麥天賦，冼曉暉，黃敏詩，莊智杰，李明意

1廣東醫(yī)科大學附屬醫(yī)院小兒外科，廣東湛江524000；2廣東醫(yī)科大學附屬醫(yī)院肝膽外科

肝母細胞瘤(HB)是兒童時期最常見的惡性肝臟腫瘤，大多數(shù)患兒在5歲以內(nèi)發(fā)病。在過去30年里，得益于化療方案、成像方式和手術(shù)管理方面的進步，HB的總體存活率從30%增加到70%[1]。競爭性手術(shù)切除術(shù)是治療HB的主要手段，但是大量病例因腫瘤體積大、多灶或靠近主要血管而無法切除。輔助化療可使腫瘤縮小而易于切除，并顯著改善HB患者的預后和生存率[2-3]。蒽環(huán)類藥物吡柔比星(THP)是HB的主要化療藥物之一，具有潛在的心臟毒性[4]。臨床上多采用聯(lián)合化療提高藥物的治療效果，而藥物的毒性不能重疊。二氫楊梅素(DHM)是存在于藤茶中的一種黃酮類化合物，具有抗炎、抗腫瘤、護肝等多種藥理學活性[5]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，DHM不僅能抑制肝癌細胞增殖并誘導其凋亡[6]，而且還能增強肝癌細胞對奈達鉑的化療效果[7]。但目前尚不清楚DHM對HB的作用及機制，其與THP聯(lián)合作用的效果也有待探討。活性氧(ROS)被認為是DNA損傷的介質(zhì)，能夠觸發(fā)腫瘤的程序性細胞死亡[8]。某些化療藥物通過形成線粒體DNA加合物來增加線粒體ROS生成，因此促氧化應激策略可作為增強化療效果的輔助手段。此外，除了殺傷腫瘤細胞，化療藥物也可能引起正常組織細胞中ROS水平增加，這是化療藥物產(chǎn)生毒副作用的一個重要原因。因此，聯(lián)合化療在增強療效的同時，應盡量避免ROS誘導的不良反應。研究表明，磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)通路失調(diào)幾乎存在于所有癌癥包括HB中[9]，通過阻斷PI3K介導的Akt活化能夠抑制腫瘤細胞增殖并促使其凋亡[10]。因此，靶向PI3K/Akt通路可能成為抗HB的潛在治療方向。2020年9月—2021年9月，我們觀察了THP、DHM單用及聯(lián)合作用在體外對人肝母細胞瘤細胞株HuH-6增殖和凋亡相關(guān)通路的影響，及其對人心肌細胞株AC16的毒性，旨在了解DHM能否在不增加心臟毒性的基礎上增強THP對HB的化療療效，并探討其作用機制與Akt活化的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞與藥物 人HB細胞株HuH-6和人心肌細胞株AC16，購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心細胞庫。THP和DHM購自上海皓元生物醫(yī)藥科技有限公司。

1.1.2 主要試劑 低糖DMEM培養(yǎng)基、高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈霉素溶液、胰蛋白酶購自美國Gibco公司；CCK-8試劑盒、乳酸脫氫酶細胞毒性檢測試劑盒、活性氧檢測試劑盒、Western blotting及IP細胞裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、ECL化學發(fā)光試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；AnnexinⅤ-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司；β肌動蛋白(β-actin)、增殖細胞核抗原(PCNA)、Akt、磷酸化Akt(p-Akt)、B淋巴細胞瘤2(Bcl-2)、Bcl-2關(guān)聯(lián)X蛋白(Bax)、半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)、半胱氨酸蛋白酶9(caspase-9)、裂解的半胱氨酸蛋白酶-3(cleaved caspase-3)、5-溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)抗體和二抗購自美國CST公司。

1.1.3 主要儀器 CO2細胞培養(yǎng)箱(美國賽默飛)，熒光倒置顯微鏡(德國萊卡)，Tanon5200成像系統(tǒng)(上海天能)，高速冷凍離心機(美國賽默飛)，流式細胞儀，酶標儀(美國賽默飛)。

1.2 細胞培養(yǎng) 取HuH-6和AC16細胞，分別加入含10%胎牛血清的高糖和低糖DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞融合度約90%時，進行傳代接種。

1.3 DHM最佳作用濃度的篩選 取對數(shù)生長期HuH-6和AC16細胞，以3×103/孔的密度接種于96孔細胞培養(yǎng)板，待細胞融合度達到約70%，用不含胎牛血清的基礎培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)24 h，以獲得同步化生長。將細胞分為6組，分別加入0、100、150、200、250、300 μmol/L DHM，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。采用CCK-8法檢測細胞活性。每孔加入100 μL稀釋的CCK-8溶液，37 ℃孵育3 h，用酶標儀測量450 nm波長處的光密度(OD)值，以此代表細胞活性。選擇能夠有效抑制HuH-6細胞活性且對AC16細胞毒性作用最弱的濃度作為DHM的最佳作用濃度。

1.4 與DHM聯(lián)合作用的THP最佳濃度篩選

1.4.1 HuH-6細胞活性檢測 取對數(shù)生長期HuH-6細胞，以3×103/孔接種于96孔細胞培養(yǎng)板，待細胞融合度達到約70%，用不含胎牛血清的基礎培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)24 h，以獲得同步化生長。將細胞分為6組：①Ctrl組為正常培養(yǎng)的細胞；②DHM組給予2最佳作用濃度的DHM處理；③DHM+4、6、8、10 μmol/L THP組細胞分別給予最佳作用濃度的DHM與4、6、8、10 μmol/L THP混合液處理。各組置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。采用CCK-8法檢測細胞活性，具體步驟同“1.3”。

1.4.2 AC16細胞毒性反應觀察 取對數(shù)生長期AC16細胞，按照“1.4.1”的方法進行培養(yǎng)、分組和給藥。取處理后的AC16細胞，采用LDH釋放試驗檢測細胞毒性。以400 g離心5 min，取上清液。PBS沖洗，加入150 μL LDH釋放試劑孵育1 h，以400 g離心5 min，取上清液。將兩次獲得的上清液混合，加入60 μL LDH檢測液，室溫避光孵育30 min，上酶標儀在490 nm波長處讀取OD值。LDH釋放率(%)=[細胞培養(yǎng)液上清中的LDH/(細胞培養(yǎng)液上清中的LDH+細胞內(nèi)的LDH)]×100%。

1.5 細胞內(nèi)ROS水平檢測 采用探針法。取對數(shù)生長期AC16細胞，待細胞融合度達到約70%時，進行24 h饑餓培養(yǎng)。將細胞分為4組：①Ctrl組，加入含2%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基正常培養(yǎng)；②DHM組，加入DHM；③THP組，加入THP；④DHM+THP組，同時加入DHM和THP。培養(yǎng)48 h后，加入胰酶消化，以200 g離心5 min，收集細胞沉淀。加入終濃度10 μmol/L的DCFH-DA，37 ℃孵育20 min。PBS清洗3次，上流式細胞儀檢測細胞的平均熒光強度，檢測的激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為525 nm。由于DCFH-DA本身沒有熒光，但其進入細胞內(nèi)被酯酶水解生成DCFH，經(jīng)細胞內(nèi)的ROS氧化成有熒光的DCF，因此通過檢測DCF熒光強度可反映細胞內(nèi)ROS水平。

1.6 細胞增殖檢測 采用BrdU摻入法。取對數(shù)生長期HuH-6細胞，接種于24孔細胞培養(yǎng)板，按照“1.5”的方法進行分組和給藥，處理48 h后，加入10 μmol/L BrdU溶液孵育1 h。室溫下用4%多聚甲醛固定細胞30 min，用0.2% Triton X-100透化30 min。加入1 mol/L鹽酸冰上孵育10 min，加入2 mol/L鹽酸室溫孵育10 min，轉(zhuǎn)37 ℃孵育20 min，然后用0.1 mol/L硼酸鈉緩沖液(pH 8.4)中和12 min。PBS清洗3次，加入免疫染色封閉液室溫封閉1 h，加入抗BrdU抗體(1∶500稀釋)4 ℃孵育過夜。PBS清洗3次，滴加FITC標記的二抗，室溫避光孵育1 h。細胞核用DAPI復染后，用熒光倒置相差顯微鏡拍照，計算BrdU陽性率，用來表示細胞增殖情況。

1.7 細胞凋亡檢測 采用流式細胞術(shù)。取對數(shù)生長期HuH-6細胞，按照“1.5”的方法進行分組和給藥，處理48 h后，加入胰酶消化，以1×Binding Buffer重懸細胞，調(diào)整細胞密度為1×106/mL。取100 μL細胞懸液加入流式管中，加入Annexin V-FITC和PI各5 μL，室溫避光孵育15 min。補加400 μL 1×Binding Buffer，1 h內(nèi)上流式細胞儀檢測。計數(shù)FITC陽性和PI陽性細胞數(shù)量，以Q4象限(FITC陽性)代表早期凋亡，Q2象限(FITC陽性/PI陽性)代表晚期凋亡，計算細胞早期凋亡率和晚期凋亡率。

1.8 細胞中Akt、細胞增殖及凋亡相關(guān)蛋白表達檢測 采用Western blotting法檢測Akt、p-Akt，細胞增殖相關(guān)蛋白PCNA，以及細胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、caspase-3、caspase-9、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9表達水平。提取各組HuH-6細胞的總蛋白，加入上樣緩沖液煮沸5 min使蛋白變性。用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，然后將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜，用5%脫脂奶粉在室溫下封閉1 h。加入Akt、p-Akt、PCNA、Bcl-2、Bax、caspase-3、caspase-9、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9(稀釋比例均為1∶1 000)和內(nèi)參β-actin一抗溶液，4 ℃孵育過夜。TBST洗膜3次，加入相應的二抗溶液(稀釋比例均為1∶2 000)孵育1 h。TBST洗膜3次，ECL化學發(fā)光液顯影，Image J軟件分析蛋白條帶的灰度值，以目標蛋白條帶與內(nèi)參β-actin條帶灰度值的比值表示目標蛋白的相對表達量。以p-Akt/Akt表示Akt活化水平，Bcl-2/Bax表示細胞凋亡狀態(tài)，cleaved caspase-3/caspase-3和cleaved caspase-9/caspase-9表示caspase-3和caspase-9的裂解程度。

2 結(jié)果

2.1 DHM最佳作用濃度篩選結(jié)果 在HuH-6細胞中，與0 μmol/L DHM相比，150、200、250、300 μmol/L DHM作用下細胞活性均降低，其中250 μmol/L低于其他濃度(P均<0.05)。在AC16細胞中，與0 μmol/L DHM相比，100～250 μmol/L DHM作用下細胞活性無明顯變化(P均>0.05)，表明DHM在此濃度范圍內(nèi)對心肌細胞無明顯毒性作用。見表1。故選擇250 μmol/L作為DHM的最佳作用濃度。

表1 不同濃度DHM對HuH-6和AC16細胞活性的影響

2.2 與DHM聯(lián)合作用的THP最佳濃度篩選結(jié)果 在HuH-6細胞中，DHM+4、6、8、10 μmol/L THP組細胞活性均低于Ctrl組和DHM組(P均<0.05)，其中DHM+6、8 μmol/L THP組細胞活性低于DHM+4、10 μmol/L THP組(P<0.05)。在AC16細胞中，DHM+4、6、8、10 μmol/L THP組細胞LDH釋放率均高于Ctrl組和DHM組(P均<0.05)，其中DHM+6 μmol/L THP組LDH釋放率稍低于其他濃度組(P>0.05)。見表2。因此，250 μmol/L DHM聯(lián)合6 μmol/L THP組在有效抑制HuH-6細胞活性的同時，對AC16細胞的毒性作用最弱，故選擇250 μmol/L DHM聯(lián)合6 μmol/L THP作為最佳作用濃度進行后續(xù)實驗。

表2 DHM聯(lián)合THP對HuH-6細胞活性和AC16細胞毒性的影響

2.3 DHM聯(lián)合THP對AC16細胞ROS生成的影響 Ctrl組、DHM組、THP組、DHM+THP組細胞ROS水平分別為189.30±5.13、260.00±1.00、378.30±4.16、312.30±14.45，DHM組、THP組、DHM+THP組ROS水平均高于Ctrl組(P均<0.05)，DHM+THP組低于THP組(P<0.05)。

2.4 DHM聯(lián)合THP對HuH-6細胞增殖的影響 Ctrl組、DHM組、THP組、DHM+THP組BrdU陽性率分別為18.74%±1.76%、13.09%±1.47%、4.32%±0.99%、1.96%±0.84%%。與Ctrl組相比，DHM組、THP組、DHM+THP組BrdU陽性率均降低(P均<0.05)；與DHM組比較，THP組、DHM+THP組BrdU陽性率降低(P均<0.05)，DHM+THP組與THP組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.5 DHM聯(lián)合THP對HuH-6細胞凋亡的影響 與Ctrl組相比，DHM、THP、DHM+THP組早、晚期凋亡率均增加(P均<0.05)；與DHM組相比，THP組早期凋亡率降低而晚期凋亡率增加(P均<0.05)，DHM+THP組早、晚期凋亡率均增加(P均<0.05)；與THP組相比，DHM+THP組早期凋亡率升高而晚期凋亡率降低(P均<0.05)。見表3。

表3 DHM聯(lián)合THP對HuH-6細胞凋亡的影響

2.6 DHM聯(lián)合THP對細胞Akt活化及細胞增殖和凋亡相關(guān)蛋白表達的影響 與Ctrl組相比，DHM組和DHM+THP組p-Akt/Akt水平降低，DHM組、THP組和DHM+THP組PCNA、Bcl-2/Bax水平降低，DHM組、THP組和DHM+THP組cleaved caspase-3/caspase-3、cleaved caspase-9/caspase-9水平升高(P均<0.05)。與DHM組和THP組相比，DHM+THP組p-Akt/Akt、PCNA、Bcl-2/Bax水平降低，cleaved caspase-3/caspase-3、cleaved caspase-9/caspase-9水平升高(P均<0.05)。見表4。

3 討論

HB是兒童時期最常見的惡性肝腫瘤，手術(shù)切除前后化療可顯著改善HB患兒的預后。目前針對HB的主要化療藥物包括順鉑、阿霉素、多柔吡星和THP等，但是這些藥物具有耳腎毒性或心臟毒性。聯(lián)合化療指用兩種或多種化療藥物進行化療，目前臨床上多采用聯(lián)合化療以提高藥物的抗腫瘤效果，然而，聯(lián)合化療的毒副作用若有增強則不適用，特別是對于心肺功能差的患者。因此，本研究目的在于探究作用機制不完全相同且毒性不疊加的聯(lián)合化療藥物組合，以增加化療藥物對HB的治療效果。腫瘤聯(lián)合化療的基本原則是：組成方案的各種藥物均有效；所用藥物的作用機制和作用時相各不相同；各種藥物之間可能互相增效；各種藥物的毒性作用不重疊[11]。DHM是一種多酚羥基雙氫黃酮醇類化合物，具有護肝、抗氧化、抗菌以及抑制腫瘤(如肝癌、乳腺癌、卵巢癌等)作用。既往研究顯示，DHM能夠抑制肝癌細胞增殖并促進其凋亡，但對正常肝細胞不具有毒性[6]。心臟毒性是蒽環(huán)類藥物最嚴重的不良反應，因此HB患兒在應用這類藥物時需早期監(jiān)測其心臟毒性[12]。本研究采用常見的人源性心肌細胞株AC16在體外評估DHM與THP聯(lián)合化療的心臟毒性，結(jié)果顯示，DHM在100～250 μmol/L范圍內(nèi)均不影響AC16細胞的存活，并且250 μmol/L DHM能最有效地抑制HuH-6細胞活性，因此將250 μmol/L作為DHM的最佳作用濃度；進一步觀察顯示，250 μmol/L DHM+6 μmol/L THP對HuH-6細胞有更好的抗腫瘤活性，并且對AC16細胞的毒性作用最弱。

表4 DHM聯(lián)合THP對細胞Akt活化及細胞增殖和凋亡相關(guān)蛋白表達的影響

ROS是一組短壽命、高活性的含氧分子，ROS蓄積不僅通過對腫瘤細胞存活或死亡信號級聯(lián)的調(diào)控而參與介導化療反應[13]，還對正常組織細胞造成損傷。因此，本研究通過檢測AC16細胞內(nèi)ROS水平，從氧化應激方面探討DHM與THP聯(lián)合作用誘導心臟毒性的可能機制。CCK-8、LDH釋放和ROS檢測結(jié)果表明，THP對AC16細胞的毒性可能與其促進ROS產(chǎn)生有關(guān)；雖然250 μmol/L DHM單用也能引起AC16細胞ROS水平升高，但其并不影響AC16細胞的活性和LDH釋放，說明DHM引起的ROS水平上調(diào)尚在AC16細胞的耐受范圍之內(nèi)，而且其與6 μmol/L THP聯(lián)合作用時能輕微地抑制LDH釋放和ROS生成，因此DHM在一定濃度范圍內(nèi)對心肌細胞不具有毒性作用，甚至可以減輕THP的心臟毒性。

本研究結(jié)果顯示，DHM和THP單用均能抑制HuH-6細胞增殖，但二者聯(lián)合作用后其抑制效果相對于單用THP并沒有加強。此外，DHM引起的HuH-6細胞凋亡主要為早期凋亡，而THP主要導致晚期凋亡。這提示DHM和THP對HuH-6細胞的抗增殖作用機制及促凋亡作用時相可能存在差異，因此有潛力作為抗HB聯(lián)合化療的藥物組合。

PI3K/Akt通路是腫瘤細胞生長中多種受體酪氨酸激酶的下游信號通路，對HB細胞的增殖和存活至關(guān)重要[14]。PI3K通過促進Akt磷酸化而發(fā)揮促腫瘤生長的作用[15]。PCNA在腫瘤細胞DNA復制過程中起關(guān)鍵作用，其翻譯后修飾由Akt調(diào)控[16]。本研究結(jié)果顯示，與Ctrl組相比，DHM組、THP組和DHM+THP組PCNA水平均降低，DHM組和DHM+THP組p-Akt/Akt水平降低，而DHM組無明顯變化；與DHM組和THP組相比，DHM+THP組PCNA水平降低，p-Akt/Akt水平升高。這表明DHM和THP均可抑制HuH-6細胞增殖，但它們作用的機制可能不完全一致；DHM主要通過阻斷Akt活化抑制HuH-6細胞增殖，而THP并非通過該途徑，而且由于THP較DHM表現(xiàn)出更好的抑制增殖作用，導致其與DHM聯(lián)合作用后效果沒有明顯增強。

Bcl-2和Bax通過控制線粒體膜的通透性來調(diào)節(jié)細胞的狀態(tài)，Bax二聚體可增加線粒體膜通透性，而Bcl-2通過與Bax形成異聚體降低線粒體膜通透性。當線粒體膜通透性增加時，線粒體內(nèi)促凋亡因子被釋放到胞質(zhì)中，通過裂解caspase-9使之激活，進而激活caspase-3以啟動caspase級聯(lián)反應，最終導致細胞凋亡。因此，Bcl-2/Bax比值降低代表促凋亡狀態(tài)。本研究結(jié)果顯示，與Ctrl組相比，DHM組、THP組和DHM+THP組Bcl-2/Bax降低，cleaved caspase-3/caspase-3、cleaved caspase-9/caspase-9升高；與DHM組和THP組相比，DHM+THP組Bcl-2/Bax降低，cleaved caspase-3/caspase-3、cleaved caspase-9/caspase-9升高。這表明DHM和THP在促進HuH-6細胞凋亡方面均通過線粒體途徑，而且DHM和THP聯(lián)合化療在促進caspase-9裂解方面表現(xiàn)出協(xié)同效應，但其下游caspase-3的裂解卻沒有疊加作用。該機制解釋了DHM和THP促進HuH-6細胞凋亡的時相存在一定差異的原因。

綜上所述，HM與THP聯(lián)合作用時抗HB腫瘤細胞效果增強且心肌細胞毒性不疊加；DHM可能通過阻斷Akt活化從而抑制PI3K/Akt信號通路，增強THP對HuH-6細胞的增殖抑制作用及凋亡促進作用。該結(jié)果表明DHM與THP聯(lián)合作用符合聯(lián)合化療的基本原則，體現(xiàn)為：單用DHM或THP均可抑制HuH-6細胞生長；DHM與THP作用機制不同，前者阻斷Akt活化而后者卻不能；DHM能協(xié)同THP抑制HuH-6細胞增殖并促進凋亡；DHM對AC16細胞沒有毒性作用，并可輕微地減輕THP的心臟毒性?？傮w而言，DHM與THP聯(lián)合作用有望成為HB化療的新組合，今后我們將從體內(nèi)水平進一步探討二者聯(lián)合化療的作用及機制。