王 琦， 李淑楨， 代冬芳， 張立雪， 吳佩鋒， 李長(zhǎng)興*

(1.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，青海 西寧 810006；2.西北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)部，甘肅 蘭州 730000)

圍絕經(jīng)期是指女性由性成熟期進(jìn)入老年期的過(guò)渡時(shí)期，最顯著的變化是卵巢功能衰退，最終卵巢內(nèi)卵泡耗竭，雌激素及抑制素水平降低，引起一系列癥狀和體征，又稱圍絕經(jīng)期綜合征[1]，其臨床癥狀比較復(fù)雜，卵巢功能減退引起的雌激素缺乏將導(dǎo)致女性出現(xiàn)絕經(jīng)晚期發(fā)生骨質(zhì)疏松和老年癡呆等疾病，嚴(yán)重影響其生活質(zhì)量[2]。雌激素-孕激素合用治療被世界衛(wèi)生組織癌癥研究機(jī)構(gòu)列在致癌物清單中[3]，故人們將目光轉(zhuǎn)到更加安全有效的植物雌激素上，植物雌激素是指存在于植物中的具有類雌激素效應(yīng)的天然產(chǎn)物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)與內(nèi)源性雌二醇(estradiol，E2)相似，根據(jù)化合物單體結(jié)構(gòu)差異可分為木脂素、異黃酮、香豆素、二苯乙烯[4]。植物雌激素為一種天然的選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑，可在體內(nèi)起到模仿或調(diào)節(jié)內(nèi)源性雌激素的作用，緩解女性圍絕經(jīng)期綜合征癥狀并防止長(zhǎng)期應(yīng)用雌激素所誘發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)[5-6]。

鬼臼是二十五味鬼臼丸的主要成分，含有木脂素等植物雌激素，臨床證實(shí)該制劑具有雌激素樣作用，對(duì)圍絕經(jīng)期綜合征有良好的預(yù)防及治療作用，在治療月經(jīng)不調(diào)、婦女血癥等方面有一定療效[7-8]，但其作用機(jī)制仍在不斷探索中。本研究通過(guò)建立圍絕經(jīng)期綜合征大鼠模型，觀察二十五味鬼臼丸對(duì)圍絕經(jīng)期綜合征大鼠血清激素水平及子宮組織中雌激素受體(estrogen receptor，ER)亞型表達(dá)的影響，以期為該制劑后續(xù)臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料

1.1 動(dòng)物 60只SPF級(jí)雌性SD大鼠，3月齡，體質(zhì)量200～220 g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心所提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(陜)2017-003，飼養(yǎng)溫度(22±1) ℃，相對(duì)濕度50%～60%，自由攝食進(jìn)水，12 h/12 h晝夜自然規(guī)律。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程遵循本單位實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)相關(guān)規(guī)定。

1.2 試劑與藥物 戊酸雌二醇片(德國(guó)拜耳公司，批號(hào)201710BJ125)；二十五味鬼臼丸(青海省藏醫(yī)院，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20140539，0.35 g×49丸/瓶，批號(hào)626189)。大鼠雌二醇(E2) ELISA試劑盒、黃體生成素(LH)ELISA試劑盒、促卵泡素(FSH)ELISA試劑盒(江蘇酶標(biāo)生物科技有限公司，批號(hào)分別為MM-0575R1、MM-0587R1、MM-0566R1)；TRIzol Reagent(美國(guó)Ambion公司，批號(hào)229001)；PCR引物由日本TaKaRa公司合成；RNA提取試劑盒、熒光定量PCR試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司，批號(hào)分別為S7513、S7422]；β-actin(英國(guó)Abcam公司，貨號(hào)ab8227)；大鼠ERα多克隆抗體、大鼠ERβ多克隆抗體(英國(guó)Abcam公司，批號(hào)分別為GR3230941-3、GR3236514-1)；脫脂奶粉、SDS-PAGE變性丙烯酰胺凝膠快速制備試劑盒、SDS-PAGE電泳液、轉(zhuǎn)膜液[生工生物工程股份(上海)有限公司，批號(hào)分別為G601BA0002、FC09DA0001、103019200520、121319200519]；彩虹245廣譜蛋白Marker(北京索萊寶生物科技有限公司，批號(hào)1223C022)；5×蛋白上樣緩沖液(武漢塞維爾生物科技有限公司，批號(hào)HJ195108)；BCA蛋白定量試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司，批號(hào)14I29C46)；ECL顯影液(愛(ài)必信上海生物科技有限公司，批號(hào)OA16)；DAPI染色液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)C1006)；Cy3標(biāo)記羊抗兔IgG(北京博奧森生物工程有限公司，批號(hào)A0516)。

1.3 儀器 高速離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)；多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；Nanodrop 2000(美國(guó)Thermo公司)；Light Cycler96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(瑞士Roche公司)；全景切片掃描儀(匈牙利3DHISTECH公司)；熒光顯微鏡(日本Nikon公司)；FlourChem R多功能成像分析系統(tǒng)(美國(guó)Protein Simple公司)。

2 方法

2.1 分組、造模及給藥 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、雌二醇組、二十五味鬼臼丸組，每組15只，模型建立方法參考文獻(xiàn)[9]，術(shù)前12 h禁食不禁水，稱定體質(zhì)量后腹腔注射10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)麻醉，左側(cè)背部最末肋骨下腋中線上距脊柱約2 cm處完整地切除雙側(cè)卵巢，假手術(shù)組剪除卵巢周圍體積等大的脂肪組織，不摘卵巢，其余各組行雙側(cè)卵巢切除術(shù)，術(shù)后肌肉注射青霉素(20 000 IU/只)預(yù)防感染，連續(xù)3 d。術(shù)后5 d，對(duì)大鼠逐只進(jìn)行陰道涂片，每天1次，連續(xù)5 d，若不出現(xiàn)動(dòng)情期反應(yīng)則表示造模成功。手術(shù)后恢復(fù)2周時(shí)開(kāi)始給藥，按照臨床等效劑量換算后，雌二醇組劑量為0.1 mg/kg，用蒸餾水配成0.01 mg/mL混懸液；二十五味鬼臼丸組劑量為360 mg/kg，蒸餾水配成0.36 g/mL混懸液；假手術(shù)組和模型組灌胃等容量生理鹽水，隔天給藥，持續(xù)8周。

2.2 樣本制備 各組大鼠末次給藥后禁食12 h，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，腹主動(dòng)脈取血5 mL，室溫靜置2 h，4 ℃、3 000 r/min離心15 min，分離血清，置于-20 ℃冰箱中保存。摘取大鼠子宮，生理鹽水沖洗，濾紙吸干組織表面水分，電子天平準(zhǔn)確稱定濕質(zhì)量，計(jì)算子宮指數(shù)(uterine index，UI)，公式為UI=子宮組織濕質(zhì)量/大鼠體質(zhì)量，取一部分置于4%多聚甲醛中固定，另一部分在液氮中保存用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 ELISA法檢測(cè)大鼠血清E2、LH、FSH水平 嚴(yán)格按照相關(guān)試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟，采用ELISA法檢測(cè)血清E2、LH、FSH水平。

2.4 RT-qPCR檢測(cè)大鼠子宮組織ERα、ERβmRNA表達(dá) 取大鼠子宮組織約100 mg，加入Trizol提取組織總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，核酸分析儀檢測(cè)RNA濃度及純度后檢測(cè)吸光度。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)條件為42 ℃，15 min；95 ℃，3 min，共40個(gè)循環(huán)。β-actin為內(nèi)參基因，記錄各樣本CT值采用2-ΔΔCT相對(duì)定量法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)，每個(gè)樣本的ΔCT=CT目的基因-CT內(nèi)參，ΔΔCT=ΔCT實(shí)驗(yàn)組-ΔCT對(duì)照組，引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

2.5 Western blot檢測(cè)大鼠子宮組織ERα、ERβ蛋白表達(dá) 從大鼠子宮組織勻漿中提取總蛋白，BCA試劑盒測(cè)定總蛋白濃度，上樣量為30 μg，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜后10%脫脂牛奶封閉2 h，PBST洗膜，4 ℃孵育多克隆抗體ERα(1∶1 000)、ERβ(1∶1 000) 10～14 h，洗膜后孵育二抗(1∶10 000)，室溫靜置1 h，洗膜，ECL顯色，曝光。采用AlphaEase FC軟件對(duì)條帶進(jìn)行分析，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算ERα、ERβ蛋白相對(duì)表達(dá)。

2.6 免疫熒光雙標(biāo)檢測(cè)ERα、ERβ蛋白表達(dá) 將大鼠子宮組織切片后放入二甲苯中，乙醇梯度脫水，蒸餾水沖洗，置于EDTA抗原修復(fù)緩沖液(pH 9.0)中，高壓抗原修復(fù)2.5 min，冷卻后將玻片置于PBS(pH 7.4)中，脫色搖床上洗滌3次，每次5 min，輕輕甩掉封閉液，滴加ERα一抗(1∶200)、ERβ一抗(1∶200)，4 ℃孵育過(guò)夜，加入熒光標(biāo)記二抗(1∶300)，37 ℃孵育1 h，DAPI復(fù)染細(xì)胞核封片，在熒光顯微鏡下觀察拍照，圖像用Image J 6.0軟件分析，計(jì)算平均熒光強(qiáng)度。

3 結(jié)果

3.1 二十五味鬼臼丸對(duì)大鼠子宮指數(shù)的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠子宮指數(shù)降低(P<0.01)；給藥8周后，與模型組比較，二十五味鬼臼丸組、雌二醇組大鼠子宮指數(shù)升高(P<0.05，P<0.01)，見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠體質(zhì)量、子宮指數(shù)

3.2 二十五味鬼臼丸對(duì)大鼠血清E2、LH、FSH水平的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清E2水平降低(P<0.01)，LH、FSH水平升高(P<0.01)；與模型組比較，二十五味鬼臼丸組、雌二醇組大鼠血清E2水平升高(P<0.01)，LH、FSH水平降低(P<0.05，P<0.01)，見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠血清E2、LH、FSH的水平

3.3 二十五味鬼臼丸對(duì)大鼠子宮組織ERα、ERβmRNA表達(dá)的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠子宮組織ERα、ERβmRNA表達(dá)均降低(P<0.01)；與模型組比較，二十五味鬼臼丸組大鼠子宮組織ERαmRNA表達(dá)無(wú)明顯變化(P>0.05)，ERβmRNA表達(dá)升高(P<0.05)，而雌二醇組兩者mRNA表達(dá)均升高(P<0.01)，見(jiàn)圖1。

注：與假手術(shù)組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。圖1 各組大鼠子宮組織ERα、ERβ mRNA表達(dá)Fig.1 mRNA expressions of ERα and ERβ in uterine tissue of rats in various

3.4 二十五味鬼臼丸對(duì)大鼠子宮組織ERα、ERβ蛋白表達(dá)的影響 與假手術(shù)組比較，模型組ERα、ERβ蛋白表達(dá)降低(P<0.01)；與模型組比較，二十五味鬼臼丸組ERα蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化(P>0.05)，ERβ蛋白表達(dá)升高(P<0.01)，而雌二醇組兩者蛋白表達(dá)均升高(P<0.01)，見(jiàn)圖2。

注：A為Western blot條帶，B為半定量分析。與假手術(shù)組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01。圖2 各組大鼠子宮組織ERα、ERβ蛋白表達(dá)Fig.2 Protein expressions of ERα and ERβ in uterine tissue of rats in various groups

注：與假手術(shù)組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01。圖3 各組大鼠子宮組織ERα、ERβ熒光染色(×200)Fig.3 Fluorescence staining of ERα and ERβ in uterus tissues of rats in various groups (×200)

3.5 免疫熒光雙標(biāo)檢測(cè)大鼠子宮組織ERα、ERβ蛋白表達(dá) 免疫熒光染色(圖3)顯示，ERα蛋白表達(dá)陽(yáng)性為紅色，ERβ蛋白表達(dá)陽(yáng)性為綠色。ERα免疫熒光強(qiáng)度結(jié)果(圖4)顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠子宮組織ERα平均熒光強(qiáng)度降低(P<0.01)；與模型組比較，二十五味鬼臼丸組大鼠子宮組織ERα平均熒光強(qiáng)度無(wú)明顯變化(P>0.05)，而雌二醇組其平均熒光強(qiáng)度升高(P<0.01)。ERβ免疫熒光強(qiáng)度結(jié)果(圖4)顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠子宮組織ERβ平均熒光強(qiáng)度降低(P<0.01)；與模型組比較，二十五味鬼臼丸組、雌二醇組大鼠子宮組織平均熒光強(qiáng)度升高(P<0.01)。

注：與假手術(shù)組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01。圖4 各組大鼠子宮組織ERα、ERβ熒光強(qiáng)度Fig.4 Fluorescence intensities of ERα and ERβ in uterine tissue of rats in various groups

4 討論

雌二醇(E2)是人體內(nèi)生物活性最強(qiáng)的雌激素，通過(guò)與ER結(jié)合在體內(nèi)發(fā)揮作用，其作用與ER的類型和數(shù)量有關(guān)[10]。ER屬于核受體超家族，其亞型包括經(jīng)典的核受體ERα、ERβ。近年來(lái)，植物雌激素被稱為“選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑”，其化學(xué)結(jié)構(gòu)與內(nèi)源性雌激素E2結(jié)構(gòu)相似，也可結(jié)合體內(nèi)的ER，在體內(nèi)具有雙重調(diào)節(jié)作用[11-12]。在體內(nèi)雌激素水平較低時(shí)，其與ER結(jié)合，發(fā)揮雌激素樣作用；雌激素水平較高時(shí)，其與ER競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合阻止強(qiáng)活性的E2與ER結(jié)合，發(fā)揮拮抗雌激素的作用[13]。經(jīng)典的雌激素作用通路是雌激素首先與相應(yīng)的ER結(jié)合，ER被雌激素樣化合物激活后，ER受體二聚化形成二聚體復(fù)合物 (ERα-α、ERα-β、ERβ-β)，ER以二聚體的形式結(jié)合到靶基因的雌激素反應(yīng)元件序列并激活靶基因[14-15]。

圍絕經(jīng)期綜合征由一系列精神及軀體表現(xiàn)組成，其發(fā)病機(jī)理復(fù)雜，圍絕經(jīng)期婦女各項(xiàng)生理功能都會(huì)出現(xiàn)不同程度的異常，主要表現(xiàn)為月經(jīng)變化、乏力、情緒易激動(dòng)、多慮、抑郁、心悸、失眠等[16]。最早表現(xiàn)為卵巢功能衰退，繼而表現(xiàn)為下丘腦-垂體功能退化，激素水平改變，主要表現(xiàn)為E2和FSH、LH，分泌抑制垂體的因子減少，導(dǎo)致下丘腦-垂體負(fù)反饋功能障礙，出現(xiàn)下丘腦-垂體-卵巢軸失衡[17-18]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建圍絕經(jīng)期綜合征大鼠模型，用二十五味鬼臼丸干預(yù)治療，觀察其對(duì)UI、子宮血清激素變化及子宮ER表達(dá)的影響。研究結(jié)果顯示，與模型組比較，二十五味鬼臼丸組UI及血清E2水平升高，而LH、FSH水平降低，說(shuō)明二十五味鬼臼丸有效改善圍絕經(jīng)期綜合征所引起的激素紊亂。RT-qPCR結(jié)果顯示，模型組ERα、ERβmRNA表達(dá)降低，二十五味鬼臼丸組子宮ERαmRNA表達(dá)無(wú)明顯變化，而ERβmRNA表達(dá)升高；Western blot及免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果顯示，二十五味鬼臼丸主要通過(guò)ERβ提高ER的生物學(xué)效應(yīng)，這與王婷等[19]研究發(fā)現(xiàn)，4種木脂素類植物雌激素與對(duì)ERβ結(jié)合親和力均高于ERα的研究一致。陳嘉彥等[20]研究發(fā)現(xiàn)，正常子宮內(nèi)膜組織中ERβ蛋白陽(yáng)性表達(dá)率高于子宮內(nèi)膜癌組織中ERβ蛋白陽(yáng)性表達(dá)率，ERβ的下調(diào)可能與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生有關(guān)。因此，與其他對(duì)ERα親和力較高的植物雌激素相比，選擇性激動(dòng)ERβ不會(huì)引起相應(yīng)的細(xì)胞增殖作用，二十五味鬼臼丸可通過(guò)提高大鼠子宮ERβ表達(dá)，改善大鼠血清激素水平，可能是其治療圍絕經(jīng)期綜合征的作用機(jī)制之一。

綜上，本研究初步確定二十五味鬼臼丸對(duì)圍絕經(jīng)期綜合征大鼠血清激素及子宮組織中ERβ具有調(diào)控作用，表現(xiàn)出二十五味鬼臼丸類似選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑作用，為藏藥二十五味鬼臼丸發(fā)揮的臨床應(yīng)用的有效性和安全性提供了依據(jù)。