尹曼雪， 吳慶光

(廣州中醫(yī)藥大學中藥學院，廣東 廣州 510006)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種發(fā)生于老年前期和老年、起病隱匿復(fù)雜的進行性發(fā)展神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病[1]，又名老年癡呆癥，其臨床主要表現(xiàn)為認知功能、精神癥狀和行為障礙、日常生活能力下降[2]。隨著老齡化進程加快、環(huán)境污染嚴重，AD發(fā)生率急劇上升，到2050年患者將增至1.52億[3]。針對AD的治療藥物一直是研究熱點，目前有5種被批準，均為乙酰膽堿酯酶抑制劑、谷氨酸受體拮抗劑，但也只能減緩癥狀，無法改變本病進程[4]。

中醫(yī)將AD歸屬于“呆癥”“愚癡”“文癡”等范疇[5]，治療本病時可發(fā)揮多靶點、多層次、多環(huán)節(jié)的綜合作用。當歸、川芎為臨床常用補血活血中藥，常在方劑中同時出現(xiàn)或者配伍成方，其中當歸芍藥散對AD有著良好的治療效果[6-9]，方中川芎、當歸發(fā)揮了“辛以潤之”的藥性，可改善因氣化失司、營血瘀阻、肺衛(wèi)失宣所致津血運行輸布障礙、痰凝氣滯血瘀之病機，從而達到防治目的，但目前其作用靶點和機制尚未明確。因此，本研究在辛潤藥性理論的指導(dǎo)下，采用生物信息學、網(wǎng)絡(luò)藥理學探討當歸-川芎藥對治療AD的關(guān)鍵基因和發(fā)病機制。

1 材料與方法

1.1 軟件與數(shù)據(jù)庫 中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺(TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php/)；Gene Expression Omnibus(GEO)數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)；RCSB PDB數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org/)；Cytoscape軟件(Version 3.7.2)；Rgui軟件(Version 3.6.2)；MOE軟件(Version 2015.10)。

1.2 方法

1.2.1 GEO數(shù)據(jù)獲取 在GEO數(shù)據(jù)庫中輸入“Alzheimer’s disease”，獲得GSE5281基因表達譜，含161例樣本基因芯片數(shù)據(jù)，其中病例組(AD腦組織)87例，對照組(正常腦組織)74例。

1.2.2 AD差異基因篩選 利用Perl、R語言進行數(shù)據(jù)分析，根據(jù)數(shù)據(jù)樣本特征進行背景校正和矩陣數(shù)據(jù)歸一化處理，limma包分析芯片數(shù)據(jù)差異基因，篩選條件為P<0.05、|logFC|≥0.5，得到差異表達基因(differentially expressed genes，DEGs)[10-11]。采用plot包繪制火山圖，pheatmap包繪制熱圖。

1.2.3 活性成分篩選與靶點預(yù)測 選取同時滿足生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18[12]者作為潛在活性成分，通過TCMSP查找其相關(guān)靶點。

1.2.4 調(diào)控網(wǎng)絡(luò) 采用Perl語言，將藥物靶基因和篩選得到的疾病差異基因進行對比分析，得到交互靶標，再將化合物名稱、靶基因名稱、主要生物學功能及信號通路導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，繪制當歸-川芎藥對調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

1.2.5 蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將藥物和疾病的交互靶標基因名稱導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，安裝Bisogenet包構(gòu)建蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)[13]，再安裝CytoNCA包進行網(wǎng)絡(luò)拓撲分析。

1.2.6 GO生物功能富集分析 采用Bioconductor平臺和R軟件，對網(wǎng)絡(luò)合并后獲得的靶標基因進行ID轉(zhuǎn)換，并作GO富集分析，以P值評估存在于各GO注釋中的蛋白質(zhì)群，選擇生物學過程(BP)、分子功能(MF)、細胞組成(CC)，繪制三者條形圖。

1.2.7 KEGG代謝通路富集分析 應(yīng)用Bioconductor平臺和R軟件，對藥物-疾病交互的靶標基因進行KEGG代謝通路富集分析。

1.2.8 分子對接驗證 通過檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫獲得當歸-川芎藥對活性成分mol2格式化學結(jié)構(gòu)，檢索RCSB PDB數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org/)獲得蛋白晶體結(jié)構(gòu)，同時查找c-Jun、PPARG、NR3C1、RXRA、BCL2原始配體或者抑制劑。應(yīng)用MOE 2015.10軟件，對“活性成分-作用靶點”網(wǎng)絡(luò)中的度值大于平均值的化學成分和PPI網(wǎng)絡(luò)中的c-Jun、PPARG、NR3C1、RXRA、BCL2(c-JUN晶體結(jié)構(gòu)PDB: 4W4V、PPARG晶體結(jié)構(gòu)PDB: 3ADT、NR3C1晶體結(jié)構(gòu)PDB: 4LSJ、RXRA晶體結(jié)構(gòu)PDB: 3NSQ、BCL2晶體結(jié)構(gòu)PDB: 4IEH)進行分子對接，獲得相應(yīng)的對接數(shù)據(jù)以及c-Jun、PPARG、NR3C1、RXRA、BCL2與其原始配體或者抑制劑的對接數(shù)據(jù)。通過對接能量(binding energy)的值評價活性成分和關(guān)鍵靶點之間的對接效果，平面分子之間相互作用圖、三維立體相互作用模式圖分析藥物分子和蛋白晶體間的相互作用。

2 結(jié)果

2.1 DEGs篩選 在AD組織中篩選出4 674個基因差異表達，其中2 349個下調(diào)，2 325個上調(diào)，對程度最明顯的20個基因進行排序并聚類分析，得到火山圖和聚類圖(圖1，紅色代表相對較高的表達，綠色代表相對較低的表達，黑色代表沒有變化)。由此可知，DEGs能較好的區(qū)分出2個組，上調(diào)的基因基本在所有實驗中l(wèi)ogFC>0，而下調(diào)的基因基本logFC<0。

圖1 差異基因的火山圖和聚類圖Fig.1 Volcano plot and dendrogram for DEGs

2.2 藥物-疾病靶標預(yù)測 從TCMSP數(shù)據(jù)庫中搜索到當歸化合物125個、川芎化合物189個，根據(jù)OB≥30%、DL≥0.18最終選定9個，來源于當歸的有2個，川芎的有7個，具體見表1。從TCMSP數(shù)據(jù)庫獲取所選化合物的靶標蛋白，并在UniProt數(shù)據(jù)庫檢索其對應(yīng)的基因名，同時聯(lián)合GEO數(shù)據(jù)庫分析篩選得到的AD差異基因，得到兩者交集基因9個，分別是PPARG、RXRA、NR3C1、CHRM1、GABRA1、BCL2、BAX、JUN、ADRB1。

表1 當歸-川芎藥對中的9個活性化合物

2.3 治療AD調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 藥物-化合物-作用靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)見圖2，共14個節(jié)點，粉紅色節(jié)點代表川芎主要活性化合物，黃色節(jié)點代表川芎主要活性化合物，藍色節(jié)點代表代表潛在靶點，每條邊表示化合物和靶點之間的相互作用關(guān)系。由此可知，β-谷甾醇、豆固醇、川芎萘呋內(nèi)酯、楊梅酮、川芎哚在整個網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，可能是治療AD的核心化合物。

圖2 藥物-化合物-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)Fig.2 Drug-compounds-targets-disease network

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)分析 PPI網(wǎng)絡(luò)分析顯示原始節(jié)點739個，根據(jù)度中心性[14-15](degree centrality，DC)>61進行篩選(圖3)，共有80個節(jié)點、1 204條邊，其中節(jié)點表示蛋白，度值表示連接到1個節(jié)點的線條數(shù)，橙紅色表明度值大的交集基因節(jié)點；每條邊表示蛋白與蛋白之間的相互作用關(guān)系，線條越多，關(guān)聯(lián)度越大。由此可知，JUN、NR3C1、PPARG、RXRA、BCL2、BAX度值顯著高于其余交集靶點，其中JUN最大，可能是治療AD最主要的潛在靶點。

圖3 當歸-川芎藥對與AD交集靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)Fig.3 PPI network for intersection targets of Angelica sinensis-Ligusticum chuanxiong drug pair and AD

2.5 GO富集分析 GO富集分析確定了661個GO條目(P<0.05)，其中生物學過程(BP)最多，有556個，主要涉及膜電位調(diào)節(jié)、DNA模板轉(zhuǎn)錄、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、生殖系統(tǒng)發(fā)育、軸突損傷的反應(yīng)等；分子功能(MF)有74個，主要涉及核受體活性、神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、G蛋白偶聯(lián)神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、類固醇激素受體活性等；細胞組成(CC)有31個，主要涉及轉(zhuǎn)錄因子、突觸后膜、突觸、線粒體等。各取P值最高的前20名，以條形圖(圖4)展現(xiàn)，GO生物功能的顯著性以其長度和顏色表示，長度越長，基因數(shù)目越多，條目重要性越大。

2.6 KEGG富集分析 KEGG富集分析共得到23條，P值較小的20條見表2。由此可知，相關(guān)機制主要涉及神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路、內(nèi)分泌抵抗通路、糖尿病并發(fā)癥AGE-RAGE信號通路、神經(jīng)營養(yǎng)因子信號通路、細胞凋亡通路、非酒精性脂肪肝通路、cAMP信號通路、PI3K-Akt信號通路等。

圖4 GO富集分析Fig.4 GO enrichment analysis

2.7 分子對接 將“成分-靶標-通路”網(wǎng)絡(luò)圖中度值較高的5個化合物(β-谷甾醇、豆甾醇、楊梅酮、川芎哚、川芎萘呋酯)與網(wǎng)絡(luò)中度值排名前5的靶點(c-Jun、PPARG、NR3C1、RXRA、BCL2)進行對接，并采用原始配體或抑制劑作為陽性對照，結(jié)果見表3。由此可知，β-sistosterol、stigmasterol、myricanone與c-Jun蛋白晶體的結(jié)合能均小于-10 kcal/mol，表明它們存在結(jié)合，但與原始配體(ID：3H8)相比有一定差距；β-sistosterol、perlolirine與PPARG蛋白晶體結(jié)構(gòu)的結(jié)合能小于-10 kcal/mol，并且perlolirine與PPARG的特異性配體(ID：HID)在結(jié)合能方面較為接近，表明它可能與PPARG存在較好的結(jié)合；β-sistosterol、myricanone、perlolirine與RXRA蛋白晶體結(jié)合能均小于-10 kcal/mol，其中myricanone、perlolirine與RXRA原始配體(ID：CHZ)的結(jié)合能較為接近，提示兩者可能對RXRA具有較好的結(jié)合能力；5個化合物分子與BCL2蛋白晶體的結(jié)合能均小于-10 kcal/mol，但與BCL2特異性配體(ID：1E9)在結(jié)合能方面存在一定差距，與NR3C1的結(jié)合能也均不理想，表明perlolirine可能對PPARG存在較好的結(jié)合能力，并且perlolirine、myricanone與RXRA也能形成較好結(jié)合。然后，選取與靶點蛋白晶體結(jié)合較好的化合物分子，對其與5個靶點分子的結(jié)合情況進行可視化，見圖5。

表2 KEGG富集分析

表3 活性化合物與潛在靶點的對接結(jié)果

注：A～C分別為perlolirine與RXRA、NR3C1、PPARG蛋白晶體活性口袋的對接模式，D～E分別為perlolirine、wallichilide與BCL2蛋白晶體活性口袋的對接模式，F(xiàn)～G分別為β-stigmasterol、wallichilide與c-Jun蛋白晶體活性口袋的對接模式。圖5 活性分子與靶點蛋白晶體活性口袋的分子對接模式Fig.5 Modes of molecular docking between active molecules and active pockets of target protein crystals

3 討論

“辛潤”治燥并非單藥專攻，而是治法配伍[16]。當歸芍藥散中當歸、川芎單用時對AD無顯著療效，而合用后表現(xiàn)出顯著的協(xié)同增效作用[17]。近年來，基因芯片結(jié)合生物信息學廣泛應(yīng)用于疾病研究[18]，而網(wǎng)絡(luò)藥理學的整體性及系統(tǒng)性與中醫(yī)藥基本特點相吻合[19]。

JUN、NR3C1、PPARG、RXRA、BCL2、BAX等靶點是整個PPI網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點蛋白，可作為治療AD的潛在靶點。JUN屬于AP-1轉(zhuǎn)錄因子家族，調(diào)節(jié)基因的表達[20]，溫膽湯改良方能顯著性降低NG108-15細胞JNK、c-Jun表達，降低細胞凋亡率[21]；NR3C1主要參與炎癥反應(yīng)、細胞增殖和靶組織分化[22]，而PPARG則主要是負責脂類分解代謝等[23]；RXRA是核配體激活轉(zhuǎn)錄因子家族成員[24]，其基因變異可能通過影響腦膽固醇代謝而成為AD的危險因素[25]；BCL2、BAX均屬于BCL-2基因家族，前者抗凋亡，后者促凋亡，兩者聯(lián)合調(diào)控細胞凋亡進程[26]。但在AD發(fā)病機理中，自噬作用及其與細胞凋亡的關(guān)系鮮有報道[27]。

KEGG代謝通路顯示，當歸-川芎藥對作用機制主要與神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路、糖尿病并發(fā)癥AGE-RAGE信號通路、神經(jīng)營養(yǎng)因子信號通路、細胞凋亡通路、非酒精性脂肪肝通路、PI3K-Akt信號通路等有關(guān)，與其作用于AD的信號通路[28-30]基本相符，其中對PI3K-Akt信號通路的研究相對較多[31-32]。此外，非酒精性脂肪肝及糖尿病腦病與AD相關(guān)的說法近年來逐漸被關(guān)注[33-35]，提示AD可能是一種代謝性疾病[36]。分子對接顯示，perlolirine可能對PPARG存在較好的結(jié)合能力，并且perlolirine，myricanone與RXRA也能形成結(jié)合。前期報道，β-stigmasterol、stigmasterol、myricanone、perlolirine、wallichilide均表現(xiàn)出較好的調(diào)節(jié)糖脂代謝活性[37-41]，在當歸-川芎藥對治療AD中扮演了重要角色。

綜上所述，本研究在辛潤理論的指導(dǎo)下運用生物信息學、網(wǎng)絡(luò)藥理學來探析當歸-川芎藥對治療AD的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機制，發(fā)現(xiàn)β-stigmasterol、stigmasterol、myricanone、perlolirine、wallichilide可能發(fā)揮了重要作用，同時還得到了核心靶點JUN、NR3C1、PPARG、RXRA、BCL2、BAX等，涉及蛋白結(jié)合、細胞、氧化還原過程、神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路、PI3K-Akt信號通路、AGE-RAGE信號通路等多種可能的生物功能和代謝通路，通過調(diào)控細胞凋亡、影響神經(jīng)遞質(zhì)釋放、減輕炎癥反應(yīng)、緩解線粒體損傷等多種途徑來發(fā)揮療效。