賈慶玲，王煜姣，叢軍，凌江紅，蔡淦

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院脾胃病科，上海200021

慢性萎縮性胃炎(CAG)是消化系統(tǒng)常見病和疑難病之一?！癈AG→腸上皮化生→不典型增生→胃癌”被認(rèn)為是胃癌的經(jīng)典演化模式，CAG伴腸上皮化生和異型增生者的胃癌發(fā)病率高達(dá)6%，因此防治CAG對(duì)降低胃癌發(fā)病率具有重要意義。中醫(yī)藥以其多途徑、多靶點(diǎn)治療疾病且不良反應(yīng)少的優(yōu)勢，在CAG防治中受到廣泛關(guān)注。首屆全國名中醫(yī)蔡淦教授認(rèn)為，CAG伴癌前病變與瘀、熱、虛密切相關(guān)，瘀熱互結(jié)是癌前病變發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，因此CAG治療應(yīng)重視化瘀清熱，并依此創(chuàng)制莪連顆粒。該方重用莪術(shù)—黃連為君，莪術(shù)行氣破血、消積止痛，黃連瀉火解毒、清熱燥濕，兩藥合用以增化瘀清熱之功。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，莪術(shù)具有抗腫瘤、抗炎鎮(zhèn)痛、抗菌、抗病毒、調(diào)血脂等多種藥理學(xué)作用[1]，黃連具有抗菌消炎、抗消化性潰瘍、抗腫瘤、降血脂、降血糖等藥理作用[2]。2021年1月—2月，我們基于中藥多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，從整體上對(duì)莪術(shù)—黃連藥對(duì)以及疾病的靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測，分析藥物分子、靶點(diǎn)基因、通路以及疾病之間的關(guān)系，進(jìn)一步揭示莪術(shù)—黃連藥對(duì)治療CAG的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 莪術(shù)—黃連藥對(duì)活性成分的篩選和靶點(diǎn)基因的獲取 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫(https://tcmspw.com/index.php)分別檢索“莪術(shù)”“黃連”，以口服生物利用度(OB)≥30%和藥物相似度(DL)≥0.18作為篩選條件，篩選出莪術(shù)、黃連的活性成分及相應(yīng)靶點(diǎn)基因，輸入U(xiǎn)niPort數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)檢索相應(yīng)靶蛋白，得到標(biāo)準(zhǔn)化基因名。

1.2 CAG相關(guān)靶點(diǎn)基因的獲取 通過GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)檢索關(guān)鍵詞“Chronic Atrophic Gastritis”，獲取CAG相關(guān)靶點(diǎn)基因，在UniPort數(shù)據(jù)庫中轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)化基因名。

1.3 莪術(shù)—黃連藥對(duì)的有效成分靶點(diǎn)基因和CAG共同靶點(diǎn)基因的篩選 將莪術(shù)—黃連藥對(duì)有效成分靶點(diǎn)基因和CAG相關(guān)靶點(diǎn)基因同時(shí)錄入VENNY2.1 (https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)軟件，映射后構(gòu)建維恩圖以獲取交集基因。

1.4 藥對(duì)—有效成分—靶點(diǎn)基因—信號(hào)通路—疾病相互作用的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 String數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)選擇“Multiple Proteins”，將共同交集基因輸入，蛋白種屬選擇“Homo sapiens”，最低相互作用閾值選擇“medium confidence(0.400)”，其他參數(shù)均保持默認(rèn)設(shè)置，構(gòu)建蛋白—蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)。DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp)對(duì)交集基因進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路分析(物種選“Homo sapiens”，以P<0.05作為顯著功能和通路的臨界值)。通過Cytoscape3.7.2軟件，構(gòu)建莪術(shù)黃連藥對(duì)—活性成分—靶點(diǎn)基因網(wǎng)絡(luò)、藥對(duì)—有效成分—靶點(diǎn)基因—信號(hào)通路—疾病網(wǎng)絡(luò)，使用network analyzer功能進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)特征分析，根據(jù)度值預(yù)測治療節(jié)點(diǎn)，節(jié)點(diǎn)的大小與度值相關(guān)，節(jié)點(diǎn)越大說明該節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中越重要。

2 結(jié)果

2.1 莪術(shù)—黃連藥對(duì)的活性成分及靶點(diǎn)基因 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫，根據(jù)OB≥30%和DL≥0.18篩選得到18個(gè)活性成分，其中12個(gè)化學(xué)成分藥動(dòng)學(xué)特征良好，見表1。去除重復(fù)靶點(diǎn)基因和非人類靶點(diǎn)基因，得到180個(gè)靶點(diǎn)基因，獲得其相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)基因名以構(gòu)建藥對(duì)—活性成分—靶點(diǎn)基因網(wǎng)絡(luò)，見OSID碼圖1?；钚猿煞侄戎蹬琶叭某煞譃殚纹に?、(R)-Canadine、常春藤皂苷元，度值分別為143、28、22；靶點(diǎn)基因度值最高的基因?yàn)镻TGS1、PTGS2、NCOA2、SCN5A、RXRA、KCNH2、AR，度值分別為9、9、8、8、8、8、8。

表1 莪術(shù)—黃連藥對(duì)活性成分表

2.2 莪術(shù)—黃連藥對(duì)活性成分靶點(diǎn)基因和CAG共同靶點(diǎn)基因篩選結(jié)果 通過GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索獲得CAG靶點(diǎn)基因639個(gè)，利用UniPort數(shù)據(jù)庫將相關(guān)基因標(biāo)準(zhǔn)化。將莪術(shù)—黃連藥對(duì)活性成分靶點(diǎn)基因與CAG相關(guān)基因輸入VENNY2.1，得到交集基因78個(gè)，見表2。挑選78個(gè)交集基因中度值前25位的基因構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，共有25個(gè)節(jié)點(diǎn)、241個(gè)邊，見OSID碼圖2。Cytoscape分析顯示，度值排名前3位的基因?yàn)锳KT1、IL-6、PTGS2，度值均為23。

表2 莪術(shù)—黃連活性成分靶點(diǎn)基因與CAG靶點(diǎn)基因交集表(前25位)

2.3 藥對(duì)與疾病共同靶點(diǎn)基因的GO富集分析和KEGG通路分析結(jié)果 對(duì)78個(gè)靶點(diǎn)基因進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路分析。設(shè)定閾值P<0.05，選取靠前的富集結(jié)果。見表3、表4。

2.4 莪術(shù)黃連藥對(duì)—有效成分—靶點(diǎn)基因—信號(hào)通路—疾病相互作用的網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果 基于以上結(jié)果，莪術(shù)—黃連藥對(duì)可能通過12個(gè)活性成分、78個(gè)靶點(diǎn)基因發(fā)揮對(duì)CAG的治療作用，以此構(gòu)建莪術(shù)黃連藥對(duì)—有效成分—靶點(diǎn)基因—信號(hào)通路—疾病的相互作用網(wǎng)絡(luò)，見OSID碼圖3。

3 討論

CAG歸屬于中醫(yī)學(xué)“胃脘痛”“胃痞”范疇。莪連顆粒是首屆全國名中醫(yī)蔡淦教授的臨證驗(yàn)方，由莪術(shù)、黃連、蒲公英等12味中藥組成，具有活血化瘀、清熱解毒、健脾理氣之功效，主治CAG伴腸上皮化生、異型增生。該方在臨床應(yīng)用已30多年，具有逆轉(zhuǎn)CAG癌前病變的作用[3-4]。該方重用莪術(shù)—黃連為君，其中莪術(shù)味苦性辛溫，歸肝、脾經(jīng)，功專行氣破血、消積止痛?！夺t(yī)家心法》：“凡行氣破血、消積散結(jié)皆用之”。黃連味苦性寒，歸心、脾、胃、肝、膽、大腸經(jīng)，乃瀉火解毒，清熱燥濕，厚腸止瀉之佳品?！端庮惙ㄏ蟆罚骸盀a心火，除脾胃中濕熱，治煩躁惡心，郁熱在中焦，兀兀欲吐”。兩藥配伍應(yīng)用，活血化瘀、清熱燥濕之功顯著?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，莪術(shù)有改善微循環(huán)、抗炎、抗氧化、抗腫瘤功效；黃連有保護(hù)胃黏膜、抗炎、抑殺幽門螺桿菌(Hp)、抗腫瘤等作用[1，5]。

表3 莪術(shù)—黃連藥對(duì)治療CAG的GO富集分析結(jié)果

表4 莪術(shù)—黃連藥對(duì)治療CAG的KEGG通路分析結(jié)果

本研究通過OB和DL評(píng)估，篩選出莪術(shù)—黃連藥對(duì)的12個(gè)有效活性成分，180個(gè)靶點(diǎn)基因，其中槲皮素、(R)-Canadine、常春藤皂苷元是藥對(duì)的主要活性成分，所對(duì)應(yīng)的成分靶點(diǎn)相對(duì)較多，表明它們可能是莪術(shù)—黃連藥對(duì)治療作用的主要成分。靶點(diǎn)蛋白基因度值最高的基因?yàn)镻TGS1(9)、PTGS2(9)、NCOA2(8)、SCN5A(8)、RXRA(8)、KCNH2(8)、AR(8)，表明莪術(shù)—黃連藥對(duì)可能作用于這些關(guān)鍵靶點(diǎn)基因。該網(wǎng)絡(luò)體現(xiàn)了一個(gè)活性成分可對(duì)應(yīng)多個(gè)靶點(diǎn)蛋白，一個(gè)靶點(diǎn)蛋白可對(duì)應(yīng)多個(gè)活性成分，表明莪術(shù)—黃連藥對(duì)的治療作用是一個(gè)復(fù)雜的過程。

基于David數(shù)據(jù)庫對(duì)交集基因進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路分析，結(jié)果表明，GO-BP分類主要涉及凋亡過程的負(fù)調(diào)控等。已有研究表明，CAG發(fā)展為癌變的發(fā)病機(jī)制與細(xì)胞增殖與凋亡相關(guān)。其中，促凋亡基因Bax、Fas的表達(dá)逐漸增高，而細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)控基因p16的表達(dá)逐漸降低[6-9]。GO-MF分類主要涉及酶結(jié)合等。研究表明，隨著CAG進(jìn)展，胃蛋白酶和內(nèi)在因子的產(chǎn)生逐漸減少[10]。KEGG通路分析顯示，莪術(shù)—黃連藥對(duì)治療CAG主要涉及TNF信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路等。其中，TNF信號(hào)通路作為主要通路，涉及TNF、MMP-9、AKT1、IL-6、IL-1β、MAPK1等靶點(diǎn)基因。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，CAG大鼠血清IL-6、TGF-β1和MAPK含量均存在不同程度的增加[11-12]。TNF-α、MMP-9、IL-1β、p-AKT1則在CAG患者胃黏膜組織或CAG大鼠血清中高水平表達(dá)[13-16]。上述結(jié)果表明，TNF信號(hào)通路在CAG發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。此外，CAG患者及模型大鼠胃黏膜組織中TLR4和NF-κB表達(dá)增高[17-18]。

PPI網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，AKT1、IL-6等均為共同靶點(diǎn)，表明莪術(shù)—黃連藥對(duì)治療CAG可能主要涉及AKT1、IL-6等靶點(diǎn)基因。因此推測，莪術(shù)—黃連藥對(duì)可能通過調(diào)節(jié)AKT1、IL-6等靶點(diǎn)基因，TNF信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路從而發(fā)揮抗CAG作用。

本研究初步探討了莪術(shù)—黃連抗CAG的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)機(jī)制，且所得結(jié)果與現(xiàn)有研究報(bào)道基本相符，為系統(tǒng)地開展莪術(shù)—黃連抗CAG的實(shí)驗(yàn)研究和臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。但是，莪術(shù)—黃連藥對(duì)發(fā)揮抗CAG作用的深入研究仍待后續(xù)驗(yàn)證。