羅 悅， 劉小慧， 魏承亮， 段 麗， 劉朝奇， 賀海波， 蔡三金*

(1.三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 宜昌 443002；2.三峽大學(xué)生物與制藥學(xué)院，湖北 宜昌 443002)

隨著生活方式的改變，非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)全球發(fā)病率高達(dá)25%，為肝細(xì)胞癌的主要病因之一[1-2]?！岸嘀卮驌簟奔僬f指出，肝細(xì)胞脂質(zhì)過度積累和肝細(xì)胞炎癥環(huán)境是導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷、激活肝細(xì)胞死亡、促進(jìn)星狀細(xì)胞活化、纖維基質(zhì)沉積的重要因素[3-4]。

miRNA是一類長度約為22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，可以通過靶向mRNA并抑制其翻譯或促進(jìn)其降解在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)。有研究指出，miR-181a在NAFLD患者、高脂飲食小鼠及ob/ob小鼠的血液和肝臟中高度表達(dá)，并在NAFLD中作用顯著[5]。

過氧化物酶體增殖物激活受體α(peroxisome proliferator activated receptor α，PPARα)是一種配體誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子，在能量代謝、肝功能、炎癥、細(xì)胞周期改變和嚙齒動(dòng)物肝癌發(fā)生中起關(guān)鍵作用[6]。有研究報(bào)道，敲除肝細(xì)胞特異性PPARα基因?qū)е滦∈蟾闻K和全身脂肪酸動(dòng)態(tài)平衡受損，可見PPARα與NAFLD發(fā)展密切相關(guān)[7]。

目前，臨床上仍缺乏針對治療NAFLD的公認(rèn)藥物[8]。竹節(jié)參PanaxjaponicusC．A．Meyer是五加科人參屬多年生草本植物，具有散瘀止血、消腫止痛、止咳祛痰、補(bǔ)虛強(qiáng)壯的功效，竹節(jié)參總皂苷是其主要活性成分[9]，具有減輕腸道炎癥反應(yīng)、改善小鼠脂肪性肝病作用[10-11]。本研究利用高脂飲食建立NAFLD小鼠，并使用不同劑量竹節(jié)參總皂苷干預(yù)，為相關(guān)防治提供新的思路。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)雄性BALB/c小鼠40只，飼養(yǎng)于三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(鄂) 2017-0012]。所有操作都遵循倫理委員會(huì)相關(guān)動(dòng)物使用和保護(hù)規(guī)定，倫理審查表編號(hào)2013090B。

1.2 試劑及藥物 竹節(jié)參購于恩施竹節(jié)參種植基地，經(jīng)湖北省天然產(chǎn)物研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室汪鋆植教授鑒定為正品。竹節(jié)參總皂苷采用醇提法提取，大孔樹脂吸附法純化[12]。丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)試劑盒、甘油三酯(TG)試劑盒均購于中生北控生物科技有限公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Prefect Real Time)(日本TaKaRa公司，貨號(hào)RR047A)；Green Taq Mix(南京諾唯贊生物科技有限公司，P131-03)；抗體TLR4(美國Santa Cruz公司，貨號(hào)SC-293072)、p-STAT1(美國Cell Signaling公司，貨號(hào)8826)、β-actin(美國Cell Signaling公司，貨號(hào)4970L)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。其余試劑均為分析純。

1.3 儀器 PowerPas Basic電泳儀(美國Bio-Rad公司)；核酸蛋白分析儀(美國Beckman公司)； Gene Genius凝膠分析系統(tǒng)(英國Syngene公司)；Step One Plus 實(shí)時(shí)定量PCR儀(美國Applied Biosystem公司)；梯度PCR儀(美國Applied Biosystem公司)；Gel Logic-200凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Kodak公司)；全波長酶標(biāo)儀(美國 Thermo公司)。

2 方法

2.1 分組及給藥 將小鼠隨機(jī)分為正常飲食組、模型組、竹節(jié)參總皂苷低劑量組、竹節(jié)參總皂苷高劑量組，除正常飲食組外(標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng))其他3組給予華阜康公司高脂飼料(H10060)喂養(yǎng)，同時(shí)竹節(jié)參總皂苷組灌胃不同劑量藥物(15、45 mg/kg，溶于生理鹽水)，正常飲食組予等量的生理鹽水灌胃，飼養(yǎng)19周，每2 d記錄1次體質(zhì)量。

2.2 標(biāo)本采集 將喂養(yǎng)19周后的小鼠稱定質(zhì)量，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，取血，血液靜置于37 ℃下1 h，3 000 r/min離心10 min，收集血清。小鼠脫頸椎處死，切取肝臟，生理鹽水沖洗并稱質(zhì)量，切取肝大葉中部長度、厚度適中部分置于包埋夾中，多聚甲醛固定，剩余新鮮肝臟組織置于1.5 mL離心管中，在-80 ℃下保存。

2.3 小鼠血清ALT活性檢測 新鮮小鼠血清使用多功能酶標(biāo)儀檢測ALT活性，具體方法參照試劑盒說明書。

2.4 小鼠肝臟組織TG水平檢測 稱取小鼠新鮮肝臟50 mg，浸于1 mL無水乙醇，置于1.5 mL離心管中，充分研磨后室溫抽提24 h，5 000 r/min離心5 min，收集上層澄清抽提液，使用多功能酶標(biāo)儀檢測TG水平。

2.5 小鼠肝臟組織HE染色 小鼠肝組織固定完成后修整大小，乙醇梯度脫水，石蠟包埋，切片(厚度4 μm)，常規(guī)HE染色，在顯微鏡下觀察。

2.6 RT-PCR與RT-qPCR檢測SREBP-1c、ChREBP、IL-1β、TNFα、miR-181a、PPARαmRNA表達(dá) 稱取小鼠新鮮肝臟50 mg至1.5 mL EP管中，使用Trizol充分裂解并提取總RNA，電泳檢測RNA完整性，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)獲得cDNA，RT-PCR技術(shù)驗(yàn)證引物，2%瓊脂糖凝膠電泳(內(nèi)參β-actin)，成像系統(tǒng)中拍攝分析。miR-181a以U6作為內(nèi)參，在實(shí)時(shí)定量PCR儀中擴(kuò)增并測量繪制擴(kuò)增曲線，反應(yīng)體系為5 μL SYBR Green，2.4 μL RNase-free water，0.4 μL引物(濃度為10 μmol/L)，2 μL cDNA(逆轉(zhuǎn)后稀釋10倍)，0.2 μL ROX。反應(yīng)結(jié)束后讀取CT值，計(jì)算2-ΔΔCT，引物序列見表1。

表1 引物序列

2.7 Western blot法檢測p-STAT、TLR4蛋白表達(dá) 稱取小鼠肝臟組織適量，加入RIPA蛋白裂解液充分勻漿后，在4 ℃下提取30 min后，12 000 r/min離心10 min，收集上清為組織總蛋白，應(yīng)用BCA蛋白定量法檢測蛋白濃度，加入蛋白上樣緩沖液，制備滅活樣品。經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分離后，按照蛋白分子大小切取相應(yīng)凝膠片段，采用濕法轉(zhuǎn)膜將蛋白條帶轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，經(jīng)牛奶封閉、孵育一抗、洗膜、孵育二抗、洗膜等步驟后，X光片顯影，掃描圖像，Image J軟件分析蛋白表達(dá)。

3 結(jié)果

3.1 竹節(jié)參總皂苷對高脂飲食小鼠體質(zhì)量及肝質(zhì)量指數(shù)的影響 小鼠給予高脂飼料喂養(yǎng)19周后，體質(zhì)量及肝質(zhì)量指數(shù)較正常組升高(P<0.05，P<0.01)；經(jīng)竹節(jié)參總皂苷藥物干預(yù)后，小鼠體質(zhì)量及肝質(zhì)量指數(shù)下降(P<0.05，P<0.01)，見表2。

表2 竹節(jié)參總皂苷對高脂飲食小鼠體質(zhì)量及肝質(zhì)量指數(shù)的影響

3.2 竹節(jié)參總皂苷對高脂飲食小鼠血液中ALT活性及肝組織TG水平的影響 小鼠給予19周高脂飼料喂養(yǎng)后，血液中ALT活性及肝組織TG水平升高，與正常組比較具有顯著差異(P<0.05)；與模型組比較，竹節(jié)參總皂苷低、高劑量干預(yù)后，血清中ALT活性及肝組織TG水平降低(P<0.05)，見圖1。

注：與正常組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。圖1 竹節(jié)參總皂苷對高脂飲食小鼠血液中ALT及肝組織TG的影響

3.3 竹節(jié)參總皂苷改善高脂飲食小鼠肝組織病理變化 小鼠給予高脂飼料喂養(yǎng)19周后，肝小葉結(jié)構(gòu)不完整，肝臟細(xì)胞腫脹、變圓，排列不規(guī)則，可見彌漫性的脂質(zhì)空泡，并有融合現(xiàn)象，伴隨炎性細(xì)胞浸潤，結(jié)合“3.1”“3.2”項(xiàng)下結(jié)果證明模型構(gòu)建成功[13]；經(jīng)竹節(jié)參總皂苷干預(yù)后，肝組織病理變化改善明顯，肝索排列較整齊，脂肪空泡明顯減少，肝組織炎癥浸潤現(xiàn)象輕微，見圖2。

注：黑色剪頭指示脂質(zhì)空泡位置。圖2 高脂飲食小鼠肝組織HE染色(×200)

3.4 竹節(jié)參總皂苷調(diào)節(jié)高脂飲食小鼠肝臟脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的表達(dá) 與正常組比較，模型組小鼠肝臟組織中脂質(zhì)代謝相關(guān)基因SREBP-1c、ChREBPmRNA表達(dá)升高(P<0.05)，高脂飲食引起小鼠肝臟脂質(zhì)代謝紊亂；竹節(jié)參總皂苷干預(yù)后SREBP-1c、ChREBPmRNA表達(dá)降低(P<0.05)，見圖3。

注：與正常組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。圖3 竹節(jié)參總皂苷對高脂飲食小鼠肝組織中脂質(zhì)代謝及炎癥相關(guān)基因表達(dá)的影響

3.5 竹節(jié)參總皂苷調(diào)節(jié)高脂飲食小鼠肝臟組織炎癥相關(guān)基因及蛋白表達(dá) 小鼠高脂飼料喂養(yǎng)19周后，肝臟組織中TLR4、p-STAT1蛋白表達(dá)升高，見圖4；TNFα、IL-1βmRNA表達(dá)也較正常飲食組高(P<0.05)，見圖3；低、高劑量竹節(jié)參總皂苷干預(yù)后，上述指標(biāo)均有所下降，并趨于正常水平。

注：與正常組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。圖4 竹節(jié)參總皂苷對高脂飲食小鼠肝臟組織中炎癥相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3.6 竹節(jié)參總皂苷調(diào)節(jié)高脂飲食小鼠肝臟組織miR-181a及PPARα基因表達(dá)PPARα基因表達(dá)在小鼠肝組織中下降(P<0.05)，而經(jīng)竹節(jié)參總皂苷干預(yù)后升高，并趨于正常組水平，見圖3。同時(shí)，PPARα可作為miR-181a的靶蛋白，見圖5。模型組miR-181a基因表達(dá)較正常組升高，竹節(jié)參總皂苷干預(yù)后其表達(dá)呈下降趨勢(P<0.05)，見圖6。

圖5 miR-181a和PPARα 3′UTR之間預(yù)測堿基配對

注：與正常組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。圖6 竹節(jié)參總皂苷對高脂飲食小鼠肝臟組織中miR-181a基因表達(dá)的影響

4 討論

miRNAs通過參與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控干擾目標(biāo)基因的表達(dá)，miRNA-181a是其中的一員，可調(diào)節(jié)基因表達(dá)所引起的肝臟代謝紊亂及應(yīng)激激活途徑，從而影響NAFLD及其向疾病更嚴(yán)重階段的發(fā)展[14]。NAFLD患者及動(dòng)物中顯著上調(diào)的miR-181a可損害肝臟葡萄糖、脂質(zhì)平衡，而miR-181a可直接靶向PPARα，激活TLR4/NF-κB途徑，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)[15-16]。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，NAFLD發(fā)生發(fā)展與miR-181a/PPARα信號(hào)通路相關(guān)，而竹節(jié)參總皂苷可通過調(diào)控該信號(hào)通路對NAFLD起到干預(yù)作用。

PPARα可同時(shí)參與NAFLD脂質(zhì)代謝及炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)過程[17]，通過LXR途徑調(diào)節(jié)SREBP-1c、ChREBP水平[18-19]，調(diào)控乙酰輔酶a羧化酶(acetyl-CoA carboxylase，ACC)和脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，F(xiàn)AS)活性[20-21]，干預(yù)肝臟脂肪酸催化合成。抑制PPARα表達(dá)時(shí)，肝臟儲(chǔ)存過量的脂肪酸，破壞其生理適應(yīng)機(jī)制，引起活性氧形成、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、肝細(xì)胞功能障礙和損傷，導(dǎo)致脂毒性炎癥發(fā)生[22]。脂毒性應(yīng)激時(shí)Toll樣受體4(toll-like receptor 4，TLR4)被激活，一方面通過MyD88依賴途徑激活NF-κB誘導(dǎo)炎癥介質(zhì)IL-1β、TNFα的釋放[23]；另一方面通過MyD88和TRIF依賴性信號(hào)誘導(dǎo)STAT1在Ser727處的快速磷酸化，并形成同源二聚體進(jìn)一步遷移到細(xì)胞核中驅(qū)動(dòng)下游炎癥途徑，激化炎性反應(yīng)[24-25]，而PPARα可抑制TLR4表達(dá)來減輕炎癥水平[26]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，竹節(jié)參總皂苷可能通過調(diào)節(jié)PPARα/SREBP-1c、ChREBP的脂毒性及PPARα/TLR4/STAT1的炎癥反應(yīng)信號(hào)通路，達(dá)到改善NAFLD的作用。

綜上所述，miR-181a/PPARα及其介導(dǎo)的SREBP-1c、ChREBP及TLR4/STAT1信號(hào)通路促進(jìn)NAFLD的發(fā)生與發(fā)展，而竹節(jié)參總皂苷可通過調(diào)控上述信號(hào)通路對NAFLD起到治療作用，為相關(guān)防治提供了新方向。