劉進(jìn)，胡佳曉，馬小定，陳武，勒思，Jo Sumin，崔迪，周慧穎，張立娜，Shin Dongjin，黎毛毛，韓龍植，余麗琴

水稻RIL群體高密度遺傳圖譜的構(gòu)建及苗期耐熱性QTL定位

劉進(jìn)1,2，胡佳曉1，馬小定2，陳武1，勒思1，Jo Sumin3，崔迪2，周慧穎1，張立娜1，Shin Dongjin3，黎毛毛1，韓龍植2，余麗琴

1江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所/江西省農(nóng)作物種質(zhì)資源研究中心，中國南昌 330200；2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，中國北京 100081；3韓國農(nóng)村振興廳糧食科學(xué)院南部作物部，韓國密陽 627-803

【目的】隨著全球氣候變暖，高溫嚴(yán)重威脅糧食安全，發(fā)掘耐熱基因資源是培育耐高溫新品種和消除高溫危害最直接的綠色生態(tài)途徑，也是闡明耐熱生理生化和分子遺傳機(jī)理的基礎(chǔ)?！痉椒ā繕?gòu)建苗期耐熱性鑒定評價(jià)方法，以熱敏感品種周南稻和強(qiáng)耐熱品種贛早秈58號雜交衍生的重組自交系（recombinant inbred lines，RIL）群體為研究材料，利用高通量測序技術(shù)對親本和RIL群體進(jìn)行全基因組測序；依據(jù)171個(gè)家系的基因型數(shù)據(jù)，利用滑動窗口法將SNP信息轉(zhuǎn)換成Bin基因型，預(yù)測染色體上的重組斷點(diǎn)，構(gòu)建RIL群體高密度BinMap遺傳圖譜，結(jié)合耐熱表型數(shù)據(jù)，運(yùn)用QTL IciMapping軟件完備復(fù)合區(qū)間ICIM的作圖方法，進(jìn)行高溫脅迫下幼苗存活率和耐熱等級QTL分析?！窘Y(jié)果】構(gòu)建了一張包含3 321個(gè)Bin標(biāo)記高密度遺傳圖譜，各染色體Bin標(biāo)記數(shù)為159—400個(gè)，標(biāo)記間平均物理距離為106 kb；利用逐步高溫脅迫方式鑒定親本和RIL家系幼苗耐熱表型，高溫脅迫下，幼苗存活率和耐熱等級存在極顯著負(fù)相關(guān)性，且幼苗存活率與秈型基因頻率存在顯著正相關(guān)性，秈型基因頻率越高，耐熱性越好，RIL群體表型性狀呈現(xiàn)雙峰連續(xù)分布，苗期耐熱性可能受少數(shù)幾個(gè)主效QTL調(diào)控；共檢測到12個(gè)苗期耐熱性相關(guān)的QTL，其中，調(diào)控幼苗存活率和耐熱等級的QTL分別有8和4個(gè)，幼苗存活率和耐熱等級相關(guān)QTL存在遺傳重疊現(xiàn)象，形成調(diào)控耐熱性的主效QTL簇、和，三者在調(diào)控苗期高溫抗逆中具有重要作用，其中，為新發(fā)現(xiàn)主效QTL，對增強(qiáng)苗期耐熱性具有較強(qiáng)的功效。【結(jié)論】構(gòu)建了一張包含3 321個(gè)Bin標(biāo)記的高密度分子遺傳圖譜，解析了耐熱品種贛早秈58號苗期耐熱基因，鑒定出3個(gè)苗期耐熱調(diào)控關(guān)鍵QTL簇，發(fā)掘了一個(gè)新主效QTL簇，基于高密度遺傳圖譜高效獲取目標(biāo)區(qū)段及候選基因，篩選出8個(gè)苗期耐熱性調(diào)控的關(guān)鍵目標(biāo)基因。

水稻；高密度圖譜；苗期；耐熱性；QTL定位

0 引言

【研究意義】隨著全球氣候變暖，在水稻、小麥、玉米等主要糧食作物生產(chǎn)中，因受高溫危害導(dǎo)致減產(chǎn)問題日益凸顯[1-3]。水稻起源于低緯度地區(qū)，具有較強(qiáng)的喜溫特性，但當(dāng)外界溫度超過水稻植株生長發(fā)育所需溫度的上限時(shí)，植株生長發(fā)育、產(chǎn)量和品質(zhì)的形成將會受到高溫脅迫的不利影響[4-6]。中國長江流域稻作區(qū)早稻灌漿-成熟期、中稻抽穗-開花期期和晚稻移栽-返青期均受到不同程度的高溫危害，其中，雙季晚稻秧苗移栽正值夏秋高溫時(shí)段，移栽-返青期高溫危害導(dǎo)致幼苗存活率下降、生長勢弱，移栽返青后恢復(fù)生長慢，高溫脅迫導(dǎo)致分蘗與生物量形成不足已成為雙季晚稻（尤其是雙季晚粳）高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)化的關(guān)鍵限制因素[7-8]。發(fā)掘耐熱種質(zhì)與基因資源是培育耐熱水稻新品種并解決高溫危害的關(guān)鍵有效途徑，也是闡明耐熱生理生化和分子遺傳機(jī)理的基礎(chǔ)，已成為分子生物學(xué)與遺傳育種學(xué)研究的熱點(diǎn)之一[9]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】水稻耐熱性屬于典型的數(shù)量性狀，受多基因控制，易受環(huán)境的影響，存在明顯的基因型與環(huán)境互作效應(yīng)[9-10]。近年來，有關(guān)水稻耐熱性研究報(bào)道較多，鑒定的耐熱性相關(guān)QTL達(dá)165個(gè)，少數(shù)幾個(gè)耐熱主效基因被精細(xì)定位或克隆，這為闡明水稻耐熱性相關(guān)生理生化與分子遺傳機(jī)制奠定了良好基礎(chǔ)[11-12]。目前，水稻耐熱性研究多關(guān)注于產(chǎn)量和品質(zhì)直接相關(guān)的抽穗-灌漿期耐熱調(diào)控機(jī)制的解析，而有關(guān)芽期和苗期等水稻營養(yǎng)生長期耐熱性研究報(bào)道偏少，其耐熱性調(diào)控分子遺傳機(jī)理不甚清楚[9, 13-14]。水稻移栽返青期“早生快發(fā)”特性對產(chǎn)量和品質(zhì)形成存在明顯的影響，適宜環(huán)境下移栽返青后水稻幼苗迅速恢復(fù)生長，高效獲取光溫水肥資源，促進(jìn)分蘗與生物量形成，為高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)奠定良好的物質(zhì)基礎(chǔ)，而高溫環(huán)境下熱敏感水稻品種幼苗移栽后生長緩慢，這將限制隨后的生長發(fā)育及產(chǎn)量的形成?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】近年來，長江中下游稻區(qū)（如江西、安徽、湖北和浙江等省市）逐步開始發(fā)展“秈改粳”或“早秈晚粳”生產(chǎn)模式，移栽-返青期高溫危害成為該區(qū)域粳稻高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的主要限制因子[15-17]。同時(shí)，以往多數(shù)耐熱QTL研究常采用SSR、Indel等標(biāo)記構(gòu)建傳統(tǒng)遺傳圖譜，其多態(tài)性標(biāo)記數(shù)量和覆蓋度相對較少；雖然已獲得了一些耐熱相關(guān)的QTL，但置信區(qū)間大，未能有效獲取目標(biāo)區(qū)域內(nèi)關(guān)鍵候選基因，可應(yīng)用于分子標(biāo)記輔助育種的位點(diǎn)相對較少，而基于全基因組測序技術(shù)構(gòu)建的高密度遺傳圖譜在關(guān)鍵QTL發(fā)掘中具有明顯的優(yōu)勢，便于高效獲取目標(biāo)基因[18-20]。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究以周南稻（熱敏品種）和贛早秈58號（耐熱品種）雜交衍生RIL群體為試驗(yàn)材料，采用全基因組測序技術(shù)獲取高密度Bin遺傳圖譜，鑒定高溫脅迫下幼苗存活率與耐熱等級，發(fā)掘耐熱性調(diào)控關(guān)鍵QTL及候選基因，以期為水稻苗期耐熱性遺傳改良提供基因資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及田間試驗(yàn)

利用熱敏感粳稻周南稻（Junambyeo，JNB）和強(qiáng)耐熱秈稻贛早秈58號（Ganzaoxian58，GZX58）雜交獲取F1。周南稻為韓國粳稻品種，贛早秈58號為江西省早秈稻品種。從F2開始采用單粒傳法構(gòu)建RIL群體（F8），包含171個(gè)家系。田間試驗(yàn)于2019年在江西省宜春市江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高安綜合試驗(yàn)基地進(jìn)行，種植RIL群體和2個(gè)親本。5月9日播種，6月7日移栽，每個(gè)家系種植3行，每行8穴，每穴1苗，行株距為20 cm×16.5 cm。抽穗期取代表性單株掛牌，取劍葉葉片，-80℃保存；成熟后收獲掛牌單株的全部稻穗，脫粒晾干，破除休眠后用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2 水稻苗期耐熱性鑒定評價(jià)

利用研究團(tuán)隊(duì)前期構(gòu)建的階梯式逐步高溫脅迫方法，參照劉進(jìn)等[12]鑒定方法評價(jià)水稻苗期耐熱性。選取120粒飽滿的水稻種子，采用4%次氯酸鈉溶液消毒，清水沖洗2—3次，置于培養(yǎng)皿中浸種、催芽36 h。選取芽長長勢均勻一致的種子種植于96孔PCR板上，每個(gè)家系種植3行，每孔放入1粒芽谷，每行8粒（株），設(shè)2個(gè)隨機(jī)重復(fù)小區(qū)。出苗后間隔3—4 d更換一次營養(yǎng)液（Yoshida），培養(yǎng)幼苗生長至2葉1心或3葉期，剔除長勢較弱的幼苗。正常培養(yǎng)和恢復(fù)培養(yǎng)條件：28℃光照14 h/24℃黑暗10 h，相對濕度為75%；高溫處理采用階梯式逐步升溫和降溫方式，高溫預(yù)處理?xiàng)l件：38℃ 4 h，40℃ 6 h，光照；高溫處理?xiàng)l件：45℃光照14 h/40℃黑暗10 h，持續(xù)60—72 h；高溫遞降處理?xiàng)l件：40℃ 6 h、38℃ 4 h，光照，相對濕度均設(shè)置為75%；高溫處理結(jié)束后恢復(fù)培養(yǎng)7 d，調(diào)查幼苗存活率和耐熱等級。幼苗存活率以高溫脅迫下存活幼苗數(shù)與處理苗數(shù)的百分比表示，耐熱等級評價(jià)依據(jù)幼苗存活率、葉綠素含量和新葉、新根生長等情況判定，具體判定標(biāo)準(zhǔn)見表1。設(shè)3次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)，取均值作為統(tǒng)計(jì)單元。

表1 水稻苗期耐熱等級判定標(biāo)準(zhǔn)

1.3 RIL群體基因型鑒定與高密度遺傳圖譜構(gòu)建

利用Plant Genomic DNA Kit（TIANFEN）試劑盒提取DNA，具體操作過程參考試劑盒說明。配制1%瓊脂糖凝膠檢測提取DNA質(zhì)量，并用NanoDrop 2000c DNA檢測儀測定DNA濃度，檢測合格的DNA用于后續(xù)測序分析。本研究基因組測序工作委托北京諾禾致源科技股份有限公司完成。測序和數(shù)據(jù)初步處理過程如下：（1）高質(zhì)量DNA樣品通過Covaris超聲波破碎儀隨機(jī)打斷，末端修復(fù)、加A尾、加測序接頭、純化；（2）PCR擴(kuò)增制備文庫，通過Illumina測序儀進(jìn)行文庫測序，并檢驗(yàn)建文庫質(zhì)量，將不同文庫按有效濃度和目標(biāo)下機(jī)數(shù)據(jù)量的需求進(jìn)行pooling分析；（3）利用Illumina HiSeq/MiSeq測序儀進(jìn)行測序獲取原始數(shù)據(jù)，經(jīng)過測序接頭去除、缺失比率過濾、堿基測序質(zhì)量檢驗(yàn)等過程，提取完善的測序數(shù)據(jù)用于后續(xù)分析。

參考Huang等[21]“滑動窗口”方法尋找交換點(diǎn)，將所有樣本中緊密連鎖、不發(fā)生重組的若干個(gè)SNP視為一個(gè)整體（Bin標(biāo)記），以Bin標(biāo)記起點(diǎn)確定其所在物理位置；根據(jù)基因型采用最大似然函數(shù)計(jì)算重組率，并利用Kosambi作圖函數(shù)將其轉(zhuǎn)換為遺傳距離，采用Jionmap 4.0軟件以LOD=6.0為閾值將所有Bin進(jìn)行連鎖群劃分，基于三點(diǎn)測驗(yàn)法對連鎖群內(nèi)標(biāo)記進(jìn)行排序，并利用最優(yōu)AIC值確定標(biāo)記最佳位置。

1.4 QTL分析

基于全基因組測序構(gòu)建的高密度遺傳圖譜，采用Wang等[22]QTL ICI Mapping 4.2的完備區(qū)間作圖（ICIM）方法進(jìn)行加性效應(yīng)QTL分析，LOD的閾值設(shè)為2.50，當(dāng)實(shí)際求得的LOD值大于LOD閾值時(shí)，判定該區(qū)段存在1個(gè)QTL，同時(shí)估算每個(gè)QTL的加性效應(yīng)值和貢獻(xiàn)率大小。QTL的命名遵循McCouch[23]原則。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證本試驗(yàn)定位結(jié)果的準(zhǔn)確性，同時(shí)評價(jià)篩選到的主效QTL累加效應(yīng)，利用姜樹坤等[24]“選擇作圖”策略進(jìn)行QTL驗(yàn)證和累加效應(yīng)分析。首先將控制苗期耐熱性的其他QTL位點(diǎn)根據(jù)分子標(biāo)記數(shù)據(jù)進(jìn)行非增效基因的固定，以此來避免其他QTL對后續(xù)分析的影響，然后在RIL群體中篩選目標(biāo)QTL區(qū)間的關(guān)鍵重組交換單株，進(jìn)而對QTL進(jìn)行驗(yàn)證和累加效應(yīng)分析。

2 結(jié)果

2.1 水稻RIL群體苗期耐熱性表型鑒定

高溫環(huán)境下，對2個(gè)親本與RIL群體各家系進(jìn)行幼苗存活率和耐熱等級鑒定表明，贛早秈58號的苗期耐熱性較強(qiáng)，幼苗存活率較高，耐熱等級為1.67級，高溫脅迫下植株表型基本不受影響；而周南稻對高溫脅迫敏感，耐熱等級為8.33級，高溫處理后幼苗基本全部死亡（圖1和圖2）。RIL群體中不同家系間耐熱性存在明顯差異，幼苗存活率和耐熱等級均呈現(xiàn)非正態(tài)分布的連續(xù)分布，水稻苗期耐熱性受QTL調(diào)控，呈現(xiàn)不明顯的雙峰分布，可能存在主效QTL作用（圖2）。幼苗存活率與耐熱等級存在極顯著負(fù)相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)達(dá)-0.890，耐熱性越強(qiáng)的家系，其幼苗存活率越高，其耐熱等級越??；RIL群體家系呈現(xiàn)偏秈型分布，耐熱性與秈型頻率呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.516，偏秈家系苗期耐熱性明顯強(qiáng)于偏粳家系（圖3）。

2.2 遺傳連鎖圖譜構(gòu)建

對親本和RIL群體171個(gè)家系進(jìn)行DNA測序，測序深度平均值為8.65×。獲取高質(zhì)量多態(tài)性SNP位點(diǎn)717 414個(gè)，過濾和去除低質(zhì)量標(biāo)記后得到318 339個(gè)有效SNP標(biāo)記，提取多態(tài)性標(biāo)記位點(diǎn)基因型。采用滑動窗口策略、步移長度為1檢測RIL群體重組斷點(diǎn)，將SNP轉(zhuǎn)換為3 321個(gè)Bin標(biāo)記，劃分為12個(gè)連鎖群；利用極大似然法和Kosambi函數(shù)對Bin標(biāo)記進(jìn)行排序和遺傳距離計(jì)算；遺傳總圖距為1 703.09 cM，染色體平均遺傳距離為195.3 cM，染色體平均包含276.8個(gè)Bin，標(biāo)記間平均遺傳距離為0.51 cM，標(biāo)記間平均物理距離約為106 kb（圖4-A—B和表2）。各連鎖群標(biāo)記遺傳圖距與物理圖距Spearman相關(guān)系數(shù)均值為0.997，表明遺傳標(biāo)記與基因組存在極顯著的共線性關(guān)系（圖4-C）。各個(gè)連鎖群bin標(biāo)記數(shù)量、總圖距、平均圖距等基本信息如表2所示，其中，第3染色體Bin標(biāo)記數(shù)最多，第12染色體Bin標(biāo)記數(shù)最少。

2.3 苗期耐熱性QTL定位及候選基因分析

共檢測到12個(gè)控制苗期耐熱性的QTL，分布于第2、3、4、6、7、8、9和12染色體上，LOD值介于2.52—6.52，表型貢獻(xiàn)率為5.25%—18.88%，加性效應(yīng)值介于-17.86%—9.44%（表3和圖5）。檢測到8個(gè)與高溫脅迫下幼苗存活率相關(guān)的QTL，相關(guān)QTL聯(lián)合貢獻(xiàn)率達(dá)60.93%，其中，、和被定位在100—178 kb區(qū)間，、和被定位在300—409 kb區(qū)間，和定位區(qū)間相對較大，分別為889和571 kb；被定位在第7染色體Block11026—Block11067區(qū)間，物理位置為2 023 438— 2 912 508 bp，貢獻(xiàn)率和效應(yīng)值相對較大，增效等位基因來自贛早秈58號，可顯著提升高溫脅迫下幼苗存活率。

A：常溫培養(yǎng)群體表型；B：高溫脅迫處理群體表型；C：高溫脅迫處理后2個(gè)親本表型比較；D：RIL群體高溫脅迫后不同耐熱等級的典型家系表型

A：高溫幼苗存活率HTSR表型分布；B：耐熱等級HTC表型分布

共檢測到4個(gè)調(diào)控耐熱等級的QTL，分布于第2、7和8染色體上，相關(guān)QTL聯(lián)合貢獻(xiàn)率達(dá)45.13%，和分別被定位在標(biāo)記Block4364-4396和Block12456-12597之間，物理距離分別為409和571 kb，和被定位于標(biāo)記Block3098-3136和Block11026-11067之間。其中，主效QTL貢獻(xiàn)率為18.88%，被定位在第7染色體2 023 438— 2 912 508 bp（889 kb），增效等位基因來自贛早秈58號，具有較強(qiáng)調(diào)控耐熱等級的效應(yīng)。比較分析還發(fā)現(xiàn)，幼苗存活率和耐熱等級存在遺傳重疊現(xiàn)象，即和、和、和位于相同染色體區(qū)域，形成調(diào)控耐熱的主效QTL簇、和，其中，被定位在第7染色體Block11026-11067區(qū)間的主效QTL簇，貢獻(xiàn)率和效應(yīng)值較大，具有明顯調(diào)控耐熱等級和幼苗存活率的功能。

A：幼苗存活率和耐熱等級相關(guān)關(guān)系；B：RIL群體秈型基因頻率分布；C：幼苗存活率與秈型基因頻率相關(guān)分析。**表示極顯著相關(guān)性

A：高密度Bin標(biāo)記RIL群體各家系的基因型；B：高密度Bin標(biāo)記染色體分布；C：連鎖群標(biāo)記遺傳圖譜與物理圖譜相關(guān)性

表2 水稻RIL群體遺傳連鎖圖染色體標(biāo)記分布

表3 水稻苗期耐熱性QTL分析

利用The Rice Annotation Project（RAP）網(wǎng)站對已定位的3個(gè)主效QTL簇定位區(qū)間開展相關(guān)候選基因查詢，在定位區(qū)間發(fā)現(xiàn)95個(gè)注釋基因，篩選到6個(gè)可能與苗期耐熱性相關(guān)候選基因，分別為、、、、和，其中，編碼一個(gè)水稻單半乳糖甘油二酯合酶基因，參與耐淹、耐低溫和耐旱性脅迫響應(yīng)，參與光合作用，影響植物生長發(fā)育與產(chǎn)量；編碼一個(gè)熱休克蛋白Hsp40分子伴侶，DnaJ結(jié)構(gòu)域含蛋白；編碼一個(gè)核糖核苷酸還原酶，葉綠體生物合成。定位區(qū)間包含112個(gè)注釋基因，篩選出8個(gè)與苗期耐熱性相關(guān)候選基因，分別為、、、、、、和，其中，編碼一個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子、ABA誘導(dǎo)的葉片衰老和分蘗，編碼一個(gè)光敏色素相互作用的bHLH因子，冷誘導(dǎo)的的選擇性剪接變體，光與應(yīng)激信號之間互作，編碼一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，與耐冷脅迫響應(yīng)相關(guān)。定位區(qū)間包含了85個(gè)注釋基因，篩選到8個(gè)可能影響苗期耐熱性相關(guān)的候選基因，分別為、、、、、、和，其中，編碼一個(gè)烏頭酸酶，熱脅迫響應(yīng)基因，編碼一個(gè)乙二醛酶I，參與非生物應(yīng)激響應(yīng)，編碼NAC轉(zhuǎn)錄因子，參與抗旱性調(diào)控，這些抗逆相關(guān)的預(yù)測基因可能是與水稻苗期耐熱性相關(guān)主效QTL簇的關(guān)鍵候選基因（表4）。

紅色實(shí)心和綠色條框分別表示幼苗存活率和耐熱等級QTL Red solid and green box indicate the QTL for HTSR and HTC, respectively

2.4 苗期耐熱性主效QTL累加效應(yīng)及功能驗(yàn)證分析

利用姜樹坤等[24]“選擇作圖”策略進(jìn)行主效QTL的驗(yàn)證與累加效應(yīng)分析。研究表明，不含苗期耐熱主效QTL簇的周南稻和家系在高溫脅迫下幼苗存活率分別為（5.20±1.20）%和（1.00±0.10）%，高溫脅迫下耐熱等級均為9級，為極端熱敏感型種質(zhì)（圖6和圖7）；同時(shí)含有、和的贛早秈58號和家系在高溫處理下幼苗存活率分別為（78.32±5.36）%和（78.00±12.00）%，耐熱等級為1級或3級，耐熱性極顯著強(qiáng)于周南稻和其他基因型家系，為強(qiáng)耐熱型種質(zhì)；含有3個(gè)主效QTL簇中任一位點(diǎn)的家系高溫處理下幼苗存活率為11.25%—46.32%，幼苗存活率明顯高于不含主效QTL簇的家系，耐熱等級為3—5級，屬于中間型材料；基因型為+、+的家系在高溫處理下幼苗存活率顯著高于含單一主效QTL簇的家系，耐熱等級為1—3級，為耐熱型種質(zhì)，且和效應(yīng)明顯強(qiáng)于（圖6和圖7）。表明3個(gè)主效QTL簇在RIL群體聚合時(shí)主要表現(xiàn)為累加效應(yīng)，包含2個(gè)或3個(gè)主效QTL簇的家系耐熱性較強(qiáng)。

3 討論

3.1 水稻苗期耐熱相關(guān)QTL比較

隨著全球氣候變暖，水稻生產(chǎn)面臨的非生物逆境越來越多，包括干旱、高溫、低溫和鹽堿脅迫等，其中，高溫危害已成為影響水稻生長發(fā)育、產(chǎn)量和品質(zhì)形成的重要瓶頸，耐熱優(yōu)異種質(zhì)和主效QTL鑒定發(fā)掘已成為分子生物學(xué)和育種研究關(guān)注的熱點(diǎn)之一[25-27]。水稻耐熱性屬于數(shù)量性狀，受多基因調(diào)控，存在明顯的環(huán)境互作效應(yīng)，高效規(guī)范的鑒定方法是獲取準(zhǔn)確的表型數(shù)據(jù)和發(fā)掘主效QTL的重要保證[28-30]。國內(nèi)外一些研究者利用不同類型遺傳群體，發(fā)掘了165個(gè)耐熱相關(guān)QTL，精細(xì)定位或克隆了10個(gè)耐熱關(guān)鍵基因，水稻耐熱性調(diào)控遺傳機(jī)制研究取得較大進(jìn)展，但有關(guān)水稻苗期耐熱性鑒定和QTL定位研究相對較少，其分子遺傳機(jī)制尚不清楚[9, 31-32]。LI等[33]利用染色體片段替換系，定位到5個(gè)耐熱相關(guān)QTL，并克隆了一個(gè)控制苗期耐熱性的；Liu等[34]鑒定了一個(gè)苗期耐熱基因，該基因編碼一個(gè)E3泛素連接酶，通過促進(jìn)H2O2誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉來提高水稻耐熱性；Wang等[35]鑒定了一個(gè)高溫敏感的矮化突變體，編碼一個(gè)溫度介導(dǎo)和節(jié)律調(diào)控的DEAD-BoxRNA解旋酶，表達(dá)受高溫脅迫誘導(dǎo)，調(diào)控細(xì)胞增殖和植株生長發(fā)育；KAN等[36]在熱帶粳稻鑒定了一個(gè)耐熱性基因，該基因編碼一個(gè)G蛋白γ亞基，當(dāng)功能缺失時(shí)將增強(qiáng)水稻營養(yǎng)生長期和生殖生長期的耐熱性，當(dāng)功能正常時(shí)，呈現(xiàn)出熱敏感表型，呈現(xiàn)出耐熱表型；Zhang等[37]定位到一個(gè)控制水稻高溫抗性的QTL，含有的非洲栽培稻CG14具有較強(qiáng)的耐高溫性，隨后研究表明，耐熱性基因存在2個(gè)相互拮抗的基因和，其中，正調(diào)控抗性，而負(fù)調(diào)控抗性，且位于遺傳上游發(fā)揮功能。本研究團(tuán)隊(duì)前期構(gòu)建了水稻苗期耐熱性快速鑒定的技術(shù)方法，利用耐熱型中優(yōu)早8號和高溫敏感型龍稻5號雜交衍生的RIL群體為試驗(yàn)材料，共檢測到12個(gè)控制苗期耐熱性的QTL，相關(guān)QTL成簇分布于第1、4、5和8染色體，并利用剩余雜合體驗(yàn)證了主效QTL簇的功能[12]。本研究利用高溫敏感型周南稻與耐熱型贛早秈58號雜交構(gòu)建RIL群體，基于全基因組測序構(gòu)建高密度遺傳圖譜，共鑒定到12個(gè)耐熱性相關(guān)QTL，比較分析發(fā)現(xiàn)/與Ravikiran等[38]定位的，與Ye等[39]和劉進(jìn)等[12]鑒定的、，與Chen等[32]鑒定的，與Ravikiran等[38]定位的、所在染色體區(qū)域相近，這些QTL在不同群體中重演性較好，具有較強(qiáng)的調(diào)控水稻耐熱性的效應(yīng)，而、、、和為新發(fā)現(xiàn)的5個(gè)QTL。高溫脅迫下幼苗存活率與耐熱等級存在顯著相關(guān)性，檢測到的QTL存在明顯的遺傳重疊現(xiàn)象，形成3個(gè)苗期耐熱性調(diào)控主效QTL簇（和）、（和）和（和），具有調(diào)控耐熱等級和幼苗存活率的多效性功能，其中，主效QTL的LOD值、貢獻(xiàn)率和效應(yīng)值較大，為新發(fā)現(xiàn)的苗期耐熱性調(diào)控位點(diǎn)。

表4 主效QTL簇定位區(qū)間關(guān)鍵候選基因分析

加粗與*表示苗期耐熱顯著關(guān)聯(lián)候選基因Bold and * indicate candidate genes for significant association of heat tolerance at seedling stage

*和**分別表示在0.05和0.01水平差異顯著，ns表示無顯著差異。n：某一基因型家系數(shù)量，共計(jì)171個(gè)家系，9個(gè)家系基因型雜合或缺失

A和C為親本贛早秈58號和周南稻苗期高溫脅迫表型，贛早秈58號包含主效QTL簇qHTS2、qHTS7和qHTS8，周南稻不含正效應(yīng)主效QTL，為—基因型；B和D為不同類型基因聚合效果，R162、R93、R102、R61、R67和R20基因型分別為qHTS7+qHTS8、qHTS2+qHTS7、qHTS7、qHTS8、qHTS2和—；A和B為水培環(huán)境下高溫脅迫表型，C和D為土培環(huán)境下高溫脅迫處理表型

3.2 高密度遺傳圖譜發(fā)掘QTL優(yōu)勢

以往傳統(tǒng)QTL定位中，遺傳圖譜常采用RFLP、SSR、InDel等分子標(biāo)記構(gòu)建完成，受多態(tài)性遺傳標(biāo)記的數(shù)量、覆蓋密度限制，定位區(qū)間一般較大，不能有效地壓縮定位區(qū)間和篩選目標(biāo)基因，后期精細(xì)定位工作量較大，且許多QTL仍未被發(fā)現(xiàn)[40-41]。近年來，隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展及成本的不斷降低，高通量測序可獲取大量多態(tài)性SNP標(biāo)記，具有高通量、全覆蓋、省時(shí)省力等優(yōu)勢，有利于高效、精確定位主效QTL和發(fā)掘候選基因，已成為作物高密度遺傳圖譜構(gòu)建及重要性狀基因快速、高效發(fā)掘的關(guān)鍵技術(shù)[42-44]。高密度遺傳圖譜包含數(shù)量巨大的SNP標(biāo)記，可采用連鎖分析、QTL-seq、QTL-BSA和生物信息學(xué)等技術(shù)相結(jié)合促進(jìn)關(guān)鍵基因的發(fā)掘[24, 45-47]。董驥馳等[48]基于高密度Bin標(biāo)記的遺傳圖譜，在4個(gè)環(huán)境下共定位到14個(gè)影響水稻抽穗期的QTL，其中為穩(wěn)定表達(dá)的置信區(qū)間為28.15—28.65 Mb，包含33個(gè)注釋基因，其中，、和功能與抽穗期緊密相關(guān)且存在多個(gè)變異位點(diǎn)；張健等[41]利用GBS測序技術(shù)構(gòu)建高密度遺傳圖譜，檢測到5個(gè)QTL簇、、、和，基于較小的高密度遺傳圖譜定位QTL區(qū)間，結(jié)合功能注釋和數(shù)據(jù)庫表達(dá)譜信息在和定位區(qū)間分別篩選到7個(gè)籽粒大小候選基因，最終將和確定為目標(biāo)基因；趙凌等[49]構(gòu)建了包含12 328個(gè)Bin標(biāo)記的高密度遺傳圖譜，不同環(huán)境下共檢測到19個(gè)抽穗期葉綠素含量相關(guān)QTL，其中，和在不同環(huán)境下穩(wěn)定表達(dá)，通過物理位置比對和功能注釋及親本間序列差異分析，在定位區(qū)間發(fā)現(xiàn)2個(gè)葉綠素含量相關(guān)目標(biāo)基因，分別為天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因（）和葉面斑點(diǎn)相關(guān)蛋白基因（）。本研究采用全基因組測序技術(shù)構(gòu)建的高密度Bin圖譜，獲取318 339個(gè)SNP，簡并成3 321個(gè)Bin標(biāo)記，標(biāo)記間遺傳距離為0.51 cM，標(biāo)記間平均物理距離為106 kb，12個(gè)主效QTL所定位區(qū)段的物理距離為103—889 kb，QTL定位目標(biāo)區(qū)間相對較小，可利用目標(biāo)區(qū)段物理位置快速篩選候選基因，這與以往利用傳統(tǒng)SSR等標(biāo)記圖譜初步鎖定的5—10 cM的QTL候選區(qū)間存在明顯差異[3, 50]。因此，高密度遺傳圖譜有助于高效精準(zhǔn)獲取關(guān)鍵QTL的目標(biāo)區(qū)段，也為分子標(biāo)記輔助選擇育種奠定良好的基礎(chǔ)。同時(shí)，主效QTL簇、和分別被定位在Chr.2：34 029 923—34 439 386 bp（409 kb）、Chr.7：2 023 438—2 912 508 bp（889 kb）和Chr.8：5 289 371—5 860 658 bp（571 kb）區(qū)域內(nèi)，候選區(qū)域內(nèi)分別篩選到95個(gè)、112個(gè)和85個(gè)注釋基因，目標(biāo)候選區(qū)域與候選基因數(shù)量與董驥馳等[48]、趙凌等[49]利用高密度遺傳圖譜鑒定結(jié)果存在較大差異，基于基因注釋功能最終篩選出22個(gè)抗逆性相關(guān)的基因作為關(guān)鍵候選基因，這為繼續(xù)開展水稻耐熱性候選基因的功能研究提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

以往研究中RIL群體數(shù)量一般為200—250個(gè)株系，進(jìn)行適度基因型選擇使目標(biāo)群體有效株系的基因充分重組，提高全基因組水平QTL作圖的精度，為QTL精細(xì)定位和克隆提供支撐[18, 51]。本研究將主效QTL的目標(biāo)區(qū)域鎖定在3—6個(gè)標(biāo)記之間，候選區(qū)域?yàn)?00—700 kb，這導(dǎo)致預(yù)測的候選基因相對較多，較難精準(zhǔn)篩選出關(guān)鍵目標(biāo)基因，主要原因可能是所構(gòu)建的RIL群體家系偏少，僅含171個(gè)家系，且群體遺傳組分偏向秈稻，導(dǎo)致定位目標(biāo)區(qū)域內(nèi)基因重組不充分，難以成功壓縮定位區(qū)間；若遺傳群體（F2和RIL等）具有足夠數(shù)量的遺傳個(gè)體，主效QTL有可能被精細(xì)定位在2個(gè)標(biāo)記間，目標(biāo)區(qū)域可精確到100 kb以內(nèi)，目標(biāo)候選基因也將被高效精準(zhǔn)篩選，這將為目標(biāo)QTL的精細(xì)定位和生物學(xué)功能解析奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

構(gòu)建了周南稻與贛早秈58號雜交衍生的RIL群體的高密度遺傳圖譜，該圖譜包含3 321個(gè)Bin標(biāo)記，總圖距1 703.09 cM，相鄰2個(gè)Bin標(biāo)記間的平均遺傳圖距為0.51 cM；構(gòu)建優(yōu)化水稻苗期耐熱鑒定方法，以高溫脅迫下幼苗存活率和耐熱等級為指標(biāo)，共檢測到12個(gè)苗期耐熱性相關(guān)的QTL，相關(guān)位點(diǎn)在染色體上成簇分布，發(fā)現(xiàn)3個(gè)效應(yīng)明顯的主效QTL簇（、和），其中，為新發(fā)現(xiàn)的效應(yīng)明顯的主效QTL，定位區(qū)段內(nèi)共有112個(gè)注釋基因，僅有8個(gè)注釋基因與抗逆性相關(guān)，、和0為調(diào)控苗期耐熱性的關(guān)鍵候選基因；同時(shí)，利用Bin標(biāo)記鑒定RIL群體不同家系主效QTL的基因型，結(jié)合耐熱表型性狀初步驗(yàn)證了主效、和在苗期高溫脅迫響應(yīng)中的生物學(xué)功能。

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Construction of High Density Genetic Map for RIL population and QTL Analysis of Heat Tolerance at Seedling Stage in Rice (L.)

Liu Jin1,2, Hu Jiaxiao1, Ma XiaoDing2, Chen Wu1, Le Si1, Jo Sumin3, Cui Di2, Zhou HuiYing1, Zhang Lina1, Shin Dongjin3, Li Maomao1, Han Longzhi2, Yu Liqin1

1Rice Research Institute, Jiangxi Academy of Agricultural Sciences/Research Center of Jiangxi Crop Germplasm Resources, Nanchang 330200, China;2Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China;3Department of Southern Area Crop Science, National Institute of Crop Science, Rural Development Administration, Milyang 627-803, South Korea

【Objective】With global warming, high temperature has an increasing impact on food crop safe. Excavation of heat tolerance gene resources is the most direct green ecological method to cultivate new varieties of heat resistance and eliminate the harm of high temperature, which also the basis for clarifying the physiological, biochemical and molecular genetic mechanism of heat tolerance.【Method】Establishing the identification and evaluation method of heat tolerance at seedling stage, a set of RIL populations was structured from the extreme heat-tolerance Ganzaoxian58(GZX58) and heat-sensitive Junambyeo (JNB), and then the high density genetic map was constructed using genotyping by resequencing technology. To converting SNP information into Bin genotype of the RIL population using sliding window method, which predicting the recombination breakpoints on the chromosomes, finally a high density BinMap genetic map was constructed. Based on the genotype and phenotype data of the 171 lines, QTL mapping of the high temperature seedling survival rate (HTSR) and heat tolerance class (HTC) was performed by ICIM method of the QTL IciMapping software.【Result】A high-density genetic map containing 3 321 Bin markers was constructed, the number of Bin markers for each chromosome between 159 and 400, the average physical distance two markers was about to 106 kb; heat tolerance of the parents and RIL populations was identified by stepwise heat stress at seedlings stage, there have a significant negative correlation between HTSR and HTC, in addition, there has a significant positive correlation between HTSR and indica gene frequency (), which the higher of the, the heat tolerance is better; the bi-modal continuous distribution of phenotype traits from the RIL population showed that the heat tolerance is regulated by few major QTL. A total of 12 QTL controlling with heat tolerance at seedling stage, there have 8 and 4 QTL regulating for HTSR and HTC, respectively. There has a significant genetic overlap from HTSR and HTC,,and, three major QTL cluster play an important role in regulating the heat tolerance at seedling stage. Among these QTL,was a novel major QTL cluster, which has a strong effect on enhancing the heat resistance at seedling stage. 【Conclusion】We constructed a high density genetic linkage map containing 3 321 Bin markers, which be used to analyzed the heat tolerance gene from the GZX58 at seedling stage, there have three key QTL cluster identified associated with the heat tolerance, a novel QTL clusterwas discovered, efficient acquisition of target segments and candidate genes based on high-density genetic mapping, eight key candidate genes were selected by bioinformatics for regulation of the heat tolerance.

rice; high-density genetic map; seedling stage; heat tolerance; QTL mapping

10.3864/j.issn.0578-1752.2022.22.001

2022-07-04；

2022-08-12

國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2021YFD1200500，2021YFD1200501-7）、江西現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科研協(xié)同創(chuàng)新專項(xiàng)（JXXTCXQN202205，JXXTCX202101）

劉進(jìn)，E-mail：riceliujin@163.com。通信作者韓龍植，E-mail：hanlongzhi@caas.cn。通信作者余麗琴，E-mail：lqyu480@163.com

（責(zé)任編輯 李莉）