喻 虹， 崔 躍， 劉 濤， 楊梅英， 陳 芬

(1.武漢市紅十字會醫(yī)院心血管內(nèi)科，湖北 武漢 430015；2.武漢市紅十字會醫(yī)院呼吸內(nèi)科，湖北 武漢 430015；3.華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院心內(nèi)科，湖北 武漢 430022)

敗血癥是宿主對感染的反應(yīng)，為全球范圍內(nèi)主要的死亡原因[1]，其中心血管功能障礙是敗血癥相關(guān)發(fā)病率和死亡率的主要指標之一[2]。線粒體的氧化應(yīng)激和細胞凋亡已被證明在敗血癥誘發(fā)的心肌功能障礙中起關(guān)鍵作用[2]，PVT1作為長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)在各種癌癥中均具有顯著的致癌活性[3]，并參與心肌缺血/再灌注損傷[4]、心房纖維化[5]等病理過程，在LPS誘導(dǎo)的THP-1源巨噬細胞中高表達，與膿毒癥急性肺損傷密切相關(guān)[6]。

連翹具有清熱解毒、消腫散結(jié)之功，其多種生物活性，尤其是抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抗菌已得到充分認可[7]，而且其提取物還被證明在膿毒血癥小鼠模型中通過降低氧自由基的炎性因子等起保護作用[8]。在對抗LPS損傷方面，連翹酯苷A以劑量依賴方式抑制LPS誘發(fā)的急性損傷[9]。但尚未研究PVT1的表達是否受連翹提取物的影響及其是否參與連翹提取物的心肌保護活性。因此，本研究假設(shè)在脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的心肌細胞損傷模型中，連翹提取物可減輕心肌細胞氧化應(yīng)激和細胞凋亡，同時采用小干擾RNA干擾心肌細胞中PVT1的表達，以期為該藥材在心肌損傷治療中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細胞、藥物與試劑 大鼠心肌細胞H9c2購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心。LPS購自美國Sigma公司，貨號L2880；Dulbecco’s modified Eagle(DMEM)培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司，貨號11668-019；異硫氰酸熒光素(FITC)細胞凋亡試劑盒購自南京Vazyme生物公司，貨號A211-02；乳酸脫氫酶(lactate dehydrofenase，LDH，貨號C0016)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD，貨號S0109)、丙二醛(malondialdehyde，MDA，貨號S0131S)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px，貨號S0056)檢測試劑盒購自上海Beyotime生物技術(shù)公司；活化的(cleaved)-天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3(caspase3)抗體(貨號ab214430)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體(貨號ab181602)、pro-caspase3抗體(貨號ab32499)、辣根過氧化酶(HRP)標記的IgG抗體(貨號ab205718)購自英國Abcam公司。

連翹提取物的制備參照Zhao等[10]報道的方法，取500 g藥材，以1∶5料液比加入80%乙醇，超聲提取1 h，共3次，合并提取液，減壓(45 ℃)濃縮，冷凍干燥后得到粉末狀物質(zhì)(62.2 g)，DMEM培養(yǎng)基稀釋成5、20、80 ng/mL。

1.2 細胞培養(yǎng)與分組處理 心肌細胞H9c2在DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)、飽和濕度、5% CO2、37 ℃條件下生長，在連翹提取物實驗中，將對數(shù)生長期者隨機分為對照組(未加藥物處理)，模型組(1 μg/mL LPS作用24 h[11])及低、中、高劑量連翹提取物組(分別給予5、20、80 ng/mL提取物和1 μg/mL LPS作用24 h)；在PVT1實驗中，將對數(shù)生長期者隨機分為si-NC組(轉(zhuǎn)染小干擾RNA陰性對照si-NC和1 μg/mL LPS)、si-PVT1組(轉(zhuǎn)染PVT1小干擾RNA si-PVT1和1 μg/mL LPS)、高劑量連翹提取物組+pcDNA組(轉(zhuǎn)染過表達空載體pcDNA、高劑量80 ng/mL連翹提取物和1 μg/mL LPS)、高劑量連翹提取物組+pcDNA-PVT1組(轉(zhuǎn)染過表PVT1、高劑量80 ng/mL連翹提取物和1 μg/mL LPS)。細胞轉(zhuǎn)染時，通過Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑將si-NC、si-PVT1、pcDNA-PVT1、pcDNA(上海吉瑪公司)轉(zhuǎn)染匯合至60%左右的H9c2細胞中，24 h后分組處理，通過RT-qPCR驗證轉(zhuǎn)染效率。

1.3 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率 參照FITC凋亡檢測試劑盒說明書指示，將冷磷酸鹽緩沖液洗滌后的心肌細胞重懸于結(jié)合緩沖液中，分別用膜聯(lián)蛋白V-FITC和碘化丙啶染色，在室溫下避光孵育，15 min后上流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.4 Western blot檢測cleaved-caspase3、pro-caspase3蛋白表達 H9c2細胞在放射免疫沉淀緩沖液裂解以提取蛋白，吸取30 μg樣品進行10% SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上，在5%脫脂牛奶封閉液中封閉膜，室溫下孵育1 h，將聚偏二氟乙烯膜與抗cleaved-caspase3(1∶1 000)、抗pro-caspase3(1∶1 000)、GAPDH(1∶2 000)抗體孵育過夜，用HRP標記的IgG抗體室溫孵育1 h，通過增強化學(xué)發(fā)光試劑盒對膜進行顯影，Image J軟件對蛋白條帶進行分析。以GAPDH為內(nèi)參，計算cleaved-caspase3、pro-caspase3蛋白相對表達。

1.5 試劑盒檢測H9c2細胞中MDA水平及SOD、LDH、GSH-Px活性 3 000 r/min離心H9c2細胞10 min，收集上清液，按照相關(guān)試劑盒操作說明，分別采用硫代巴比妥酸顯色法、氮藍四唑顯色法、基于diaphorase催化的INT顯色反應(yīng)、NADPH法檢測MDA水平及SOD、LDH、GSH-Px活性。

1.6 RT-qPCR檢測PVT1表達 采用TRIzol試劑從H9c2細胞中提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以SYBR Green PCR Mix和引物通過RT-qPCR擴增cDNA模板，PVT1正向引物5′-TGAGAACTGTCCTTACGTGACC-3′，反向引物5′-AGAGCACCAAGACTGGCTCT-3′；內(nèi)參GAPDH正向引物5′-TGTTCGTCATGGGTGTGAAC-3′，反向引物5′-ATGGCATGGACTGTGGTCAT-3′，再采用2-ΔΔCt法計算PVT1表達。

2 結(jié)果

2.1 連翹提取物對LPS處理H9c2細胞損傷的影響 如圖1、表1所示，與對照組比較，模型組及低、中、高劑量連翹提取物組H9c2細胞凋亡率、cleaved-caspase3蛋白表達升高(P<0.05)，pro-caspase3蛋白表達降低(P<0.05)；與模型組比較，中、高劑量連翹提取物組凋亡率、cleaved-caspase3蛋白表達降低(P<0.05)，pro-caspase3蛋白表達升高(P<0.05)，而低劑量連翹提取物組凋亡率，cleaved-caspase3、pro-caspase3蛋白表達無明顯變化(P>0.05)；與低劑量連翹提取物組比較，中、高劑量連翹提取物組凋亡率、cleaved-caspase3蛋白表達降低(P<0.05)，pro-caspase3蛋白表達升高(P<0.05)；與中劑量連翹提取物組比較，高劑量連翹提取物組細胞的凋亡率、cleaved-caspase3蛋白表達降低(P<0.05)，pro-caspase3蛋白表達升高(P<0.05)。

2.2 連翹提取物對LPS處理H9c2細胞中MDA水平及SOD、LDH、GSH-Px活性的影響 如表2所示，與對照組比較，模型組及低、中、高劑量連翹提取物組MDA水平、LDH活性升高(P<0.05)，SOD、GSH-Px活性降低(P<0.05)；與模型組比較，中、高劑量連翹提取物組MDA水平、LDH活性降低(P<0.05)，SOD、GSH-Px活性升高(P<0.05)，而低劑量連翹提取物組MDA水平及SOD、LDH、GSH-Px活性無明顯變化(P>0.05)；與低劑量連翹提取物組比較，中、高劑量連翹提取物組MDA水平、LDH活性降低(P<0.05)，SOD、GSH-Px活性升高(P<0.05)；與中劑量連翹提取物組比較，高劑量連翹提取物組MDA水平、LDH活性降低(P<0.05)，SOD、GSH-Px活性升高(P<0.05)。

表1 連翹提取物對LPS處理H9c2損傷的影響

表2 連翹提取物對LPS處理H9c2中MDA水平及SOD、LDH、GSH-Px活性的影響

2.3 連翹提取物對LPS處理H9c2細胞中PVT1表達的影響 如表3所示，與對照組比較，模型組及低、中、高劑量連翹提取物組PVT1 mRNA表達升高(P<0.05)；與模型組比較，中、高劑量連翹提取物組PVT1 mRNA表達降低(P<0.05)，低劑量連翹提取物組PVT1 mRNA表達無明顯變化(P>0.05)；與低劑量連翹提取物組比較，中、高劑量連翹提取物組PVT1 mRNA表達降低(P<0.05)；與中劑量連翹提取物組比較，高劑量連翹提取物組PVT1 mRNA表達降低(P<0.05)。

2.4 干擾PVT1對LPS處理H9c2細胞損傷及MDA水平及SOD、LDH、GSH-Px活性的影響 如圖2、表4所示，與si-NC組比較，si-PVT1組H9c2細胞的PVT1 mRNA表達、細胞凋亡率、MDA水平、LDH活性、cleaved-caspase3蛋白表達均降低(P<0.05)，SOD、GSH-Px活性及pro-caspase3蛋白表達均升高(P<0.05)。

表3 連翹提取物對LPS處理H9c2中PVT1 mRNA表達的影響

圖2 干擾PVT1對LPS處理H9c2凋亡(B)及caspase3蛋白表達(B)的影響Fig.2 Effects of PVT1-targeting interference on apoptosis (A) and caspase 3 protein expression (B) of LPS-treated H9c2 cells

表4 干擾PVT1對LPS處理H9c2損傷及MDA水平及SOD、LDH、GSH-Px活性的影響

2.5PVT1逆轉(zhuǎn)連翹提取物對LPS處理H9c2細胞損傷的影響 如圖3、表5所示，與高劑量連翹提取物+pcDNA組比較，高劑量連翹提取物+pcDNA-PVT1組細胞凋亡率、cleaved-caspase3蛋白表達升高(P<0.05)，pro-caspase3蛋白表達降低(P<0.05)。

圖3 過表達PVT1對連翹提取物作用的LPS處理H9c2凋亡(A)及caspase3蛋白表達(B)的影響Fig.3 Effects of PVT1 overexpression on apoptosis (A) and Caspase3 protein expression (B) of H9c2 cells co-treated with LPS and Forsythia suspensa extract

表5 PVT1逆轉(zhuǎn)連翹提取物對LPS處理H9c2損傷的影響

2.6PVT1逆轉(zhuǎn)連翹提取物對LPS處理H9c2中MDA水平及SOD、LDH、GSH-Px活性的影響 如表6所示，與高劑量連翹提取物+pcDNA組比較，高劑量連翹提取物+pcDNA-PVT1組細胞中MDA水平、LDH活性升高(P<0.05)，SOD、GSH-Px活性降低(P<0.05)。

表6 PVT1逆轉(zhuǎn)連翹提取物對LPS處理H9c2中MDA水平及SOD、LDH、GSH-Px活性的影響

3 討論

氧化應(yīng)激和細胞凋亡被認為是LPS誘導(dǎo)的心肌損傷的重要事件[12]。MDA通常作為氧化損傷的指標，用于評估脂質(zhì)過氧化的程度，也可作為細胞損傷的間接指標[12]。SOD和GSH-Px是重要的抗氧化酶，反映細胞清除自由基的能力[13]。LDH是原代心肌細胞死亡的可靠標志[14]。在本研究中，20、80 ng/mL連翹提取物降低了LPS處理后心肌細胞中脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA水平和LDH活性，還可以提高細胞中抗氧化酶SOD和GSH-Px活性，表明連翹提取物具有保護LPS誘導(dǎo)的心肌細胞損傷的功能，這可能歸因于其抗氧化特性[15]。此前，連翹被證明能夠減輕LPS誘導(dǎo)的細胞損傷[16]，通過提升抗氧化防御機制減輕LPS誘導(dǎo)的大鼠炎性肝損傷，表現(xiàn)為減弱活性氧和MDA的產(chǎn)生，增加SOD和GSH-Px活性[10]，本研究的結(jié)果與之吻合。細胞凋亡可以由氧化應(yīng)激觸發(fā)，涉及凋亡相關(guān)蛋白caspase3的裂解[17]，本實驗中20、80 ng/mL連翹提取物降低LPS處理H9c2細胞凋亡率、cleaved-caspase3表達，提高pro-caspase3表達，表明連翹提取物具有一定的心肌保護功能。

在本研究中，連翹提取物可降低LPS誘導(dǎo)后心肌細胞中PVT1的表達。PVT1被證明介導(dǎo)心肌損傷過程，例如在阿霉素誘導(dǎo)的心肌毒性中，PVT1呈現(xiàn)高表達，降低PVT1的表達可減少心肌細胞的凋亡[18]。在LPS誘導(dǎo)的膿毒性急性腎臟損傷模型中，PVT1促進LPS誘導(dǎo)的膿毒性急性腎臟損傷?？梢奝VT1加劇LPS誘導(dǎo)的細胞損傷。本實驗中，干擾PVT1可以抑制LPS誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡，減輕LDH和MDA的產(chǎn)生，并提高SOD、GSH-Px活性。根據(jù)報道，姜黃素通過抑制小鼠腎臟組織中PVT1的表達，減少LPS誘導(dǎo)的膿毒性急性腎臟損傷[19]。為了進一步研究連翹提取物的抗氧化和抗凋亡作用是否與PVT1有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，PVT1過表達后，連翹提取物對LPS處理的H9c2細胞凋亡率、cleaved-caspase3表達、MDA水平、LDH活性的抑制和對pro-caspase3表達、SOD及GSH-Px活性的促進在很大程度上被逆轉(zhuǎn)。這些結(jié)果進一步表明，PVT1參與連翹提取物保護LPS誘導(dǎo)的心肌細胞損傷過程，并提示PVT1的下調(diào)可能是治療心肌損傷的可行策略。

綜上所述，本研究首次報道了連翹提取物通過抑制PVT1的表達，保護心肌細胞免受LPS誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和細胞凋亡。結(jié)果表明，連翹提取物可能成為預(yù)防心肌損傷的潛在治療劑，并且針對PVT1的抗氧化劑治療可以預(yù)防心肌損傷。