■唐思宇 張麗萍 王久榮 袁紅朝 賀 珍 耿梅梅 陳 聞

（中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所重點實驗室，湖南長沙 410125）

磷是生命活動必需的基礎(chǔ)養(yǎng)分，對畜禽的生長、發(fā)育、繁殖及各種器官的修補有極重要的作用。若畜禽日糧中磷含量不足或過量，將對畜禽的健康、生長、發(fā)育、繁殖、生產(chǎn)水平及產(chǎn)品品質(zhì)造成不同程度的影響[1-8]，因此，總磷含量是評價飼料質(zhì)量的重要指標(biāo)之一。但各種飼料中總磷含量及品質(zhì)差異較大，為保證飼養(yǎng)畜禽的日糧中磷含量達(dá)到并保持一定水平，快速準(zhǔn)確檢測飼料中總磷含量非常必要[9]。目前，國內(nèi)外現(xiàn)行有效測定飼料中總磷含量的技術(shù)規(guī)范有ISO 6491—1980《動物飼料 磷總含量的測定 分光光度法》[10]、EN 15510—2007《動物飼料 用電感耦合等離子體發(fā)射光譜法（ICP-AES）測定鈣、鈉、磷、鎂、鉀、鐵、鋅、銅、錳、鈷、鉬、砷、鉛和鎘含量》[11]、GB/T 6437—2018《飼料中總磷的測定 分光光度法》[12]和DB21/T 3059—2018《飼料中銅、鋅、鐵、錳、鈣、磷、鈉、鎂、鉛、鉻、鎘和砷含量的測定電感耦合等離子體發(fā)射光譜法》[13]等。這些標(biāo)準(zhǔn)均能保證測定總磷含量結(jié)果的準(zhǔn)確性，但也存在一些不足，如分光光度法存在樣品和試劑的消耗量大、檢測流程繁瑣、耗時長、工作效率低[14-16]；電感耦合等離子體發(fā)射光譜法測定簡便，但儀器較為昂貴，且該儀器對磷元素的響應(yīng)強度較弱（磷元素的檢測波長在紫外區(qū)），普及率不高?；诶刹葼柖傻倪B續(xù)流動分析儀作為一種新型的分析手段，因其自動化程度高、分析速度快、精度高且試劑耗量少而備受環(huán)境、生態(tài)及農(nóng)業(yè)科學(xué)領(lǐng)域廣泛使用，儀器的普及率極廣。目前采用的鉬藍(lán)顯色原理的連續(xù)流動分析儀法已被廣泛應(yīng)用測定水、植物及土壤等樣品中磷含量[17-24]，但存在結(jié)果準(zhǔn)確度易受樣本基體的酸度影響，需嚴(yán)格控制試驗條件，線性范圍較窄，常常需要稀釋樣品才能檢測，這些都無形中加大了人力與物力的耗損。為了簡化飼料總磷含量檢測步驟、節(jié)省檢測成本、提高檢測效率，試驗擬將國標(biāo)GB/T 6437—2018 規(guī)定的具有線性范圍寬、允許樣本酸度范圍大的釩鉬黃比色法在連續(xù)流動分析儀上拓展。為了檢驗釩鉬黃-連續(xù)流動分析儀法測定飼料中總磷含量的科學(xué)性、正確性與可行性，通過優(yōu)化檢測波長、顯色劑用量、用酸種類等條件；考察了線性范圍、檢出限、精密度及回收率等方法參數(shù)；建立釩鉬黃-連續(xù)流動分析儀快速準(zhǔn)確測定飼料中總磷含量的方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試飼料樣品魚飼料（1 號～5 號）、鴨飼料（6 號～11號）、雞飼料（12號～17號）、豬飼料（18號～22號）由廣東某飼料企業(yè)提供，原料（23 號～24 號）及豬飼料（25號～34號）由天津某飼料企業(yè)提供，分別用自封袋密封并寫上對應(yīng)編號放入陰涼處保存，各取100 g 樣品經(jīng)粉碎后過40 目篩待測；供試質(zhì)控樣品QC[CFAPA-QC 076B-1，（0.47±0.012）%]由大連中食國實檢測技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

1.2 試驗試劑

硫酸、偏釩酸銨、四水合鉬酸銨、硝酸、高氯酸等試劑均為國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)的分析純試劑，十二烷基磺酸鈉（SDS）為Sigma-Aldrich試劑公司產(chǎn)品，總磷標(biāo)準(zhǔn)溶液[GSB 04-1741-2004（b），1 000 mg/L]為國家有色金屬及電子材料分析測試中心標(biāo)準(zhǔn)樣品，試驗用水為去離子水。

1.3 試劑配制

1.3.1 釩鉬酸銨-硝酸試劑

稱取1.25 g 偏釩酸銨，加200 mL 水加熱溶解，冷卻后，在通風(fēng)櫥內(nèi)加入250 mL硝酸；另稱取25.00 g四水合鉬酸銨，加400 mL 水加熱溶解，冷卻后將2 種溶液混合，用水定容至1 000 mL，避光保存，出現(xiàn)沉淀則不能繼續(xù)使用。

1.3.2 釩鉬酸銨-硫酸試劑

稱取2.40 g偏釩酸銨至1 000 mL燒杯中，加入約700 mL水，再緩慢加入120.0 mL硫酸，待溶液冷卻至室溫，再加入32.00 g四水合鉬酸銨，攪拌至完全溶解后，用水定容至1 000 mL，搖勻，避光保存，出現(xiàn)沉淀則不能繼續(xù)使用。

1.3.3 硫酸溶液

量取10.00 mL 硫酸加入到約800 mL 水中，再加入2.00 g 十二烷基磺酸鈉（SDS），試劑完全溶解后，用水定容至1 000 mL。

1.4 試驗儀器

連續(xù)流動分析儀（AA3，Seal Analytic，德國）；紫外可見分光光度計（UV 2600，Shimadzu，日本）；威立雅實驗室超純水機(jī)（PURELAB Classic，ELGA，英國）；電子天平（ME602，Mettler Toledo，美國）；一般試驗常用儀器和設(shè)備。

1.5 試驗條件

連續(xù)流動分析儀測量條件：清洗比設(shè)定為2（進(jìn)樣時間48 s，清洗時間24 s）；測樣速率為50 樣次/h，濾光片為410 nm。紫外可見分光光度計測量條件：10 mm光程，測定波長400 nm。

1.6 試驗原理

連續(xù)流動分析儀法和紫外可見分光光度計法的檢測原理相同：飼料樣品經(jīng)高溫消解，有機(jī)物被氧化分解，有機(jī)磷轉(zhuǎn)化為正磷酸鹽（PO43--P），再采用比色法進(jìn)行測定；結(jié)合釩鉬黃顯色原理和連續(xù)流動分析儀的儀器特性，設(shè)計試劑流路，即硫酸溶液進(jìn)入流路體系，調(diào)節(jié)顯色體系的酸度，樣品再進(jìn)入體系，隨后釩鉬酸銨顯色劑進(jìn)入體系，混合液通過37 ℃加熱池恒溫，完成顯色后，進(jìn)入檢測池，磷鉬黃絡(luò)合物在波長410 nm進(jìn)行比色測量，其試劑流路見圖1。

圖1 釩鉬黃-連續(xù)流動分析儀法測定飼料中總磷含量試劑流路

1.7 樣品前處理及數(shù)據(jù)分析

取飼料樣品1、7、13、19、24、27號各稱取7份獨立試樣，其余飼料樣品及飼料質(zhì)控樣品QC[CFAPA-QC 076B-1，（0.47±0.012）%]各稱取3份獨立試樣，按照標(biāo)準(zhǔn)GB/T 6437—2018 規(guī)定濕化法對樣品進(jìn)行前處理，并制備7個試劑空白對照。采用Excel 2010軟件對檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.8 試樣測定

1.8.1 工作曲線（見表1）按照儀器測定方法分取總磷標(biāo)準(zhǔn)溶液[GSB 04-1741-2004（b）]制備標(biāo)準(zhǔn)系列溶液；以7次空白結(jié)果的3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差為檢出限。通過調(diào)整進(jìn)樣管管徑可調(diào)整測樣檢測范圍。工作曲線及檢出限見表1。

表1 釩鉬黃-連續(xù)流動分析儀法測定飼料中磷的工作曲線及檢出限

1.8.2 測定步驟

釩鉬黃-連續(xù)流動分析儀法測定：取待測空白液、待測液適量（大于3 mL）按順序放入樣品盤中，參照儀器使用說明書，按照試劑流路（見圖1）連接管路和試劑流路，使待測指標(biāo)的響應(yīng)增益值達(dá)到分析要求，編輯測定方法、選擇合適的測樣速率、清洗比，待基線穩(wěn)定后依次測定標(biāo)準(zhǔn)系列溶液、空白液和待測液。釩鉬黃-分光光度法按照標(biāo)準(zhǔn)GB/T 6437—2018 規(guī)定進(jìn)行比色測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 波長選擇（見表2）

表2 不同波長對磷-釩鉬黃絡(luò)合物的吸收結(jié)果（Abs）

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)GB/T 6437—2018 規(guī)定比色波長為400 nm，而連續(xù)流動分析儀采用濾光片進(jìn)行檢測。通常認(rèn)為400 nm以下是紫外光分析區(qū)域，400～760 nm是可見光波長分析區(qū)域，本試驗設(shè)計在10 mm光程的紫外可見分光光度計上，對磷含量為0、1.00、2.00、5.00、10.0、15.0 mg/L 的磷-釩鉬黃絡(luò)合物在波長390、400、410、420、480、660 nm波長下進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果表明400、410、420 nm波長下零點吸收強度穩(wěn)定，其余濃度在同條件下吸收強度衰減速度較緩；可選擇410 nm或420 nm濾光片作為檢測波長，測定結(jié)果見表2。

2.2 釩鉬黃法顯色劑用量、用酸種類改良（見表3）

表3 等同儀器條件下，偏釩酸銨、酸、鉬酸銨試劑用量變化及Prime測量結(jié)果

依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)GB/T 6437—2018 釩鉬黃顯色劑配制方案，在相同儀器條件（0.32 mL/min 進(jìn)樣管，磷工作液含量為50 mg/L，增益為10，濾光片為410 nm）下，做Prime（Prime結(jié)果代表儀器響應(yīng)值，相同條件下，響應(yīng)值越高，表示該參數(shù)下儀器靈敏度越好），考察偏釩酸銨用量、酸種類、鉬酸銨用量，Prime 測定結(jié)果見表3。結(jié)合表3測量結(jié)果及顯色劑配制簡便性，確認(rèn)釩鉬黃顯色劑為序號4的配制方案，即1 000 mL顯色劑中含2.40 g偏釩酸銨、120 mL硫酸及32.00 g鉬酸銨。

2.3 樣品允許酸度（見表4）

表4 等同儀器條件下，水配制標(biāo)線測定不同酸度基體結(jié)果

鑒于飼料樣品經(jīng)硝酸-高氯酸消解趕酸后，消解液中所剩高氯酸體積不一致，導(dǎo)致上機(jī)液體的基體酸度發(fā)生變化，考察了該反應(yīng)體系對檢測樣品酸度的允許范圍。以水為基體配制0、1、5、10、50、100、120、150 mg/L標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，測定以1%、2%、4%、5%、8%及10% 高氯酸溶液為基體制備的磷含量為5 mg/L的待測溶液。測定結(jié)果顯示在高氯酸含量不大于10%時，測定結(jié)果的相對偏差小于2%，表明該方法允許樣品酸度基體范圍較寬，在酸度基體不一致情況下，測定結(jié)果穩(wěn)定準(zhǔn)確，結(jié)果見表4。

2.4 精密度試驗結(jié)果（見表5）

表5 釩鉬酸銨-連續(xù)流動分析儀法精密度結(jié)果

隨機(jī)選擇6個試樣待測原液[包括：1個魚飼料樣品（1 號）、1 個鴨飼料樣品（7 號）、1 個雞飼料樣品（13 號）、2個豬飼料樣品（19號、27號）、1個原料樣品（24 號）]，采用連續(xù)流動分析儀對同一樣品重復(fù)測定6 次，結(jié)果見表5，變異系數(shù)為0.14%～0.85%，均小于1%，表明儀器精密度良好。

2.5 回收率試驗結(jié)果（見表6）

選擇6個試樣（1號樣、7號樣、13號樣、19號樣、24號樣、27號樣）各稱取3份獨立試樣進(jìn)行前處理，做加標(biāo)回收試驗。鑒于本試驗采用的是標(biāo)準(zhǔn)GB/T 6437—2018規(guī)定的濕法前處理方法，為經(jīng)典前處理方法，因而本方法主要考察儀器回收率。每個樣品稀釋5倍，并同時制備4份，其中3份分別加入低（20 mg/L）、中（40 mg/L）、高（80 mg/L）3個濃度水平的磷標(biāo)準(zhǔn)溶液；制備好的加標(biāo)待測液同時經(jīng)連續(xù)流動分析儀測量。由于樣品制備過程為稀釋后定容，體積相同，則加標(biāo)后測定值減去待測液測定值，其差值同加入值之比即為樣品加標(biāo)回收率。由表6 可知，釩鉬黃-連續(xù)流動分析儀法測定飼料樣品中磷含量回收率為96.4%～101.5%，結(jié)果滿足標(biāo)準(zhǔn)GB/T 27417—2017《合格評定化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗證指南》[25]中濃度含量水平＞100 mg/kg，回收率范圍為95%～105%的要求。

表6 釩鉬黃-連續(xù)流動分析儀法回收率試驗結(jié)果

2.6 準(zhǔn)確度試驗結(jié)果（見表7）

按照標(biāo)準(zhǔn)GB/T 6437—2018 規(guī)定前處理步驟消解34 個實際飼料樣品及質(zhì)控樣品QC[CFAPA-QC 076B-1，（0.47±0.012）%]，每個樣品重復(fù)制備3份獨立試樣進(jìn)行檢測，并計算試樣中總磷含量，采用Excel 2010 軟件分析分光光度計法和連續(xù)流動分析儀法這兩種方法檢測結(jié)果的絕對誤差和相對誤差，來衡量連續(xù)流動分析儀的準(zhǔn)確度（絕對誤差=│連續(xù)流動分析儀檢測結(jié)果-分光光度計檢測結(jié)果│，相對誤差（%）=絕對誤差/分光光度計檢測結(jié)果×100），2 種儀器測定結(jié)果的重現(xiàn)性均小于5%，絕對誤差范圍為0～0.090%，相對誤差在5%以內(nèi)，質(zhì)控樣品總磷含量均在參考范圍內(nèi)，結(jié)果見表7。利用Excel 2010 中COVARIANCE.P 函數(shù)對表7中檢測結(jié)果進(jìn)行方差法檢驗得到P=0.57；t-test 函數(shù)對表7 中檢測結(jié)果進(jìn)行t檢驗得到P=0.88；P＞0.05，表明這兩種方法無顯著差異，釩鉬黃-連續(xù)流動分析儀法可應(yīng)用于飼料樣品中總磷含量的檢測。

3 討論

3.1 兩種方法比較

在實際操作過程中，國標(biāo)方法GB/T 6437—2018中顯色劑采用硝酸作為酸化劑，而硝酸具有揮發(fā)性，對人體有傷害，必須在通風(fēng)櫥內(nèi)操作；偏釩酸銨與鉬酸銨必須分開配制，且在完全溶解后，才可混合，否則會導(dǎo)致試劑短時間內(nèi)極難完全溶解，配制1 000 mL顯色劑至少需2 h；按照標(biāo)準(zhǔn)GB/T 6437—2018中顯色劑用量，1 000 mL 顯色劑僅可檢測100 樣次，消耗試劑量大。本試驗將顯色劑中酸改為等當(dāng)量酸度的硫酸時，硫酸為難揮發(fā)性酸，可在常規(guī)實驗室內(nèi)配制試劑，將偏釩酸銨、水、硫酸及鉬酸銨試劑依次加入同一容器配制（無需分開配制），簡化了顯色劑配制步驟，配制1 000 mL 顯色劑僅需15～30 min，而1 000 mL顯色劑可檢測1 200 樣次，試劑的使用效率提高了12 倍。國標(biāo)方法檢測需要人工逐個檢測，平均測樣速率為30 樣次/h；連續(xù)流動分析儀法檢測實現(xiàn)自動化進(jìn)樣、在線檢測，無需人工值守，平均測樣速率50 樣次/h，極大提高了檢測效率，降低了人力成本，實用性高。

釩鉬黃-連續(xù)流動分析儀法與標(biāo)準(zhǔn)GB/T 6437—2018分光光度法檢測原理相同。由表1可知，連續(xù)流動分析儀法測定飼料磷含量的線性范圍0～150 mg/L，較國標(biāo)方法0～15 mg/L提高了10倍，消解液可直接檢測，節(jié)省了前期樣品準(zhǔn)備的人工成本，避免了分光光度法人工逐個取樣、顯色、搖勻、稀釋等繁瑣步驟，簡化了試驗流程，提高了檢測效率。且可根據(jù)樣品含量調(diào)整線性范圍，對于低含量樣品也可準(zhǔn)確測定；基于連續(xù)流動分析儀具有自動化程度高、連續(xù)流進(jìn)樣及在線恒溫顯色測量等特點，待測樣品與標(biāo)準(zhǔn)系列樣品的進(jìn)樣體積、顯色條件、檢測條件幾乎一致，不受外界環(huán)境影響，使得檢測結(jié)果更加穩(wěn)定可靠。由表5、表6 結(jié)果可知，連續(xù)流動分析儀法檢測飼料中總磷含量精密度（RSD%＜1%）與準(zhǔn)確度（回收率介于96.4%～101.5%）良好；由表7 可知，連續(xù)流動分析儀法與國標(biāo)法測量結(jié)果無顯著差異，釩鉬黃-連續(xù)流動分析儀法應(yīng)用于飼料中總磷含量的測定是可行的，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

表7 連續(xù)流動分析儀與紫外可見分光光度計測定飼料中總磷含量結(jié)果比對(%)

3.2 連續(xù)流動分析儀檢測總磷的注意事項

使用連續(xù)流動分析樣品時，試劑流路管道長，存在流體阻力，會造成流速阻滯，儀器基線抖動，因此配制試劑時，潤滑劑（SDS）一定要加足量且全部溶解，且含有潤滑劑的溶液需保證使用期間澄清透亮，以保證儀器管路順滑、基線平穩(wěn)，檢測數(shù)據(jù)結(jié)果準(zhǔn)確[26]。在編輯運行文件時，要選擇合適清洗比，使儀器帶過（Carryover）小于2%，以避免樣品間相互干擾；每10 樣次插入一個基線校正，每20 樣次插入一個漂移杯，以校正測量過程中儀器與試劑的漂移變化[27]。在樣品測試期間，雖然釩鉬黃比色法允許樣品酸度范圍大，建議標(biāo)準(zhǔn)溶液配制基體與樣品基體盡量一致，保證標(biāo)準(zhǔn)曲線與樣品顯色條件一致，使測量結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。

4 結(jié)論

研究結(jié)果表明，釩鉬黃-連續(xù)流動分析儀法測定飼料中總磷含量的線性良好（線性范圍0～150 mg/L，可直接檢測大部分飼料消解液，提高了檢測效率），R2＞0.999，檢出限不大于0.035 mg/L；變異系數(shù)＜1%，回收率介于96.4%～101.5%，采用t-test檢驗分析連續(xù)流動分析儀法和分光光度法測量34個實際飼料樣品的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)這兩種方法測量飼料總磷含量無顯著差異，表明釩鉬黃-連續(xù)流動分析儀法用于飼料樣品中總磷含量測定是可行的，并能夠滿足飼料中總磷含量檢測的質(zhì)量要求。釩鉬黃-連續(xù)流動分析儀測定飼料中總磷含量的方法，具有自動化程度高、分析速度快、顯色條件穩(wěn)定、操作簡便、精密度高、準(zhǔn)確可靠、試劑消耗量少及對環(huán)境友好等特點，對快速準(zhǔn)確檢測飼料總磷含量有重大的實際應(yīng)用意義，也可借鑒用于植物樣品總磷含量的檢測。