王 平，郝 蘊，趙 妍，王向東，張 羅

1 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科，北京 100730；2 北京市耳鼻咽喉科研究所，鼻病研究北京市重點實驗，北京 100005

慢性鼻竇炎(chronic rhinosinusitis，CRS)是復(fù)雜的鼻竇黏膜炎癥性疾病，其在中國的發(fā)病率約為8%，其中慢性鼻竇炎伴鼻息肉(CRS with nasal polyps，CRSwNP)癥狀嚴(yán)重、復(fù)發(fā)率高、合并哮喘概率高，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[1-2]。CRSwNP 發(fā)病機制包括鼻腔鼻竇上皮受損、黏膜屏障障礙，導(dǎo)致吸入病原體、抗原、微粒等增加，從而引起上皮下固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答增加[3]?，F(xiàn)有治療藥物主要有激素類藥物、抗生素類藥物、黏膜促排藥等[4]。近10年來，基于患者個體免疫治療方式的單克隆抗體治療逐漸出現(xiàn)，以Th2 相關(guān)免疫因子為靶點的治療逐漸應(yīng)用于臨床[5]。解析CRSwNP 中參與調(diào)控疾病進程的基因有助于尋找到該疾病的新精準(zhǔn)治療方法[6]。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，越來越多的研究將測序和生物信息學(xué)方法應(yīng)用于科學(xué)研究中，利用生物信息學(xué)手段對疾病模型或生物學(xué)過程進行分析，篩選出與疾病發(fā)生或生物學(xué)過程相關(guān)的關(guān)鍵基因和信號通路，為臨床對該疾病的早期診斷和治療藥物研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。本研究基于GEO 公共數(shù)據(jù)集，利用生物信息學(xué)方法，篩選出與CRSwNP 發(fā)生相關(guān)的關(guān)鍵基因和信號通路，以期為深入探索CRSwNP 的發(fā)病機制提供依據(jù)。

資料和方法

1 資料來源 本研究從基因表達數(shù)據(jù)集(Gene Expression Omnibus，GEO；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)按照關(guān)鍵詞“Chronic rhinosinusitis with nasal polyps (CRSwNP)”檢索，下載CRSwNP 相關(guān)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集GSE136825。該數(shù)據(jù)集中包含了來源于廣東省人民醫(yī)院、山東大學(xué)第二醫(yī)院、南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院等中心的42例CRSwNP 患者[年齡(43.6 ± 16.8)歲，男性比例66.7%]鼻息肉組織和28例健康對照者[年齡(34.2 ± 12.1)歲，男性比例71.4%]鼻黏膜組織的高通量測序數(shù)據(jù)[7]。

2 差異表達基因篩選 運用R 語言軟件R Studio(版本3.6.0)的Deseq2 包(1.24.0)對GEO 數(shù)據(jù)庫下載的數(shù)據(jù)集進行背景校準(zhǔn)、標(biāo)準(zhǔn)化處理和差異基因分析，根據(jù)校正后P＜ 0.05，差異倍數(shù)(fold change,FC) ≥ 3 或 ≤ 1/3 作為篩選參數(shù)，篩選出CRSwNP 的鼻息肉組織與正常組織的差異表達基因，并通過R 語言ggplot 包繪制差異表達基因的火山圖，pheatmap 包繪制熱圖。

3 差異基因的基因本體論(gene ontology，GO)富集分析以及通路富集分析 利用Metacore 數(shù)據(jù)庫(https://portal.genego.com)對篩選后的差異基因進行功能和通路上的富集分析。對GO 富集功能生物過程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)、細(xì)胞組分(cellular component，CC)進行注釋，選取前10個GO 條目及通路富集內(nèi)容。

4 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 使用Cytoscape 軟件(版本3.7.2)，插件MCODE，插件Enrichmentmap(版本3.2.1)，分析蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系，對BP、MF、CC 進行網(wǎng)絡(luò)可視化。

結(jié) 果

1 CRSwNP 中差異表達基因的篩選 對CRSwNP患者息肉組織和正常黏膜組織基因數(shù)據(jù)集進行預(yù)處理和篩選，根據(jù)校正后P＜ 0.05，差異倍數(shù)(FC) ≥ 3 或 ≤ 1/3 的標(biāo)準(zhǔn)，共篩選出777個差異表達基因(圖1)。與正常組織比較，鼻息肉組織中上調(diào)基因為527個，下調(diào)基因為250個。在表達上調(diào)和下調(diào)的差異基因中，根據(jù)差異倍數(shù)最顯著的前30個基因制作熱圖(圖2)。

圖1 CRSwNP 組織與健康對照黏膜之間的差異表達基因的火山圖：橙色標(biāo)記點表示基于倍數(shù)變化(FC) ≥ 3 且同時滿足P ＜0.05 的差異基因；藍(lán)色標(biāo)記點表示基于倍數(shù)變化(FC) ≤1/3 且同時滿足P ＜ 0.05 的下調(diào)差異基因；灰色標(biāo)記點表示無顯著差異的基因Fig.1 Differential expressed genes in nasal polyps and normal nasal mucosa:Orange dots indicate up-regulated genes based on fold change ≥ 3,with P ＜ 0.05;Blue dots indicate downregulated genes based on fold change ≤ 1/3,with P ＜ 0.05;Gray marked dots indicate genes without significant differences

圖2 CRSwNP 組織與健康對照黏膜之間的差異表達基因(Top 30)熱圖：橙色表示CRSwNP 中上調(diào)的差異基因，藍(lán)色表示CRSwNP 中下調(diào)的差異基因Fig.2 Heatmap of the top 30 differential expressed genes in nasal polyps and normal nasal mucosa:Orange indicates up-regulated genes and blue indicates down-regulated genes

2 差異表達基因的功能富集分析 對篩選出的差異基因根據(jù)上調(diào)組和下調(diào)組分別通過在線功能和通路分析軟件 Metacore 進行分析，選取前10 以內(nèi)的功能富集通路進行作圖。在上調(diào)基因的生物過程(BP)中前5 位分別是炎癥反應(yīng)、防御反應(yīng)、免疫系統(tǒng)反應(yīng)、免疫反應(yīng)、粒細(xì)胞趨化(圖3A)；在下調(diào)基因的生物過程中前5 位分別是肌肉收縮、平滑肌收縮、肌肉系統(tǒng)過程、循環(huán)系統(tǒng)過程、血液循環(huán)(圖3B)。在上調(diào)基因的分子功能(MF)方面前5 位內(nèi)容分別是免疫受體活性、蛋白質(zhì)結(jié)合、結(jié)合、C5L2 過敏毒素趨化受體結(jié)合、金屬肽酶活性(圖4A)；在下調(diào)基因的分子功能方面前5 位分別是血紅蛋白結(jié)合、多肽N-乙酰氨基半乳糖基轉(zhuǎn)移酶活性、結(jié)合、乙酰氨基半乳糖基轉(zhuǎn)移酶活性、葉酸結(jié)合(圖4B)。在上調(diào)基因的細(xì)胞組分(CC)方面前5 位分別是細(xì)胞外圍、質(zhì)膜、胞外區(qū)、細(xì)胞表面、質(zhì)膜固有成分(圖5A)；在下調(diào)基因的細(xì)胞組分方面前5 位分別是胞外區(qū)、囊泡、細(xì)胞外間隙、胞外體、細(xì)胞外小泡(圖5B)。

圖3 CRSwNP 組織與健康對照黏膜之間的上調(diào)(A)和下調(diào)(B)差異基因參與的生物過程Fig.3 Biological processes of up-regulated (A) and down-regulated (B) differentially expressed genes

圖4 CRSwNP 組織與健康對照黏膜之間的上調(diào)(A)和下調(diào)(B)差異基因的分子功能Fig.4 Molecular functions of up-regulated (A) and down-regulated (B) genes differentially expressed in nasal polyps and normal nasal mucosa

圖5 CRSwNP 組織與健康對照黏膜之間的上調(diào)(A)和下調(diào)(B)差異基因的細(xì)胞組分Fig.5 Cellular components of up-regulated (A) and down-regulated (B) differentially expressed genes in nasal polyps and normal nasal mucosa

3 差異表達基因的GO 富集分析和KEGG 信號通路富集分析 在上調(diào)差異基因中使用Metacore database 對其功能進行富集分析，前5 種信號通路分別為經(jīng)典補體激活途徑免疫反應(yīng)、凝集素誘導(dǎo)補體途徑免疫反應(yīng)、嗜堿性粒細(xì)胞在哮喘中的遷移、重性抑郁癥經(jīng)典補體系統(tǒng)激活的可能途徑、補體替代途徑的免疫應(yīng)答(圖6A)。在下調(diào)差異基因的分析結(jié)果中，前5 種信號通路分別為哮喘氣道平滑肌細(xì)胞肥大、淚腺中ACM3 信號的傳遞、肺癌中的G 蛋白偶聯(lián)受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、神經(jīng)內(nèi)分泌肽的蛋白質(zhì)折疊和成熟及其翻譯后加工、成體干細(xì)胞向少突膠質(zhì)細(xì)胞分化(圖6B)。

圖6 CRSwNP 組織與健康對照黏膜之間的上調(diào)(A)和下調(diào)(B)差異基因的Metacore 通路分析Fig.6 Metacore pathways of up-regulated (A) and down-regulated (B) differentially expressed genes in nasal polyps and normal nasal mucosa

4 蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析 選取校正后P＜ 0.05，差異倍數(shù)(FC) ≥ 5 或 ≤ 1/5 的166個差異表達基因，利用String 數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org)，在保留相互作用預(yù)測得分＞0.4 的作用對后共得到了236 對連接對，使用Cytoscape 軟件對差異表達基因編碼蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)進行可視化展示(圖7A)。通過插件MCODE 對蛋白互作網(wǎng)絡(luò)進行分析，得出核心基因，SCG2、IGFBP3、CA4、C3、SPP1、CP 在鼻息肉組織中表達上調(diào)，CHRDL1、BPIFB2 在鼻息肉組織中表達下調(diào)(圖7B)。

圖7 CRSwNP 相關(guān)的蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)(A)以及核心基因(B)：橙色表示上調(diào)差異基因，藍(lán)色表示下調(diào)差異基因Fig.7 Protein-protein interaction networks in CRSwNP (A) and hub genes from the networks (B) :Orange indicates up-regulated genes and blue indicates down-regulated genes

討 論

本研究通過對CRSwNP 鼻息肉組織和正常黏膜組織的轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)分析研究，共篩選得到777個差異表達基因，其中上調(diào)基因527個，下調(diào)基因250個。對差異基因進行功能和通路富集分析，顯示炎癥反應(yīng)、免疫受體活性、粒細(xì)胞趨化、金屬肽酶活性等生物學(xué)功能在鼻息肉組織與正常黏膜組織之間存在顯著相關(guān)性。進一步得到與CRSwNP 相關(guān)的核心基因SCG2、IGFBP3、CA4、C3、SPP1、CP、CHRDL1、BPIFB2。以上核心基因中SCG2、IGFBP3、CA4、C3、SPP1、CP 在鼻息肉組織中表達上調(diào)，CHRDL1、BPIFB2 在鼻息肉組織中表達下調(diào)。

SCG2 編碼的蛋白質(zhì)是神經(jīng)內(nèi)分泌蛋白的嗜鉻粒蛋白/分泌粒蛋白家族的成員，在其產(chǎn)生的組織中被迅速切割成生物活性肽；而這些被切割的產(chǎn)物已被證實通過刺激VEGF 信號、MAPK 通路、PI3K/Akt 通路抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、促進增殖、遷移和血管生成[8-9]；目前有關(guān)SCG2 基因的機制研究較少，有待進一步探索。IGFBP3 是胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白家族的成員，編碼具有IGFBP 結(jié)構(gòu)域和Ⅰ型甲狀腺球蛋白結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)；研究發(fā)現(xiàn)其在子宮內(nèi)膜的重塑過程發(fā)揮作用，但在炎癥性疾病中暫缺研究[10]。CA4 是碳酸酐酶的一種，碳酸酐酶是一大類鋅金屬酶，可催化二氧化碳的可逆水合；其參與各種生物過程，包括呼吸、鈣化、酸堿平衡、骨吸收以及房水、腦脊液、唾液和胃酸的形成；在小鼠哮喘模型的嗜酸性粒細(xì)胞中，CA4 的表達受IL-5 動力學(xué)調(diào)節(jié)[11]。補體C3 在補體系統(tǒng)的經(jīng)典和替代激活途徑中均起到核心作用；補體激活在維持宿主體內(nèi)穩(wěn)態(tài)方面很重要，但過度和不受控制的激活可能導(dǎo)致炎癥和疾病，血清中C3 的升高可能在CRS 的發(fā)展中起調(diào)節(jié)作用[12-13]。SPP1 又稱為骨橋蛋白，其編碼的蛋白質(zhì)參與破骨細(xì)胞附著于礦化的骨基質(zhì)的過程，還參與炎癥和免疫介導(dǎo)的疾病的發(fā)病機制，并調(diào)節(jié)宿主對感染的反應(yīng)[14]；研究發(fā)現(xiàn)慢性鼻竇炎患者的鼻竇黏膜組織中SPP1 表達上調(diào)，上調(diào)過程被IFN-γ、IL-1β 和TNF-α 誘導(dǎo)，被IL-4 和IL-13 抑制，提示SPP1 可能在慢性鼻竇炎的發(fā)病機制中起重要作用[15]；另外，過敏性鼻炎患者血漿中SPP1 表達上調(diào)，與瘦素協(xié)同調(diào)節(jié)嗜酸性粒細(xì)胞的凋亡、黏附、遷移和激活[16]；SPP1 促進樹突狀細(xì)胞分泌IL-12[17]，同時在克氏錐蟲感染過程中驅(qū)動IFN-γ、IL-17A 和IL-10 分泌[18]；SPP1 還可通過ERK 和P38/MAPK 激活增強中性粒細(xì)胞浸潤，從而引起敗血癥誘發(fā)的急性肺損傷[19]；在慢性鼻竇炎的表型水平SPP1 的表達已得到驗證，但其在疾病的發(fā)病過程中發(fā)揮的關(guān)鍵性作用仍有待進一步深入研究。CP 是一種金屬蛋白，與血漿中的大部分銅結(jié)合，并參與Fe(Ⅱ)轉(zhuǎn)鐵蛋白向Fe(Ⅲ)轉(zhuǎn)鐵蛋白的過氧化反應(yīng)；已有研究證明鼻息肉患者CP 水平高于正常對照[20]。CHRDL1 基因編碼骨形態(tài)發(fā)生蛋白4 的拮抗劑，可以抑制羊水來源的間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞的增殖和遷移[21]。BPIFB2 編碼脂質(zhì)轉(zhuǎn)移/脂多糖結(jié)合蛋白基因家族的成員；在CRSwNP 中高通量測序及實時定量PCR 同樣發(fā)現(xiàn)BPIFB2 表達顯著下調(diào)，機制仍有待進一步探尋[22]。

綜上所述，本研究基于生物信息學(xué)方法，對CRSwNP 患者鼻息肉組織與健康對照鼻黏膜的差異基因進行功能和通路富集分析，并對其潛在核心基因進行初步探索。若將本研究結(jié)論應(yīng)用于臨床CRSwNP 的診療中，后續(xù)仍需要進一步的實驗驗證。盡管如此，本研究依然有助于增強對CRSwNP 相關(guān)致病分子機制的了解，同時為該疾病的臨床診斷與治療提供了一定的研究基礎(chǔ)。