黃曉欣，毛怡寧，李虹，王宇航，劉勇

北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 100102

酸棗仁為鼠李科植物酸棗Ziziphus jujubaMill.var.spinosa（Bunge）Hu ex H.F.Chou的干燥成熟種子，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，味酸，性平，主治心腹寒熱、邪結(jié)氣聚、四肢酸疼濕痹，久服安五臟[1]。酸棗仁廣布全球，在中國(guó)主要分布于北方大部分地區(qū)，如河北、陜西、遼寧、河南等省。失眠又稱睡眠障礙性疾病，主要表現(xiàn)為難以入睡，持續(xù)睡眠困難等癥狀，并產(chǎn)生一些不適的感覺，如疲憊、頭痛及注意力不佳等，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。酸棗仁為中醫(yī)治療失眠的常用藥物，其需求量也隨之不斷增加。然而，酸棗仁廣泛分布于北方低山丘陵地區(qū)，目前多為野生，少數(shù)栽培的酸棗管理較為粗放。不同產(chǎn)地間生態(tài)環(huán)境與栽培管理等因素使得藥材中的各類成分差異較大，導(dǎo)致不同地區(qū)酸棗仁品質(zhì)存在顯著的差異。

目前，已從酸棗仁中分離鑒定了190 余個(gè)化學(xué)成分，包括皂苷類、黃酮類、三萜類、生物堿類、脂肪油類、甾體類、酚酸類化合物、多種氨基酸和微量元素等。酸棗仁中的皂苷類、黃酮類和生物堿類成分較受關(guān)注，其中現(xiàn)代藥理研究主要集中在皂苷類成分，其鎮(zhèn)靜催眠作用已被廣泛認(rèn)可。酸棗仁總皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為0.091 6%，主要包括四環(huán)三萜和五環(huán)三萜2 種[2]，如從酸棗仁甲醇提取部位中得到的酸棗仁皂苷A（jujuboside A）和酸棗仁皂苷B（jujuboside B）。酸棗仁總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.95%，主要為芹菜素型黃酮碳苷類化合物[3]。Woo 等[4]首次從酸棗仁甲醇提取部位分離得到斯皮諾素（spinosin）黃酮碳苷及其酰基化衍生物，并確定其結(jié)構(gòu)，此后從酸棗仁甲醇提取物中分離出葛根素（puerarin）、異斯皮諾素（isospinosin）、異牡荊素（isovitexin）、酸棗黃素（zivulgari）等黃酮類化合物。酸棗仁中生物堿類成分含量相對(duì)較高。目前已從酸棗仁中分離鑒定出26 個(gè)生物堿，主要分為吡咯類、吲哚類、異喹啉類和環(huán)肽類。最先從酸棗仁中分離得到的生物堿為lysicamine 和juzirine，后來發(fā)現(xiàn)還有環(huán)肽類生物堿、酸棗仁堿A、酸棗仁堿B、酸棗仁堿D、酸棗仁堿F、酸棗仁堿G1、酸棗仁堿G2和阿樸菲類生物堿酸棗仁堿E、酸棗仁堿Ⅰa、酸棗仁堿Ⅰb、酸棗仁堿K等。

酸棗仁的質(zhì)量控制手段主要有多指標(biāo)成分含量測(cè)定及指紋圖譜整體控制2 種?！吨腥A人民共和國(guó)藥典》2020 年版將斯皮諾素、酸棗仁皂苷A 作為酸棗仁檢測(cè)的指標(biāo)成分。隨著分析手段和儀器的不斷發(fā)展，關(guān)于酸棗仁質(zhì)量控制研究的熱點(diǎn)逐漸由多指標(biāo)成分含量測(cè)定向指紋圖譜整體評(píng)控方向轉(zhuǎn)移。溫度、光照、濕度等氣候因素會(huì)導(dǎo)致不同產(chǎn)地酸棗仁次生代謝產(chǎn)物的積累不同，進(jìn)而導(dǎo)致藥材質(zhì)量差別。因此，研究酸棗仁不同產(chǎn)地的質(zhì)量差別對(duì)于保證藥材質(zhì)量和建立酸棗仁良好農(nóng)業(yè)規(guī)范（GAP）基地是十分必要的。

目前，產(chǎn)地因素對(duì)酸棗仁內(nèi)在化學(xué)成分影響的研究多為利用高效液相色譜法、紫外分光光度法等對(duì)斯皮諾素，酸棗仁皂苷A、B 等幾個(gè)指標(biāo)成分進(jìn)行定性、定量分析。而中藥為復(fù)雜的化學(xué)體系，僅靠幾個(gè)指標(biāo)性成分不能全面體現(xiàn)其品質(zhì)差異。另外，色譜分析法依賴對(duì)照品，對(duì)中藥材中含量較低的化學(xué)成分難以檢測(cè)，定量分析的化合物也比較有限，難以反映其化學(xué)成分的代謝譜。近年來，隨著超高效液相色譜-線性離子阱/靜電場(chǎng)軌道阱組合式高分辨質(zhì)譜法（UHPLC-LTQ-Orbitrap MS）代謝組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，為中藥的區(qū)分或差異性評(píng)價(jià)及中藥質(zhì)量評(píng)控提供了一種可靠的方法[5]。

本實(shí)驗(yàn)基于植物代謝組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，利用UHPLC-LTQ-Orbitrap MS 結(jié)合主成分分析（PCA）及正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA）對(duì)不同產(chǎn)地酸棗仁的差異性進(jìn)行鑒別分析，為不同地理位置酸棗仁中化學(xué)成分差異性及品質(zhì)多樣性的研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Thermo Scientific LTQ-Oribitrap XL 型線性離子阱-串聯(lián)靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜儀，配有熱噴霧離子源（HESI）、Xcalibur 2.1化學(xué)工作站；Thermo Scientific Dionex Utimate 3000 UHPLC Plus Focused型超高效液相色譜系統(tǒng)，含二元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列（DAD）檢測(cè)器；Chromeleon 7 工作站；Millipore Synergy UV 型超純水機(jī)（美國(guó)Millipore公司）；R200D型電子分析天平（十萬分之一，德國(guó)Sartorius公司）。

1.2 試藥

對(duì)照品蘆?。ㄅ?hào)：Y06J8S37439）、山柰酚（批號(hào)：R03F6C1）、葛根素（批號(hào)：YM051DYA14）、斯皮諾素（批號(hào)：P01N8F47228）、酸棗仁皂苷A（批號(hào)：P08A8F33617）均購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司；對(duì)照品酸棗仁皂苷B（批號(hào)：110814-200607）購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院，所有對(duì)照品純度均≥98%；水為超純水；甲醇、乙腈為色譜純（美國(guó)Fishier Scientific 公司）；其余試劑均為分析純。

樣品采自遼寧、河北、山西、陜西、河南5 個(gè)產(chǎn)區(qū)的10 個(gè)不同產(chǎn)地，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)劉勇教授鑒定為鼠李科植物酸棗Ziziphus jujubaMill.var.spinosa（Bunge）Hu ex H.F.Chou 的干燥成熟種子。樣品詳細(xì)采集信息見表1。

表1 酸棗仁樣品來源

2 方法

2.1 供試品溶液制備

取各產(chǎn)地酸棗仁粉末（過四號(hào)篩）約l g，精密稱定，置索氏提取器中，加石油醚（60～90 ℃）適量，加熱回流4 h，棄去石油醚液，藥渣揮去溶劑，轉(zhuǎn)移至錐形瓶中，加70%乙醇20 mL，超聲2 h，濾過，濾渣用70%乙醇5 mL 洗滌，合并洗液與濾液，回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状既芙?，轉(zhuǎn)移至5 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.22 μm）濾過，即得。

2.2 質(zhì)量控制（QC）樣品制備

分別精確吸取按2.1 項(xiàng)下制備的10 個(gè)產(chǎn)地共34 份樣品，等容混勻，經(jīng)微孔濾膜（0.22 μm）濾過，置于液相色譜小瓶中，即得QC 樣品。在樣品分析前連續(xù)進(jìn)樣5次同一QC 樣品，在運(yùn)行樣品序列中每間隔10個(gè)樣品運(yùn)行1次QC樣品。

2.3 色譜與質(zhì)譜條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH-Cl8（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相為乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～5 min，5.0%～20.0 %A；5～10 min，20.0%～22.5%A；10～12 min，22.5%～48.0%A；12～15 min，48.0%～58.0%A；15～35 min，58.0%～90.0%A；35.0～35.1 min，90.0%～5.0%A）；流速為0.3 mL·min-1；柱溫為30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm；進(jìn)樣量為4 μL。

質(zhì)譜參數(shù)：加熱電噴霧離子源（HESI），正、負(fù)離子檢出模式，掃描范圍：m/z50～1800；離子源溫度：350 ℃；電離源電壓：4 kV；毛細(xì)管電壓：35 V；管透鏡電壓：110 V；鞘氣和輔助氣均為高純氮?dú)猓兌龋?9.99%）；鞘氣流速：40 arb，輔助氣流流速：20 arb；數(shù)據(jù)采集采用傅里葉變換高分辨全掃方式（TF，F(xiàn)ull scan，Resolution 30 000）、數(shù)據(jù)依賴性DDA-MS 2、母離子列表PIL-MS2 等多種采集策略，碰撞誘導(dǎo)裂解（CID）條件。

2.4 代謝物定性及數(shù)據(jù)分析

基于代謝物信息公共數(shù)據(jù)庫及對(duì)照品對(duì)比，對(duì)質(zhì)譜檢測(cè)的一級(jí)精確相對(duì)分子質(zhì)量及二級(jí)碎片離子信息進(jìn)行色譜峰歸屬的定性分析。使用SIEVE 2.1軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行峰檢測(cè)、篩選、對(duì)齊、濾噪等預(yù)處理，得到二維峰原始數(shù)據(jù)矩陣，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化預(yù)處理。使用SIMCA 14.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，隨后進(jìn)行PCA 無監(jiān)督模式識(shí)別、OPLSDA有監(jiān)督模式分析，并通過排列置換檢驗(yàn)的方法來檢驗(yàn)?zāi)Ｐ褪欠襁^擬合。根據(jù)變量重要性投影（variable importance in projection，VIP）對(duì)組間分離貢獻(xiàn)大的化合物進(jìn)行初步篩選（VIP 值＞1），并結(jié)合獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)（P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）篩選潛在的差異標(biāo)記化合物。

3 結(jié)果

3.1 酸棗仁成分鑒別

酸棗仁代謝產(chǎn)物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)和結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果見表2，結(jié)合本課題組前期實(shí)驗(yàn)[6]，通過高分辨質(zhì)譜及二級(jí)質(zhì)譜的碎片離子推測(cè)化合物的結(jié)構(gòu)式，再根據(jù)部分對(duì)照品信息、相關(guān)文獻(xiàn)及色譜峰進(jìn)行推斷鑒定，共表征49 個(gè)化合物，包括27 個(gè)黃酮類、14 個(gè)皂苷類、6 個(gè)三萜類、2 個(gè)生物堿類，其中christinin D、jujubasaponin Ⅰ、jujubasaponin Ⅵ、ziziberanalic acid 為首次從酸棗仁中檢測(cè)到。并采用Mass Frontier 和Metwork 工具對(duì)可能存在的新化合物進(jìn)行了預(yù)測(cè)，共推測(cè)出9 個(gè)新成分。

表2 酸棗仁代謝產(chǎn)物的UHPLC-LTQ-Orbitrap MS分析結(jié)果

續(xù)表2

續(xù)表2

表2 中化合物christinin D、jujubasaponin Ⅰ、jujubasaponin Ⅵ，zizyberanalic acid 為首次從酸棗仁中檢測(cè)到。酸棗仁中皂苷類成分的質(zhì)譜行為主要為依次脫去糖基，根據(jù)裂解規(guī)律結(jié)合文獻(xiàn)進(jìn)行推測(cè)結(jié)構(gòu)。以化合物48 為例，質(zhì)譜給出準(zhǔn)分子離子峰m/z1 044.550 0 [M-H]-，可推斷其分子式C52H85O21，以m/z1 044.550 0 作為母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析。所得二級(jí)質(zhì)譜圖中有明顯的碎片離子m/z911 [MH-Xyl]-為母離子丟失1分子木糖產(chǎn)生，之后連續(xù)丟失1分子葡萄糖、1分子鼠李糖及1分子阿拉伯糖產(chǎn)生的碎片離子m/z749，603，453。m/z893[M-H-H2OXyl]-，747 [M-H-H2O-Xyl-Rha]-為母離子丟失1 分子水，繼而脫去1分子木糖及1分子鼠李糖形成的碎片離子。結(jié)合文獻(xiàn)推測(cè)此化合物為christinin D。

化合物51 為jujubasaponin Ⅰ。質(zhì)譜給出準(zhǔn)分子離子峰m/z941.510 4 [M-H]-，可推斷其分子式C47H76O16，以m/z941.510 4 作為母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析。所得二級(jí)質(zhì)譜圖中有明顯的碎片離子m/z895[M-H-2CH3-H2O]-，為母離子脫去1 分子水和2 分子甲基，繼而丟失1 分子鼠李糖、1 分子葡萄糖、1 分子阿拉伯糖形成碎片離子453。結(jié)合文獻(xiàn)推測(cè)此化合物51 為jujubasaponin Ⅰ。相同裂解方式結(jié)合文獻(xiàn)可推測(cè)化合物52為棗樹皂苷Ⅵ。

化合物56為zizyberanalic acid，質(zhì)譜給出準(zhǔn)分子離子峰m/z469.331 2 [M-H]-，可推斷其分子式C30H46O4，以m/z469.331 2作為母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析。所得二級(jí)質(zhì)譜圖中有明顯的碎片離子m/z451[M-H-H2O]-，423[M-H-CO-H2O]-，401[MH-2CH3-H2O]-，結(jié)合文獻(xiàn)推測(cè)該化合物為zizyberanalic acid。

表2 中化合物6、7、9、10、15、16、29、30、34 為推測(cè)出的新成分。化合物6、7、9 質(zhì)譜給出準(zhǔn)分子離子峰分別為m/z919.250 3[M-H]-，889.239 7[M-H]-，975.276 5[M-H]-，可推斷其分子式分別 為C42H48O23、C41H46O22、C45H52O24。分 別以m/z919.250 3，889.239 7，975.276 5 作為母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析?；衔? 所得二級(jí)質(zhì)譜圖中有明顯的碎片離子m/z757 [M-H-Glc]-，之后再裂解成607[M-H-60-90]-，595[M-H-Glc]-，427[MH-90-120-120]-?；衔?、9 所得二級(jí)質(zhì)譜圖中有明顯的碎片離子m/z607，427，294 碎片離子，具有與斯皮諾素（spinosin）相似的質(zhì)譜行為和紫外光譜吸收，有規(guī)律地產(chǎn)生脫去m/z60，90，120 質(zhì)量單位的碎片峰。結(jié)合斯皮諾素的裂解規(guī)律（圖1），推測(cè)化合物6、7、9 分別為6?-（4"′′-O-β-D-吡喃葡萄糖基）-香草酰斯皮諾素、6?-（4"′′-O-β-D-吡喃葡萄糖基）-對(duì)羥基苯甲酰斯皮諾素、6"′-（4"′′-O-β-D-吡喃葡萄糖基）-芥子酰斯皮諾素。

圖1 斯皮諾素可能的裂解途徑

化合物10 質(zhì)譜給出準(zhǔn)分子離子峰m/z725.192 4[M-H]-，可推斷其分子式C32H38O19，以m/z725.192 4 作為母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析。所得二級(jí)質(zhì)譜圖中有明顯的碎片離子m/z593[M-H-Xyl]-，575[M-H-Xyl-H2O]-為母離子脫去1分子木糖產(chǎn)生的碎片離子，繼而丟失1分子葡萄糖和1分子鼠李糖形成碎片離子431[M-H-Xyl-Glc]-，285[MH-Xyl-Glc-Rha]-。結(jié)合斯皮諾素的裂解規(guī)律，推測(cè)此化合物為山柰酚-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-（1→6）-β-D-O-吡喃鼠李糖基-O-β-吡喃木糖苷。

化合物15 質(zhì)譜給出準(zhǔn)分子離子峰m/z903.255 4[M-H]-，可推斷其分子式C41H46O21，以m/z903.255 4 作為母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析。所得二級(jí)質(zhì)譜圖中有明顯的碎片離子m/z857[M-H-H2OCO]-，757 [M-H-Rha]-，741 [M-H-Glc]-；417 [M-H-Glc-CO-120]-為m/z741 丟失1 分子CO 和1 分子葡萄糖形成的碎片離子。結(jié)合斯皮諾素的裂解規(guī)律，推測(cè)此化合物為6?-（4"′′-O-β-D-吡喃鼠李糖基）-香草酰斯皮諾素。

化合物16質(zhì)譜給出準(zhǔn)分子離子峰m/z649.1763 1[M-H]-，可推斷其分子式C30H34O16，以m/z649.176 3作為母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析。所得二級(jí)質(zhì)譜圖中有明顯的碎片離子m/z607[M-H-AC]-，445 [MH-Glc]-，427[M-H-Glc-H2O]-，367[M-HGlc-H2O-60]-，325 [M-H-120-Glc]-，307[M-H-Glc-H2O-120]-。結(jié)合斯皮諾素的裂解規(guī)律，推測(cè)此化合物為6?-乙酰斯皮諾素。

化合物29 質(zhì)譜給出準(zhǔn)分子離子峰m/z711.192 0[M-H]-，可推斷其分子式C35H36O16，以m/z711.192 0 作為母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析。所得二級(jí)質(zhì)譜圖中有明顯的碎片離子m/z589[M-H-CH2-H2O-90]-，557[M-H-CH2-H2O]-，445[M-HH2O]-，427[M-H-2H2O]-，307[M-H-2H2O-120]-。結(jié)合斯皮諾素的裂解規(guī)律，推測(cè)此化合物為6?-苯甲酰斯皮諾素。

化合物30 質(zhì)譜給出準(zhǔn)分子離子峰m/z691.223 3[M-H]-，可推斷其分子式C33H40O16，以m/z691.223 3 作為母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析。所得二級(jí)質(zhì)譜圖中有明顯的碎片離子m/z607[M-H-2AC]-，589[M-H-H2O]-，571[M-H-H2O]-。結(jié)合斯皮諾素的裂解規(guī)律，推測(cè)此化合物為6?-O-（2"′′-甲基丁酰基）阿魏酰斯皮諾素。

化合物34 質(zhì)譜給出準(zhǔn)分子離子峰m/z961.276 1[M-H]-，可推斷其分子式C48H50O21，以m/z961.276 1 作為母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析。所得二級(jí)質(zhì)譜圖中有明顯的碎片離子m/z943[M-H-H2O]-，931 [M-H-2CH3]-，m/z932 丟失1 分子葡萄糖和2 分子水后形成碎片離子407 [M-H-Glc-2H2O-90-120-120]-，307[M-H-Glc-AC-60-120-120-120]-，有規(guī)律地產(chǎn)生脫去60，90，120質(zhì)量單位的碎片峰。結(jié)合斯皮諾素的裂解規(guī)律，推測(cè)此化合物為6"-對(duì)香豆?；?6?-芥子酰斯皮諾素。

3.2 PCA與OPLS-DA結(jié)果

3.2.1 系統(tǒng)方法評(píng)價(jià) 整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，所有QC樣品中化合物的保留時(shí)間RSD值均小于1%，峰強(qiáng)X射線衍射（XRD）值＜30%，說明儀器精密度、重復(fù)性符合要求；在無監(jiān)督的PCA中，在樣品序列運(yùn)行中插入的QC樣品緊密聚集在一起（圖2），說明儀器穩(wěn)定性良好，數(shù)據(jù)質(zhì)量良好，可對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步分析。

圖2 不同產(chǎn)地酸棗仁醇提物PCA得分

3.2.2 PCA PCA 是指在海量的原始數(shù)據(jù)中篩選出少數(shù)幾個(gè)具有代表性的主成分，根據(jù)主成分作圖以直觀地描述樣品整體的分類趨勢(shì)及不同組別之間的聚類情況[29-30]。從圖2 可以看出，5 個(gè)產(chǎn)地的酸棗仁樣品均分別聚集為一類，分類趨勢(shì)較為明顯。

3.2.3 OPLS-DA OPLS-DA 被廣泛用于代謝組數(shù)據(jù)的分析，由于其分析方法可以最大化組間差異常被用于差異代謝物的篩選[31]。為了更好地觀察不同產(chǎn)地樣品間的組內(nèi)差異，在PCA 分組的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步進(jìn)行有監(jiān)督的OPLS-DA，獲得相應(yīng)模型，OPLS-DA 得分見圖3。由圖3 可知，10 批酸棗仁樣品大致聚集分為4 組[遼寧、華北（河北、山西）、陜西、河南]，表明4 組藥材中的化學(xué)成分存在差異。從模型驗(yàn)證的參數(shù)圖可知，模型的穩(wěn)定性和交叉驗(yàn)證的預(yù)測(cè)力都較高（Q2=0.956，R2Y=0.989，R2X=0.85），說明所建立的OPLS-DA 模型可以很好地用于下一步的分析，即不同產(chǎn)地酸棗仁的差異代謝物分析。

圖3 不同產(chǎn)地酸棗仁醇提取物OPLS-DA結(jié)果

3.3 差異代謝物的篩選

為鑒定不同產(chǎn)地酸棗仁中化學(xué)代謝物的差異情況，采用OPLS-DA 對(duì)陜西、河南、遼寧、華北4 組酸棗仁樣品分別兩兩組合進(jìn)行OPLS-DA，并根據(jù)VIP 值結(jié)合t檢驗(yàn)篩選差異標(biāo)志物，以VIP＞1，P＜0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn)（圖4）。

圖4 不同產(chǎn)地酸棗仁醇提取物差異代謝物比較的OPLS-DA結(jié)果

根據(jù)VIP 值及t檢驗(yàn)結(jié)果結(jié)合前面所鑒定的58 個(gè)化學(xué)成分，篩選鑒定產(chǎn)地間差異標(biāo)記化合物，結(jié)果表明34 個(gè)化學(xué)成分在陜西和河南樣品間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；26 個(gè)化學(xué)成分在陜西和華北樣品間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；15 個(gè)化學(xué)成分在陜西和遼寧樣品間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；33個(gè)化學(xué)成分在遼寧和華北樣品間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；39個(gè)化學(xué)成分在河南和華北樣品間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；33個(gè)化學(xué)成分在河南和遼寧樣品間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表3。結(jié)果表明，外在環(huán)境因素對(duì)不同產(chǎn)地酸棗仁的差異代謝物存在一定的影響，因此統(tǒng)計(jì)了不同產(chǎn)地的氣候信息，見表4。

表3 各產(chǎn)地酸棗仁的差異代謝物

表4 酸棗仁各產(chǎn)地氣候信息

4 討論

酸棗仁作為一種常用中藥，其藥材的質(zhì)量直接影響到湯劑的質(zhì)量與療效，而不同產(chǎn)地的藥材質(zhì)量差異往往較大，因此評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地酸棗仁藥材的質(zhì)量，優(yōu)選產(chǎn)地也是保證酸棗仁相關(guān)湯劑質(zhì)量的重要手段之一。本研究采用基于UHPLC-ESI-MS/MS 的代謝組學(xué)方法對(duì)不同產(chǎn)地酸棗仁的化合物進(jìn)行分析，結(jié)合文獻(xiàn)共鑒別出58 個(gè)化合物，其中檢測(cè)到9 個(gè)新成分；再利用PCA、OPLS-DA 篩選出不同產(chǎn)地酸棗仁中的差異標(biāo)記代謝物，結(jié)果顯示不同產(chǎn)地的酸棗仁中化學(xué)成分是有差異的。

本實(shí)驗(yàn)中相對(duì)于各產(chǎn)地間差異代謝物含量都有顯著性差異的有黃酮類及三萜酸類2 種，包括山柰酚-3-O-蕓香糖苷、6"′-對(duì)羥基苯甲酰斯皮諾素及美洲茶酸3 個(gè)化合物，可作為潛在的質(zhì)量標(biāo)志物區(qū)分以上不同產(chǎn)地酸棗仁，但中藥作為一種復(fù)雜的化學(xué)體系，僅靠幾個(gè)指標(biāo)性成分也不足以全面體現(xiàn)其品質(zhì)差異，因此最好是能結(jié)合其他指標(biāo)性成分進(jìn)行分析。河南產(chǎn)地與陜西、遼寧、華北產(chǎn)地的差異標(biāo)記物中，其黃酮類成分特別是黃酮碳苷類成分、皂苷類成分含量較低。有大量研究認(rèn)為，紫外輻射、高光強(qiáng)、低溫、干旱等條件可能促進(jìn)黃酮的合成。其中光照、溫度的影響最大，可對(duì)黃酮合成途徑中關(guān)鍵酶[如查耳酮合成酶（CHS）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）等]的活性產(chǎn)生直接影響，從而影響植物中黃酮類成分的含量[32-33]。此外酸棗仁的“搶青”現(xiàn)象較嚴(yán)重，不同產(chǎn)地酸棗成熟時(shí)間不同，采收期也會(huì)對(duì)酸棗仁中化學(xué)成分產(chǎn)生影響[34]。本實(shí)驗(yàn)中河南酸棗仁樣品采集于河南南部的南陽、平頂山地區(qū)，這些地區(qū)降水量、平均相對(duì)濕度、平均氣溫均高于其他地區(qū)，這些氣候因素可能會(huì)對(duì)酸棗仁中黃酮類、皂苷類成分積累產(chǎn)生一定抑制作用。

另外，結(jié)果表明不同產(chǎn)地間的溫度、光照、降水、土壤等環(huán)境因子對(duì)酸棗仁化學(xué)組成是有一定影響的，但這些差異代謝物對(duì)于不同產(chǎn)地酸棗仁質(zhì)量高低、湯劑中酸棗仁用量與臨床療效之間的關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。該研究結(jié)果為評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地酸棗仁質(zhì)量提供了一種可行的方法，也為進(jìn)一步研究環(huán)境因子對(duì)酸棗仁品質(zhì)的影響提供了有關(guān)的基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。