■卓微偉 任勝杰 王 笑 顧曉龍 李定剛 謝仁成

（1.江蘇醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院藥學(xué)院，江蘇鹽城 224005；2.鹽城工學(xué)院海洋與生物工程學(xué)院，江蘇鹽城 224051；3.保定冀中生物科技有限公司，河北保定 071000）

魚粉是水產(chǎn)養(yǎng)殖動物飼料配方中的重要原料，飼料中魚粉替代的研究工作一直是水產(chǎn)飼料技術(shù)研究的熱點[1-2]，尤其是用豆粕等植物蛋白質(zhì)原料替代魚粉的研究較多[3]。植物性蛋白質(zhì)原料部分或全部替代魚粉后，會導(dǎo)致飼料中營養(yǎng)素不平衡，或因為植物蛋白質(zhì)原料中抗?fàn)I養(yǎng)因子等的作用，養(yǎng)殖魚體出現(xiàn)較為典型的炎癥（如腸炎、肝炎等）[4-5]。水產(chǎn)動物研究中發(fā)現(xiàn)植物多糖由于其獨特的藥理特性表現(xiàn)出優(yōu)異的消除炎癥、抗氧化、促進生長性能等功效[6]，因此通過在低魚粉飼料配方中添加適宜種類和含量的天然植物多糖可能是一種改善高植物蛋白飼料對養(yǎng)殖魚類的不良生理影響的有效途徑。白術(shù)多糖是從白術(shù)（Atrctylodes macrocephalaKoidz.，白術(shù)已列入《飼料原料目錄》）干燥根中提取的活性成分。有研究發(fā)現(xiàn)，日糧中添加白術(shù)多糖具有改善動物腸道健康、促進免疫功能的作用，應(yīng)用于畜禽生產(chǎn)中能夠促進畜禽生長，提高抗病能力[7]。白術(shù)多糖也是一種提高免疫功能的免疫增強劑，可通過激活由TLR4介導(dǎo)的TLR4-MyD88/NF-κB以及TCR-NFAT信號通路，調(diào)控NF-κB和NFAT的表達，促進細胞因子產(chǎn)生，從而促進巨噬細胞活化[8]。

黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco），又稱黃辣丁，屬鲇形目（Siluriformes）、鲿科（Bagridae）、擬鲿屬（Tachysurus），是我國重要的養(yǎng)殖魚類品種，據(jù)2022年中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒最新數(shù)據(jù)顯示，2021年其養(yǎng)殖產(chǎn)量高達58.78萬噸。試驗通過設(shè)計養(yǎng)殖試驗來評估飼料中添加白術(shù)多糖對因豆粕等蛋白替代魚粉后黃顙魚生長性能、臟體指數(shù)、體成分、血漿生化以及肝腸形態(tài)不良影響的改善效果，研究白術(shù)多糖作為飼料功能性添加劑在黃顙魚中的適宜添加量，研究結(jié)果能夠為白術(shù)多糖作為水產(chǎn)魚類飼料添加劑的可行性提供一定的參考。

1 材料方法

1.1 試驗飼料

試驗選用魚粉（智利）、豆粕和菜粕為主要蛋白源，根據(jù)黃顙魚營養(yǎng)需求，參照呂斌等[9]黃顙魚研究的配方參數(shù)，配制粗蛋白含量為42.70%、粗脂肪含量為9.97%的試驗飼料。試驗中設(shè)置含有15%魚粉的對照組（CON 組）和用豆粕等蛋白替代25%魚粉的豆粕組（SBM 組），以及分別在CON 組和SBM 組中添加250、500 mg/kg的白術(shù)多糖（C250、C500、S250組和S500組）6 組等氮等脂飼料，飼料配方及營養(yǎng)水平見表1。白術(shù)多糖（純度≥98%）由保定冀中生物科技有限公司提供，其他飼料原料由浙江恒興飼料有限公司提供。飼料原料經(jīng)充分粉碎過60 目孔徑分篩，用制粒機制成3.0 mm的沉性顆粒飼料，70 ℃烘干至水分低于10%，16目篩篩去破碎顆粒，自封袋密封后放入-20 ℃冰箱中儲存?zhèn)溆谩?/p>

表1 飼料配方及營養(yǎng)水平（%）

1.2 試驗魚和管理

試驗黃顙魚幼魚購自浙江省湖州市南潯苗種場。試驗魚進行兩周暫養(yǎng)、馴化，暫養(yǎng)期間每天按照魚體重的3%～5%、7：30 和17：30 表觀飽食投喂對照（CON）飼料兩次。停食24 h 后選取720 尾規(guī)格一致的黃顙魚[初均重（10.13±0.26）g]，隨機分組并放入容積為600 L的18個循環(huán)水養(yǎng)殖桶中，每桶40尾。養(yǎng)殖試驗共設(shè)6 個處理，每處理3 重復(fù)。試驗期間每日投喂兩次（7：30和17：30），每次投喂至表觀飽食，養(yǎng)殖試驗共持續(xù)56 d。養(yǎng)殖期間，24 h持續(xù)微孔增氧，溶氧≥7.0 mg/L。試驗用水為經(jīng)充分曝氣48 h 的自來水，試驗期間每天監(jiān)測，水溫為24～28 ℃，氨氮≤0.2 mg/L，亞硝酸鹽≤0.2 mg/L，pH為7.2～7.5，光照周期為12 L∶12 D（7：30～19：30光亮）。

1.3 樣品采集與分析

56 d養(yǎng)殖試驗結(jié)束后禁食24 h，對每桶試驗魚進行稱重，統(tǒng)計每桶魚的總重和尾數(shù)，計算成活率、生長性能、飼料系數(shù)等指標(biāo)。每個組隨機選9尾魚（3尾/桶）用于體成分分析。參照AOAC（2000）中檢測方法，分析魚體、飼料組成成分[10]。通過熱干法（930.15）分析干物質(zhì)，使用Kjeldahl 法（984.13）測定粗蛋白，通過SOXTEC 脂肪分析法（920.39）測量粗脂肪含量，采用105 ℃烘干法測定各組飼料中的水分含量；550 ℃灼燒法測定各組飼料和魚體的粗灰分含量。

成活率（%）=100×試驗?zāi)┪矓?shù)/試驗初尾數(shù)

特定生長率（SGR，g/d）=100×（ln 試驗?zāi)~總重-ln試驗初魚總重）/養(yǎng)殖天數(shù)

飼料系數(shù)（FCR）=飼料消耗量（g/桶）/魚體增重量（g/桶）

每桶隨機撈取5尾魚（每組15尾）立即放入200 mg/L的MS-222 中深度麻醉處理后，稱取5 尾魚體重后用1 mL 注射器（管壁用1%肝素鈉抗凝劑潤濕）尾靜脈采集全血，血樣在4 ℃冰箱靜置2 h后，通過離心分離獲得血漿（4 000 r/min，10 min，4 ℃）。血漿在液氮速凍后-80 ℃保存，并在48 h 內(nèi)完成血漿生化測定。血漿天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、堿性磷酸酶（AKP）、白蛋白（ALB）（北京百奧泰康生物技術(shù)有限公司），球蛋白（GLB）、總膽汁酸（TBA）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）（寧波美康生物科技股份有限公司），總膽固醇（TC、KyowaMedexCo., Ltd., Tokyo），以上均由Abbott全自動血液生化分析儀（Abbott C8000，U.S.）根據(jù)制造商購買比色測試套件的說明測定。

每桶隨機選取5 尾黃顙魚，稱取每尾魚重、測量每尾魚體長，剖檢取內(nèi)臟團和肝臟、膽囊等臟器稱重，并計算臟器指數(shù)值。

肥滿度（CF，g/cm3）=100×魚體重（g）/[魚體長（cm）]3

臟體比（VSI，%）=100×（試驗?zāi)~內(nèi)臟團重/試驗?zāi)~體重）

肝體比（HSI，%）=100×（試驗?zāi)~肝重/試驗?zāi)~體重）

膽體比（GSI，%）=100×（試驗?zāi)~膽囊重/試驗?zāi)~體重）

每桶隨機取3 尾魚，采集肝臟和中腸（腸道全長的1/2處），進行組織形態(tài)病理學(xué)檢查。分離的肝臟和中腸先在0.65%生理鹽水中漂洗，快速洗去血污、糞便等雜質(zhì)后分別轉(zhuǎn)入4%多聚甲醛溶液固定后制成石蠟切片并進行H.E.組織染色，評估肝臟、腸道組織病理形態(tài)變化。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準差（Mean±SD）”表示。經(jīng)單因素方差分析（ANOVA）分析后，存在顯著差異，則進行Duncan’s 多重比較各組間的顯著性差異。采用SPSS24.0 軟件進行統(tǒng)計計算，統(tǒng)計顯著性水平設(shè)為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 白術(shù)多糖對黃顙魚生長性能和飼料利用率的影響（見表2）

由表2可知，SBM組黃顙魚末均重和SGR顯著低于其他5 組（P＜0.05），且CON、C250、C500、S250組和S500 組之間末均重和SGR 差異不顯著（P＞0.05）。SBM、S250組和S500組FCR顯著高于CON、C250組和C500組（P＜0.05），且S250組和S500組顯著低于SBM組（P＜0.05），CON、C250組和C500組間無顯著性差異（P＞0.05）。結(jié)果顯示，飼料中補充白術(shù)多糖后可以使SBM組黃顙魚的生長性能達到其他試驗組的水平。

表2 白術(shù)多糖對黃顙魚生長性能和飼料利用率的影響（n=3）

2.2 白術(shù)多糖對黃顙魚體成分的影響（見表3）

表3 白術(shù)多糖對黃顙魚體成分的影響（%，n=3）

由表3可知，各組間試驗魚的體成分沒有顯著差異（P＞0.05）。

2.3 白術(shù)多糖對黃顙魚肥滿度及臟器指數(shù)的影響（見表4）

表4 白術(shù)多糖對黃顙魚肥滿度及臟器指數(shù)的影響（n=15）

由表4可知，SBM、S250組和S500組黃顙魚的肥滿度顯著低于CON、C250、C500 組試驗魚（P＜0.05），且S500組肥滿度顯著高于SBM組（P＜0.05）。SBM組肝體比顯著高于其他5組（P＜0.05），此外C500組肝體比顯著高于CON、C250組（P＜0.05）。各組臟體比和膽體比均無顯著性差異（P＞0.05）。

2.4 白術(shù)多糖對黃顙魚血漿生化指標(biāo)的影響（見表5）

如表5所示，血漿中AST、ALT酶活性在各組間均差異不顯著（P＞0.05）。SBM 組AKP 酶活性顯著高于CON、C250、C500、S250 組和S500 組，且其他5 組之間差異不顯著（P＞0.05）。SBM、S250組和S500組黃顙魚血漿中ALB和GLB的濃度顯著低于CON、C250、C500組（P＜0.05）。CON、C250、C500 組之間ALB 和GLB 的濃度差異均不顯著（P＞0.05）。SBM、S250組和S500組之間ALB 濃度差異不顯著（P＞0.05），但SBM 組GLB的濃度顯著低于S250組和S500組，S250組和S500組之間差異不顯著（P＞0.05）。SBM組和S500組血漿TC濃度顯著低于CON、C250、C500 組，且SBM 組同S500組之間及CON、C250、C500 組TC 濃度各自差異均不顯著（P＞0.05）。SBM、S250組和S500組黃顙魚血漿中TBA 的濃度顯著高于CON、C250、C500 組（P＜0.05），且SBM 組顯著高S250 組和S500 組（P＜0.05），S250 組和S500組之間差異不顯著（P＞0.05）。SBM、S250組和S500 組黃顙魚血漿中TG 的濃度顯著低于CON、C250、C500組（P＜0.05），且SBM組顯著低于S250組和S500 組（P＜0.05），S250 組和S500 組之間差異不顯著（P＞0.05）。SBM 組HDL 的濃度顯著低于CON、C250、C500、S250組和S500組，且其他5組之間差異不顯著（P＞0.05）。SBM、S250 組和S500 組血漿LDL 濃度顯著高于CON、C250、C500 組（P＜0.05），SBM、S250 組和S500 組之間以及CON、C250、C500 組各自3 組之間LDL濃度差異均不顯著（P＞0.05）。

表5 白術(shù)多糖對黃顙魚血漿生化指標(biāo)的影響（n=3）

2.5 白術(shù)多糖對黃顙魚肝腸形態(tài)學(xué)影響（見圖1、圖2）

由圖1所示，CON、C250、C500組黃顙魚的肝組織結(jié)構(gòu)正常，肝小葉（HL）和肝竇（HS）結(jié)構(gòu)清晰完整（圖1A），視野內(nèi)肝細胞邊界清晰，呈多邊形排列緊密，細胞核位于細胞中心（圖1A）。SBM、S250 組和S500 組的肝組織結(jié)構(gòu)明顯異常，主要體現(xiàn)在肝組織空泡化明顯（圖1D），此外肝小葉和肝竇結(jié)構(gòu)模糊，難以明確辨識，視野內(nèi)肝細胞和細胞核輪廓異常，且明顯排列無序；此外，同SBM組相比，S250組和S500組中，S500組肝臟組織形態(tài)改善效果更明顯。

圖1 黃顙魚肝臟病理切片觀察（400×）

由圖2可知，CON、C250、C500組黃顙魚的中腸組織結(jié)構(gòu)正常，未觀察到明顯的組織病變，中腸腸絨毛形態(tài)規(guī)則，結(jié)構(gòu)清晰，杯狀細胞數(shù)量較多。而SBM、S250 組和S500 組的中腸組織結(jié)構(gòu)明顯異常，主要體現(xiàn)在腸絨毛空泡化明顯，炎性細胞浸潤以及絨毛長度明顯變短（圖2D）。同SBM組相比，S250組和S500組中，S500組腸組織形態(tài)改善效果更明顯。

圖2 攝食不同日糧后黃顙魚腸道病理形態(tài)圖（200×）

3 討論

在本研究中發(fā)現(xiàn)等蛋白質(zhì)豆粕替代25%魚粉后，黃顙魚的生長性能顯著降低、飼料系數(shù)顯著升高，肥滿度下降，肝體比升高，血漿生化指標(biāo)異常，肝臟和中腸組織空泡化，腸絨毛高度減小等不良影響，這和研究者在虹鱒（Oncorhynchus mykiss）[11-12]、大菱鲆（Scophthalmus maximusL.）[13]、鯽（Carassius auratusL.）[14]、草魚（Ctenopharyngodon idellus）[15]等魚類研究中的結(jié)果相一致。研究者指出，導(dǎo)致以上不良生長和生理影響的原因可能有兩個方面：一方面增加的植物蛋白源中含有較高的抗?fàn)I養(yǎng)因子，如豆粕中的胰蛋白酶抑制劑、大豆抗原蛋白以及非淀粉多糖等，這些抗?fàn)I養(yǎng)因子會作用于腸道黏膜、上皮細胞以及通過破壞消化道原有微生物穩(wěn)態(tài)，誘發(fā)消化道炎癥以及損傷，導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收能力降低和生理代謝的減弱，造成生長和生理代謝的不良影響[13]；另一方面可能是由于豆粕和魚粉相比部分營養(yǎng)素的缺失以及營養(yǎng)素的不平衡造成，尤其當(dāng)?shù)鹊鞍踪|(zhì)替代前提下的必需氨基酸平衡性問題。葉元土等[16]研究發(fā)現(xiàn)對于黃顙魚而言，豆粕和魚粉同黃顙魚體必需氨基酸相關(guān)系數(shù)分別為0.74和0.91，表明豆粕中的必需氨基酸同黃顙魚的真實生理需求存在明顯差異，必需氨基酸的缺失和不平衡勢必導(dǎo)致了黃顙魚生長性能的降低和生理代謝的異常。

白術(shù)多糖是傳統(tǒng)天然植物白術(shù)中含有的主要有效活性成分之一，醫(yī)學(xué)以及畜禽相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)白術(shù)多糖具有增強免疫、抗氧化、抗衰老、抗腫瘤的功效。如在仔豬的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)白術(shù)多糖能夠顯著提高平均日增重量，增加腸道益生菌的種類和數(shù)量，促進消化能力，改善仔豬腸道內(nèi)環(huán)境[17-19]。此外在禽類（如嶺南黃雞[20]等）研究中發(fā)現(xiàn)日糧中添加白術(shù)多糖可顯著提高其生長性能，顯著降低料重比，促進免疫器官發(fā)育。在本研究中同樣也發(fā)現(xiàn)，在豆粕飼料組中添加250 mg/kg和500 mg/kg的白術(shù)多糖能顯著提升黃顙魚的生長性能。這些研究結(jié)果提示在飼料中添加適宜劑量的白術(shù)多糖對畜禽以及魚類的生長性能具有促進功效。

白術(shù)多糖提升畜禽生長性能可能和對腸道和肝臟形態(tài)及功能的改善密切相關(guān)。白術(shù)多糖可顯著提高斷奶仔豬腸道絨毛高度，改善仔豬腸道微生態(tài)區(qū)系的多樣性，使腸道微生態(tài)趨于平衡，進而改善斷奶仔豬小腸屏障功能[17，21]。此外，王琳[22]在對育成雞的研究中也發(fā)現(xiàn)添加白術(shù)多糖能夠改善小腸的形態(tài)，顯著提高空腸的絨毛高度和絨毛高度/隱窩深度值。這些研究成果提示，白術(shù)多糖對腸道的調(diào)節(jié)作用主要集中于對腸道長度、腸絨毛高度、隱窩深度以及連接蛋白等物理屏障的保護作用，且對腸道菌群具有一定的平衡作用。動物腸道和肝臟之間功能緊密相連，共同構(gòu)成“腸-肝”軸代謝途徑，白術(shù)多糖對腸道的調(diào)節(jié)也會對肝臟產(chǎn)生影響。在本研究中同樣發(fā)現(xiàn)黃顙魚豆粕日糧組中添加白術(shù)多糖后，肝臟組織的空泡樣變損傷明顯得到改善，血漿中AST和ALT酶活性升高。研究發(fā)現(xiàn)白術(shù)多糖對脂肪肝的影響主要是通過脂肪酸運輸和載脂蛋白來實現(xiàn)，白術(shù)多糖能通過改善肝細胞脂肪變性、空泡樣變、肝組織三酰甘油和游離脂肪酸含量，提高血漿中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和天冬氨酸轉(zhuǎn)移酶的含量對單純高脂飲食誘發(fā)的非酒精性脂肪性肝炎產(chǎn)生明顯的預(yù)防作用[23-24]。此外，研究發(fā)現(xiàn)白術(shù)多糖可以減輕小鼠肝臟的炎癥損傷和氧化應(yīng)激，并在脂多糖（LPS）侵入肝臟的早期發(fā)揮保護作用[25]。

血液循環(huán)是腸肝功能緊密連接的紐帶，腸道消化轉(zhuǎn)運和吸收的營養(yǎng)物質(zhì)經(jīng)肝臟代謝合成的功能性物質(zhì)大部分要通過血液循環(huán)來轉(zhuǎn)運。醫(yī)學(xué)臨床中，血漿生化指標(biāo)通常能夠快速反映機體的臟器炎癥、損傷以及代謝異常。其中AST、ALT、AKP是臨床上用來反映肝臟損傷的常用指標(biāo)。從表5中可以看出，SBM飼料組AKP活性的均值顯著升高，提示SBM組肝臟存在一定的損傷，損傷情況在肝體比的顯著升高，以及形態(tài)學(xué)切片觀察中也得到了證實。此外血漿白蛋白和球蛋白能夠反映血液的滲透壓、機體的營養(yǎng)水平和免疫水平。研究中發(fā)現(xiàn)SBM組血漿白蛋白和球蛋白濃度均顯著低于CON、C250組和C500組，提示了SBM組黃顙魚血液滲透壓的異常、營養(yǎng)不足以及免疫水平的低下；TC、TBA、TG、HDL和LDL反映了魚體的血脂代謝情況。研究中發(fā)現(xiàn)SBM組血漿TC、TG、HDL濃度顯著低于CON、C250 組和C500 組，而TBA、LDL 濃度顯著高于CON、C250 組和C500 組，表明攝食豆粕飼料后黃顙魚血脂代謝的異常，或魚體脂肪轉(zhuǎn)運儲存發(fā)生顯著改變。研究中發(fā)現(xiàn)通過在SBM 組飼料中添加白術(shù)多糖后這些不良影響得到了明顯的改善，這可能和白術(shù)多糖對黃顙魚腸肝組織的修復(fù)，以及腸道微環(huán)境的改善有關(guān)。

以上結(jié)果均表明在黃顙魚豆粕組飼料中通過添加白術(shù)多糖來改善其不良影響是有效的。此外，研究中為了評估持續(xù)添加白術(shù)多糖的安全性，在CON 組的基礎(chǔ)上增設(shè)了C250 組和C500 組，同CON 組相比，添加白術(shù)多糖組未發(fā)現(xiàn)不良影響，表明本研究條件下黃顙魚飼料中添加500 mg/kg 白術(shù)多糖是安全的，同時也發(fā)現(xiàn)在對照組中添加250 mg/kg 和500 mg/kg 的白術(shù)多糖并未呈現(xiàn)出在豆粕組飼料中的促進生長、改善血漿生化指標(biāo)及腸肝形態(tài)功能，這可能是因為正常生理條件下白術(shù)多糖的作用主要體現(xiàn)在健康維護方面，此外還可能存在劑量效應(yīng)問題，不同日糧條件下白術(shù)多糖有效劑量和效果可能是變化的，其效果在營養(yǎng)品質(zhì)差的日糧中可以表現(xiàn)出來，而日糧營養(yǎng)品質(zhì)高的時候低劑量效果可能更好，此現(xiàn)象在畜禽研究中也已被發(fā)現(xiàn)[7]。

在當(dāng)前國家對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)全面禁抗、綠色環(huán)保的大環(huán)境下，將白術(shù)多糖開發(fā)成為有效的飼料添加劑產(chǎn)品對擴大和加深天然植物資源的應(yīng)用范圍以及實現(xiàn)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的綠色發(fā)展具有深遠的意義。然而目前白術(shù)多糖在水產(chǎn)動物中的相關(guān)研究非常匱乏，例如對不同食性魚類的最適添加量，以及最適添加量和魚類配方中核心原料組分間的相關(guān)性關(guān)系及其對魚類促生長、改善腸肝損傷、生理代謝方面的深層次作用機制仍需進一步探究。

4 結(jié)論

豆粕等蛋白替代25%魚粉，會引起黃顙魚生長性能下降、肝體指數(shù)和血漿生化指標(biāo)的異常，此外還會導(dǎo)致肝臟和中腸組織空泡化，腸絨毛高度減小等不良影響；在高豆粕飼料中添加250 mg/kg和500 mg/kg的白術(shù)多糖能明顯改善由豆粕替代魚粉造成的不良影響。在魚粉對照組飼料中添加250 mg/kg和500 mg/kg的白術(shù)多糖未發(fā)現(xiàn)不良影響。在本試驗條件下，黃顙魚最適添加含量為500 mg/kg。