金奕滋，林明曦，張 劍

復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院Ⅰ期臨床研究中心，復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032

乳腺癌現(xiàn)已成為全球范圍內(nèi)發(fā)病率最高的惡性腫瘤［1］，得益于乳腺癌的分類治療模式，其總體預(yù)后在近年來有所改善。目前臨床上對乳腺癌的分類治療主要基于其病理學(xué)分子分型，即根據(jù)雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）及人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）的表達情況將乳腺癌分為激素受體陽性型、HER2過表達型和三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）。與此同時，隨著測序技術(shù)的發(fā)展和多組學(xué)研究的興起，基于傳統(tǒng)分子分型的分類治療顯現(xiàn)出一定的局限性。尤其對于TNBC而言，盡管具有侵襲性較強、復(fù)發(fā)及遠處轉(zhuǎn)移率高的共同特征，但其基因突變譜和分子生物學(xué)特征存在著高度異質(zhì)性，仍需要確立更精準(zhǔn)的分型或?qū)ふ裔槍π园悬c來指導(dǎo)臨床治療［2-5］。

DNA損傷應(yīng)答（DNA damage response，DDR）缺陷是近年來乳腺癌治療研究的熱門靶點之一。中乳腺癌易感基因（breast cancer susceptibility gene，BRCA）為DNA同源重組（homologous recombination，HR）修復(fù)通路上的關(guān)鍵基因，其作為乳腺癌的治療靶點已得到許多研究［6-7］的證據(jù)支持?；诙囗棿笮廷笃诙嘀行呐R床試驗的數(shù)據(jù)，最新的國際指南已推薦對所有復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性的乳腺癌患者行胚系BRCA1/2突變檢測以評估是否存在多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶［poly (ADP-ribose) polymerase，PARP］抑制劑的應(yīng)用指證，且有研究［6-7］表明，伴胚系BRCA1/2突變的腫瘤表型（即“BRCAness”表型）亦存在于BRCA1/2野生型的伴HR缺陷的腫瘤中，伴HR功能異常的乳腺癌分別占乳腺癌總?cè)巳旱?0%和TNBC的50%～80%。以上證據(jù)提示DDR缺陷作為乳腺癌的潛在治療靶標(biāo)具有一定的研究價值和應(yīng)用前景。本文就DDR缺陷作為乳腺癌治療靶點的研究進展進行綜述，并探討其在臨床應(yīng)用中所面臨的問題。

1 DDR缺陷

DDR通路負(fù)責(zé)DNA損傷后的識別、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和修復(fù)，并通過協(xié)調(diào)細胞周期進程減少DNA損傷被傳遞至下一代子細胞的可能。DDR功能的失活可導(dǎo)致細胞突變的累積和基因組不穩(wěn)定性的增加，在癌癥發(fā)生的早期發(fā)揮著關(guān)鍵作用［8-9］。DNA損傷修復(fù)的核心機制包括修復(fù)DNA單鏈損傷的堿基切除修復(fù)（base excision repair，BER）、核苷酸切除修復(fù)（nucleotide excision repair，NER）、錯配修復(fù)（mismatch repair，MMR），以及修復(fù)DNA雙鏈損傷的HR、非同源末端連接（non-homologous end joining，NHEJ）、微同源介導(dǎo)的末端連接（microhomologymediated end joining，MMEJ）［10-12］。隨著對DNA損傷修復(fù)機制的深入研究，現(xiàn)已明確DNA損傷修復(fù)是由細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)進行感知和調(diào)控的復(fù)雜過程，不同機制所涉及的通路間存在著相互作用。

在DDR的主要通路中，介導(dǎo)高保真DNA修復(fù)的HR通路與乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系尤為密切。HR通路上的關(guān)鍵基因BRCA1/2為乳腺癌最常見的易感基因，伴BRCA1/2突變的乳腺癌患者更易呈現(xiàn)早發(fā)性（發(fā)病年齡≤35歲）、雙側(cè)乳腺癌、合并乳腺癌家族史的特點。此外HR缺陷還包括HR通路其他基因（如CHEK1/2、ATM、ATR、BRIP1、PALB2、PTEN、RAD50、RAD51和MSH6等）的體系或胚系突變、BRCA1啟動子甲基化以及與HR缺陷表型相關(guān)的DNA拷貝數(shù)變異、雜合性缺失（loss of heterozygosity，LOH）、端粒等位基因失衡（telomeric allelic imbalance，TAI）、大片段遷移（large scale transition，LST）等基因表達特征［13］。

2 DDR與“協(xié)同致死”機制

“協(xié)同致死”的概念最初用于描述兩個功能性基因同時失活導(dǎo)致細胞死亡的現(xiàn)象［14-15］，這一概念在癌癥治療領(lǐng)域被進一步拓展。在伴有DDR某條通路缺陷的腫瘤細胞中，DNA修復(fù)將高度依賴于其他旁路途徑，而若此時這些通路被藥物再次抑制則會產(chǎn)生“協(xié)同致死”效應(yīng)。利用這一效應(yīng)，DDR成為抗腫瘤藥物的研發(fā)靶點。

PARP抑制劑為首個成功利用“協(xié)同致死”原理進入臨床應(yīng)用的抗腫瘤藥物，其開發(fā)最初主要基于對PARP催化活性的抑制。研究者最初認(rèn)為PARP抑制劑可通過抑制PARP酶活性阻斷DNA單鏈損傷后的BER，當(dāng)單鏈損傷轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈損傷時，正常細胞可通過HR通路對雙鏈損傷進行修復(fù)，而HR功能異常的細胞則出現(xiàn)損傷的積累，最終致死。然而，由于后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)抑制BER通路上PARP的下游分子未能殺死HR缺陷細胞［16］，這種對PARP作用機制的闡釋又受到了挑戰(zhàn)。PARP同時負(fù)責(zé)調(diào)控NHEJ通路，有研究［16-18］發(fā)現(xiàn)，在HR缺陷細胞中抑制PARP活性可引起NHEJ通路異常激活，且PARP抑制劑通過NHEJ通路發(fā)揮細胞毒作用。由于NHEJ修復(fù)不具有保真性，該通路的失調(diào)可能是協(xié)同致死的機制之一。此外部分PARP抑制劑可通過“PARP捕獲”機制形成DNA-PARP復(fù)合物使DNA復(fù)制叉停滯，進而干擾修復(fù)過程中的DNA復(fù)制［19-20］。由于PARP捕獲機制還可激活固有免疫反應(yīng)［21］，故捕獲能力更強的PARP抑制劑往往具有更強的抗腫瘤作用。

除PARP抑制劑外，多個基于“協(xié)同致死”機制靶向DDR的藥物正處于臨床前及臨床研究階段。這些靶點可大致分為兩類：一類為主要負(fù)責(zé)DNA損傷識別與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、參與調(diào)控細胞周期的蛋白激酶，如ATM、ATR、DNA-PKcs、CHEK1/2和WEE1等；另一類為直接參與DNA雙鏈斷裂修復(fù)的分子，如RAD51和POLQ。ATM主要通過HR通路參與DNA雙鏈斷裂修復(fù)，其負(fù)責(zé)H2AX的磷酸化，進而招募下游分子參與DDR過程［22］。ATR在DNA單鏈和雙鏈修復(fù)中均發(fā)揮重要作用，其與下游的CHEK1分子共同參與細胞周期捕獲，維持復(fù)制叉的穩(wěn)定性，幫助復(fù)制叉修復(fù)和重啟［23］。WEE1負(fù)責(zé)調(diào)控細胞周期激酶，負(fù)向調(diào)控細胞進入有絲分裂［24］。DNA-PKcs和POLQ則分別是NHEJ通路和MMEJ通路的關(guān)鍵分子［25-26］。

3 以DDR為靶點的乳腺癌治療藥物

3.1 PARP抑制劑

PARP 抑制劑為目前乳腺癌治療領(lǐng)域研究進展最快的DDR靶向藥物。OlympiAD、EMBRACA研究［27-28］的數(shù)據(jù)已奠定了PARP抑制劑在伴胚系BRCA突變轉(zhuǎn)移性乳腺癌中的治療地位。OlympiAD Ⅲ期臨床試驗［28］表明，奧拉帕尼單藥對比標(biāo)準(zhǔn)化療顯著改善攜帶胚系BRCA突變、HER2陰性轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者的無進展生存期（progression free survival，PFS）（中位PFS：7.0個月vs4.2個月，P＜0.001），且患者對奧拉帕尼耐受性良好，3級及以上不良反應(yīng)的發(fā)生率低于標(biāo)準(zhǔn)化療組（36.6%vs50.5%），盡管兩者對總生存期（overall survival，OS）的影響無顯著差異，但在既往未接受化療患者的亞組分析中，奧拉帕尼組相比化療組可顯著延長OS（22.6個月vs14.7個月，P＝0.02）。在隨后的EMBRACA Ⅲ期臨床試驗［29］中，新一代PARP抑制劑他拉唑帕尼亦顯示出優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)化療的抗腫瘤活性［客觀緩解率（objective response rate，ORR）：62.6%vs27.2%］，且較標(biāo)準(zhǔn)化療組可顯著延長PFS（中位PFS：8.6個月vs5.6個月，P＜0.001）?；谝陨蠑?shù)據(jù)，奧拉帕尼和他拉唑帕尼已獲美國食品藥品管理局批準(zhǔn)用于治療HER2陰性、伴胚系BRCA突變的轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者。

此外，多項臨床試驗亦證明了PARP抑制劑在合并DDR缺陷乳腺癌患者中的治療價值，其中包括用于輔助治療和新輔助治療階段。TBCRC 048單臂研究［30］的初步結(jié)果顯示，攜帶體系DDR突變和非BRCA胚系DDR突變的轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者經(jīng)奧拉帕尼單藥治療后分別取得了38.5%和29.6%的ORR，提示可能有更多非胚系BRCA突變的患者可從PARP抑制劑治療中獲益。而GeparOLA Ⅱ期臨床試驗［31］結(jié)果則提示，奧拉帕尼聯(lián)合紫杉醇較卡鉑聯(lián)合紫杉醇在合并HR缺陷、HER2陰性早期乳腺癌的新輔助治療中有著更高的病理學(xué)完全緩解（pathologic complete response，pCR）率，且耐受性更好。以上數(shù)據(jù)均表明，PARP抑制劑可使胚系BRCA突變以外的乳腺癌患者獲益，而伴HR缺陷的乳腺癌能否成為PARP抑制劑的又一適應(yīng)證仍有賴于更多更高級別的證據(jù)。

3.2 其他靶向DDR通路的藥物

由于PARP抑制劑面臨耐藥等問題，研究者進一步探索了DDR通路上的其他靶點。除PARP抑制劑外，多個以DDR通路分子為靶點治療乳腺癌的藥物已進入臨床研究階段，如ATM抑制劑、ATR抑制劑、CHEK1抑制劑及WEE1抑制劑等，表1總結(jié)了這些藥物的臨床試驗開展情況。隨著對DDR調(diào)控分子網(wǎng)絡(luò)的深入研究，相信未來將有更多的靶點投入臨床轉(zhuǎn)化研究，有望作為單藥或聯(lián)合PARP抑制劑、免疫治療、靶向治療等用于難治性乳腺癌的治療。

表1 除PARP抑制劑外進入臨床研究階段的主要DDR靶向藥物Tab.1 The main agents targeting DDR in the clinical development beyond PARP inhibitors

4 以DDR為靶點的藥物在TNBC中的臨床進展

由于先前的研究［30-31］證據(jù)提示，無胚系BRCA突變患者也可能從PARP抑制劑治療中獲益，而TNBC又是目前臨床治療效果欠佳的一種乳腺癌亞型，一些臨床研究以TNBC為目標(biāo)人群探索DDR靶向藥物的治療價值（表2）。

表2 探索DDR靶向藥物治療TNBC的主要臨床研究Tab.2 The main clinical trials investigating DDR-targeted agents for the treatment of TNBC

在TNBC新輔助治療領(lǐng)域，盡管BrighTNessⅢ期研究［32］表明，維利帕尼+紫杉醇+卡鉑組較紫杉醇+卡鉑組未能顯著提高pCR率（P=0.36），但PETREMAC Ⅱ期研究［33］顯示出奧拉帕尼單藥序貫化療的良好療效，其ORR在非選擇性的TNBC中達56.3%，且胚系或體系HR基因突變與BRCA1甲基化狀態(tài)可能是理想的療效預(yù)測指標(biāo)。另有一項旨在評估ATR抑制劑ceralasertib單藥治療是否對新輔助化療后殘存病灶較多的TNBC患者具有抗腫瘤作用的Ⅱ期研究正在進行中。對于進展期或轉(zhuǎn)移性乳腺癌，已有OlympiAD Ⅲ期臨床試驗［28］數(shù)據(jù)提示TNBC亞組獲益更明顯，目前多項PARP抑制劑聯(lián)合免疫或靶向治療轉(zhuǎn)移性TNBC的臨床試驗也正在進行中。CHEK1抑制劑prexasertib在一項Ⅱ期臨床試驗［34］中對無BRCA突變的進展期TNBC顯示出中等強度的臨床療效?？紤]到prexasertib聯(lián)合化療在卵巢癌中的應(yīng)用取得了一定的成功，有必要進一步評估其聯(lián)合化療治療乳腺癌的臨床效果。此外，有多項正在進行中的臨床研究旨在評估兩種DDR靶向藥物的聯(lián)合應(yīng)用，例如一項Ⅱ期多中心臨床研究VIOLETTE旨在探究奧拉帕尼單藥對比奧拉帕尼聯(lián)合ATR抑制劑ceralasertib或WEE1抑制劑adavosertib作為二線或三線治療轉(zhuǎn)移性TNBC的療效和安全性。總的來說，DDR靶向藥物的聯(lián)合治療（包括免疫治療、靶向治療及聯(lián)合兩種DDR靶向藥物等）已成為臨床研究的趨勢，期待以上這些研究結(jié)果能為TNBC帶來新的治療機會。

5 臨床應(yīng)用中的難點與挑戰(zhàn)

DDR缺陷作為乳腺癌潛在的治療靶點，在臨床應(yīng)用中仍存在以下尚待解決的問題。

5.1 療效預(yù)測標(biāo)志物的確立

DDR靶向藥物的作用主要基于“協(xié)同致死”原理，故需更精準(zhǔn)地對目標(biāo)人群進行定位。盡管目前PARP抑制劑僅獲批用于胚系BRCA突變的乳腺癌患者，多項臨床研究［30-31］表明，其對無BRCA突變的患者亦具有療效。而HR缺陷和“BRCAness”表型是否為PARP抑制劑最準(zhǔn)確的預(yù)測指標(biāo)，仍需要大型隨機對照研究進行驗證。此外，HR功能異常作為潛在的預(yù)測指標(biāo)仍缺乏統(tǒng)一的檢測手段、標(biāo)準(zhǔn)和明確的定義。目前的預(yù)測指標(biāo)包括HR缺陷評分（將HR缺陷表型相關(guān)的LOH評分、TAI、LST等基因表達特征納入綜合考慮）、基于多重連接探針擴增技術(shù)（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）分析的BRCA1樣特征、RAD51評分等［13］。這些預(yù)測指標(biāo)能否精確定位治療人群，仍有待臨床試驗的進一步評估。

5.2 繼發(fā)性耐藥

PARP抑制劑繼發(fā)性耐藥的機制尚未被完全闡明，目前已知的機制主要包括以下幾點：①由于HR基因的回復(fù)突變、BRCA1亞等位基因的表達、BRCA1脫甲基化及p53結(jié)合蛋白1的失活等原因，HR修復(fù)功能得以恢復(fù)；② PARP1的完全失活或“PARP捕獲”能力的下降；③通過多種機制保護停滯的復(fù)制叉不被破壞；④ P-糖蛋白表達上調(diào)，使藥物外排增加［12，35］。此外，PARP抑制劑與鉑類藥物存在著交叉耐藥現(xiàn)象，前線鉑類治療進展的患者往往對PARP抑制劑響應(yīng)不佳。PARP抑制劑的耐藥問題限制了其進一步的臨床應(yīng)用，故需積極探索克服耐藥的策略，例如，針對以上耐藥機制開發(fā)新型的DDR靶向藥物，進一步探究PARP抑制劑與其他DDR靶向藥、免疫治療、化療等手段聯(lián)合應(yīng)用的臨床效果等。

5.3 意義不明變異（variants of uncertain significance，VUS）

DDR 通路缺陷的判定依賴于對測序結(jié)果的解讀。國際癌癥研究機構(gòu)（International Agency for Research on Cancer，IARC）根據(jù)基因變異的致病性將其分為5 類：致病突變（可能性＞9 9.0%）、可能致病突變（可能性為9 5.0%～9 9.0%）、VUS（可能性為5.0%～94.9%）、可能良性變異（可能性為0.1%～4.9%）和良性變異（可能性＜0.1%）［36］。目前，治療及臨床試驗的對象僅局限于致病或可能致病突變的患者。而實際在DDR基因測序中發(fā)現(xiàn)的大量單核苷酸變異仍被歸類為VUS。既往WECARE研究［37］表明，約有75%的胚系BRCA1/2突變?yōu)閂US；而在ClinVar數(shù)據(jù)庫中，VUS為5類變異中占比最大者。由于VUS的功能影響與實際致病風(fēng)險尚不明確，給測序結(jié)果的臨床解讀和相應(yīng)的治療決策帶來了較大困難，亟待進一步的評估與分類。

目前對VUS評估的方法主要有以下幾種：①通過功能實驗評估VUS對細胞功能的影響（如對HR修復(fù)、轉(zhuǎn)錄激活功能、分子間相互作用等的影響）［38-39］；②通過生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫（如SIFT、Polyphen 2等）對VUS功能進行預(yù)測［40-41］；③基于大樣本量的基因測序數(shù)據(jù)，通過對比某種變異在癌癥患者與健康人群中的出現(xiàn)頻率、攜帶某種變異的患者是否存在家族聚集性發(fā)病等評估變異的致病性；④利用基于CRISPR/Cas9技術(shù)的飽和基因編輯（saturation genome editing，SGE）對大批量的VUS進行功能檢測和評分［42］。其中，傳統(tǒng)的功能實驗多基于導(dǎo)入外源性序列的模型進行分析，其靈敏度和特異度受剪接效應(yīng)、轉(zhuǎn)錄穩(wěn)定性等因素影響，且難以實現(xiàn)高通量的評估，因而具有一定的局限性；而生物信息學(xué)算法工具盡管易實現(xiàn)高通量分析，但其準(zhǔn)確度相對較低。對于大部分的VUS而言，目前的臨床及測序數(shù)據(jù)尚不足以為其定性提供充分證據(jù)。Findlay等［42］創(chuàng)新性地利用SGE對BRCA1基因RING和BRCT功能域上所有位點進行點突變，利用攜帶失功能BRCA突變的單倍體細胞無法存活的特性，高通量地對單核苷酸變異進行功能意義上的鑒別與分類。其對錯義突變和剪切位點的功能評估均有較高的靈敏度和特異度，是目前評估VUS最為準(zhǔn)確高效的方法，對完善DDR基因VUS的分類具有重要的借鑒意義。

6 總結(jié)與展望

以DDR為靶點的藥物在乳腺癌治療領(lǐng)域應(yīng)用前景廣闊。一系列的臨床試驗證據(jù)表明，PARP抑制劑對治療乳腺癌有良好的療效和安全性，同時，多項研究也正在積極探索PARP抑制劑能否在更早期的治療階段應(yīng)用、能否使更多患者從中獲益。除PARP抑制劑外，多種靶向DDR通路分子的乳腺癌治療藥物正處于臨床前和臨床研究中。在進一步的臨床應(yīng)用之前，人們?nèi)孕杼剿鞲鼫?zhǔn)確的療效預(yù)測指標(biāo)以精準(zhǔn)刻畫獲益人群；同時需要積極探索克服耐藥的策略，聯(lián)合靶向藥物或免疫治療將有希望成為新的發(fā)展方向；最后，仍需要大量的研究數(shù)據(jù)完善VUS的精準(zhǔn)分類，以更好地利用測序數(shù)據(jù)指導(dǎo)臨床治療。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。