/μL的范圍內(nèi)，這是dPCR定量精密度和準確度最高的區(qū)域。對于組織樣本檢測結果，當HER2基因拷貝數(shù)/內(nèi)參基因拷貝數(shù)比值＞1.8時，為HER2基因擴增（HER2檢測陽性）；對于外周血樣本檢測結果，當HER2基因拷貝數(shù)/內(nèi)參基因拷貝數(shù)比值＞1.3時，為HER2基因擴增（HER2檢測陽性）。

2.2.4 檢測結果分析報告

檢測過程中應使用HER2基因擴增檢測試劑盒（dPCR法）中的陽性和陰性質控品作為試劑盒性能驗證和操作流程的質控手段，以確保試劑滿足檢測要求及檢測過程的規(guī)范。

針對HER2基因擴增檢測試劑盒（dPCR法）檢測有對應的軟件實現(xiàn)閾值自動劃分、結果自動判讀，避免人工判讀帶來的偏差，保證結果的客觀性和一致性。分析軟件還包括嚴格的內(nèi)部質控條件，避免由于實驗操作或上樣量過低造成的結果偏差，可很好地保證臨床試驗樣本數(shù)據(jù)分析的精密度和準確度，滿足實驗人員直接上傳數(shù)據(jù)、下載檢測報告的需求。

檢測報告單的內(nèi)容應包括但不限于：

①患者基本信息：如患者姓名、性別、年齡、臨床診斷信息等；②樣本信息：樣本來源與類型、接收時間、報告時間等；③檢測信息：如檢測項目與位點、檢測技術和質控信息等；④檢測結果：樣本識別號、檢測基因名稱及被檢測的變異類型（如HER2基因擴增）、檢測結果（動態(tài)監(jiān)測結果為檢測信號比值，伴隨診斷檢測結果為陰性或陽性）；⑤檢測方法的局限性：檢測方法在樣本檢測中存在的局限性或不確定結果的可能性。

專家建議：臨床檢測實驗室應保證HER2基因擴增檢測（dPCR法）報告的充分性，包括但不限于患者及其樣本相關信息、檢測相關信息、結果及其臨床意義、局限性、準確性等，檢測基因類型和位點的變異情況、臨床意義、必要的參考文獻和可追溯性等。結果解釋的責任屬于臨床檢測實驗室，檢測結果在臨床決策中的應用應由臨床醫(yī)師或多學科專家討論決定。因dPCR手動操作時間少，為盡快為患者提供治療方案，建議從樣本接收到發(fā)出檢測報告的總時間不超過2個工作日。

2.3 質控標準

HER2基因擴增檢測試劑盒（dPCR法）用于檢測甲醛溶液固定、石蠟包埋組織樣本及外周血血漿樣本中HER2的擴增狀態(tài)。質控標準如下：

⑴ 甲醛溶液固定、石蠟包埋組織樣本的腫瘤含量需大于10%。純化并定量的基因組DNA濃度不低于1 ng/μL；

⑵ 外周血樣品不得有溶血，或在PAXgene Blood ccfDNA Tube中保存時間超過7 d。純化并定量的游離DNA濃度不低于1 ng/μL；

⑶ 檢測過程中試劑盒的陽性和陰性質控品的檢測結果符合預期。

⑷ dPCR反應完成后，確認芯片有效孔數(shù)不低于16 000，高質量孔數(shù)比例不低于85%，VICTM熒光信號陽性的微孔數(shù)不低于200。

如以上質控標準中任何一項不滿足，可能影響檢測結果，需要重新檢測或重新取樣。

專家建議：為保證檢測的成功率及檢測結果的正確性，需對樣本預處理和檢測各環(huán)節(jié)進行嚴格質控。

3 臨床價值與展望

近年來，帕妥珠單抗、拉帕替尼、匹羅替尼和恩美曲妥珠單抗等新的抗HER2藥物不斷成功上市，包括HER2陽性患者新輔助治療的應用，均在乳腺癌的治療中取得了良好效果［3，27］。對患者HER2基因狀態(tài)檢測的靈敏度和準確度，對臨床醫(yī)師制訂治療方案及改善HER2陽性患者的預后均有重大意義。

腫瘤的時空異質性決定了HER2基因擴增組織活檢也許不能完全反映腫瘤中HER2基因狀態(tài)，并且因為穿刺的局限性，也導致無法隨著患者治療的進展而進行多次組織活檢。此外，除腫瘤時空異質性之外的原因，如胃癌手術標本沒有及時固定、FISH檢測其自身的挑戰(zhàn)［3］，同樣會造成組織活檢的假陰性結果。dPCR作為一種新型臨床檢測方法，其絕對定量的性能及優(yōu)異的檢測精密度，給在DNA水平針對HER2擴增進行檢測帶來了新的機會［7-8］。HER2基因擴增檢測（dPCR法）除了可以解決組織樣品因為樣品預處理不規(guī)范帶來的假陰性結果之外，更重要的是作為組織樣本檢測的有效補充，通過對外周血樣本的1次或多次檢測，避免因為時空異質性帶來的假陰性結果。同時，HER2基因擴增檢測（dPCR法）通過外周血樣本檢測結果動態(tài)監(jiān)測HER2擴增變化，可早于實體瘤療效評價標準（Response Evaluation Criteria in Solid Tumor，RECIST）評估的影像學進展［5，21-22］。

未來對組織檢測結果為陰性的初治晚期和復發(fā)轉移乳腺癌患者外周血樣本中HER2狀態(tài)的復檢，可能避免由于腫瘤的空間異質性造成的“漏檢”，使這類HER2陽性乳腺癌患者能受益于靶向治療。另外，對未行抗HER2治療患者的每個隨訪周期外周血中HER2狀態(tài)的動態(tài)監(jiān)測，則可提示臨床醫(yī)師積極調整治療策略，避免患者錯過靶向治療的最佳時機［22］。另外，HER2基因擴增檢測（dPCR法）的應用，亦使除HER2陽性的晚期胃癌、非小細胞肺癌、結直腸癌等患者，有機會從類似DS-8201藥物治療中獲益。本共識亦將根據(jù)dPCR后續(xù)臨床研究結果、技術更新和實踐進展進行更新，為進一步優(yōu)化HER2檢測、提高檢測結果的靈敏度和準確度提供指導和建議。

致謝：專家組成員主要來自上海市抗癌協(xié)會腫瘤標志物專業(yè)委員會和上海市抗癌協(xié)會乳腺癌專業(yè)委員會，特此致謝。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。