童世鋒，任智彬，林斐，葛雨竹，陶景麗，劉楊

二花臉公豬不同耐凍性精子的蛋白質(zhì)組學(xué)分析

1南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院動(dòng)物遺傳育種系，南京 210095；2江蘇省常熟市牧工商有限公司，江蘇常熟 215500

【目的】二花臉豬是我國優(yōu)良的地方豬種之一，冷凍精液可提高二花臉公豬的利用率，并加強(qiáng)其種質(zhì)資源保護(hù)，但目前生產(chǎn)的二花臉豬冷凍精液基本不能滿足生產(chǎn)需要。研究通過分析二花臉公豬不同耐凍性精子的蛋白質(zhì)組學(xué)，以促進(jìn)二花臉公豬精子耐凍性蛋白質(zhì)標(biāo)志物的篩選，從遺傳水平分析精子耐凍性的影響因素，為提高精子耐凍性提供參考依據(jù)。【方法】通過凍存14頭二花臉種公豬的精液，再對冷凍精液的凍后質(zhì)量進(jìn)行分析，根據(jù)精子凍后活率和凍后活力的高低篩選出耐凍性好和差（good freezability ejaculates, GFE和poor freezability ejaculates, PFE）的公豬各3頭，利用串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)記(tandem mass tag, TMT)技術(shù)對GFE組和PFE組的精子蛋白進(jìn)行定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析，鑒定出GFE組和PFE組精子中的差異蛋白(differentially abundant proteins, DAPs)。利用GO富集分析對差異蛋白的功能進(jìn)行注釋，利用 KEGG富集分析對差異蛋白的生物通路進(jìn)行注釋，通過STRING蛋白質(zhì)互作數(shù)據(jù)庫進(jìn)行差異蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)分析并利用Cytoscape軟件構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)?！窘Y(jié)果】研究發(fā)現(xiàn)GFE組和PFE組間共存在138個(gè)差異蛋白，PFE組與GFE組相比,有109個(gè)DAPs上調(diào)，29個(gè)DAPs下調(diào)。GO富集分析表明，共124個(gè)DAPs富集到47個(gè)GO term，主要富集到“細(xì)胞進(jìn)程”“單有機(jī)體過程”“分子結(jié)合”“細(xì)胞”“細(xì)胞組分”等GO term。KEGG富集分析表明，DAPs主要富集到“腎素-血管緊張素系統(tǒng)”“補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)”“血小板活化”等通路。從PPI網(wǎng)絡(luò)可見53個(gè)節(jié)點(diǎn)和69 條連接邊線，有8個(gè)具有強(qiáng)互作關(guān)系的蛋白ALB、ACRBP、ACR、ZAN、ZPBP2、HSPA5、FGB、FGG，這些蛋白質(zhì)的功能主要富集于“單受精”“有性生殖”“精細(xì)胞發(fā)育”等與動(dòng)物生殖生理以及精子發(fā)生密切相關(guān)的功能。進(jìn)一步分析表明，GFE組和PFE組間的DAPs主要包括氧化還原相關(guān)蛋白（GSTM3、PRDX5、ALB、PDIA1、PDIA4等）、精子發(fā)生與功能相關(guān)蛋白（HSPA5、MFGE8、DNAH1、DNAH7、CUL3等）、能量相關(guān)蛋白（HK1、PGM1等）以及凋亡與炎癥相關(guān)蛋白（THBS1、ELSPBP1、CP等）；PPI網(wǎng)絡(luò)圖分析可知3個(gè)DAPs（MME、ANPEP和PRCP）在腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）中相互作用?！窘Y(jié)論】二花臉公豬不同耐凍性精子的蛋白質(zhì)組分存在明顯差異，可能對精子的冷凍性能產(chǎn)生影響，這些DAPs可作為精子耐凍性的候選蛋白標(biāo)志物。

二花臉公豬；精子耐凍性；TMT；差異蛋白

0 引言

【研究意義】二花臉豬是我國的著名優(yōu)良地方豬種之一，其以高繁殖力聞名于世，經(jīng)產(chǎn)母豬窩均總仔數(shù)高達(dá)15.93頭，窩產(chǎn)活仔數(shù)可達(dá)14頭以上，加強(qiáng)二花臉豬的保護(hù)和利用有利于我國豬業(yè)和種業(yè)的發(fā)展[1]。精液冷凍保存可以擴(kuò)大二花臉公豬精液使用的時(shí)間和空間范圍，能提高二花臉公豬的利用率，加快品種改良，更有利于種質(zhì)資源保護(hù)[2]。但因豬的精子質(zhì)膜結(jié)構(gòu)組成（磷脂和膽固醇比例及磷脂和蛋白質(zhì)比例）較其他物種的差異性，導(dǎo)致豬精子冷凍過程中對冷應(yīng)激的敏感度更強(qiáng)，低溫更易對豬精子造成不可逆的損傷，致使精子凍后活力低、受精率低[3]。因此，提高豬冷凍精液的凍后質(zhì)量對二花臉公豬發(fā)揮其良種優(yōu)勢具有十分重要的意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】為了提高豬凍精的凍后質(zhì)量，先前研究多集中在豬精液冷凍程序及冷凍稀釋液的改良上，但近年來未取得突破性進(jìn)展。早已有研究表明，精液的凍后質(zhì)量存在個(gè)體差異[4]。因此，根據(jù)個(gè)體差異鑒定精子耐凍性的遺傳標(biāo)記，用于在凍前預(yù)測精子的耐凍性，為提高公豬冷凍精液的凍后質(zhì)量提供了另一思路。近年來越來越多研究利用組學(xué)技術(shù)從不同水平分析不同耐凍性公豬精子的遺傳差異，主要包括DNA水平[5]和RNA水平[6-7]，這些遺傳差異都會(huì)對精子的耐凍性產(chǎn)生不同程度的影響，是預(yù)測精子耐凍性的良好標(biāo)志物。此外，在不同耐凍性的公豬精子中也發(fā)現(xiàn)了許多蛋白質(zhì)差異，如 HSP90AA1[8]、AQP3、AQP7[9]、GSTM3[10]以及部分精子質(zhì)膜蛋白[11]都被鑒定為預(yù)測精子耐凍性的蛋白質(zhì)標(biāo)志物?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)能夠更全面、更深入地分析蛋白質(zhì)的特征，已在揭示動(dòng)植物生命規(guī)律的研究中得到廣泛應(yīng)用[12-13]。但目前少有研究從蛋白質(zhì)組學(xué)水平上系統(tǒng)分析不同耐凍性公豬精子的遺傳差異。利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究公牛精子的蛋白質(zhì)組分與精子冷凍性能的關(guān)系，表明不同耐凍性公牛精子中存在大量DAPs，這些DAPs與精子的冷凍性能相關(guān)聯(lián)，且部分DAPs可作為預(yù)測精子耐凍性的標(biāo)志物[14]。因此，利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對不同耐凍性公豬精子的全蛋白質(zhì)組分進(jìn)行比較分析，篩選出關(guān)鍵差異蛋白，這對研究公豬精子蛋白質(zhì)組與精子冷凍性能的相關(guān)關(guān)系具有十分重要的意義。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究擬首次利用TMT技術(shù)分析二花臉公豬不同耐凍性精子的蛋白質(zhì)組學(xué)，從蛋白質(zhì)水平分析不同耐凍性精子的遺傳差異，為鑒定出預(yù)測精子耐凍性的蛋白質(zhì)標(biāo)志物提供科學(xué)依據(jù)，從遺傳水平分析影響二花臉公豬精液凍后質(zhì)量的關(guān)鍵因子。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2020年9月至2021年8月在江蘇省常熟市牧工商有限公司和南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心完成。

1.1 試驗(yàn)材料

研究所用精液采自江蘇省常熟市牧工商有限公司的14頭二花臉種公豬，所有公豬在同一環(huán)境條件下飼養(yǎng)管理，均已達(dá)體成熟年齡。

1.2 精液的采集與檢測

采用手握法對二花臉公豬進(jìn)行精液采集，采集的精液與37℃預(yù)熱的原精稀釋劑按照1﹕1的體積比混勻，混勻后置于17℃恒溫箱中在2 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。到達(dá)實(shí)驗(yàn)室后，對精子活力和畸形率進(jìn)行檢測，將活力大于75%，畸形率小于15%的精液用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.3 精液的凍存與解凍

按照商業(yè)凍精生產(chǎn)試劑套裝（北京田園奧瑞生物科技有限公司）的使用說明進(jìn)行精液的凍存。精液用試劑盒處理完成后，灌裝至0.5 mL凍精細(xì)管，隨即放入程序冷凍儀（Ice Cube）中進(jìn)行冷凍，冷凍程序見表1。最后將凍精細(xì)管放入液氮中凍存。

表 1 程序冷凍儀的（Ice Cube）0.5 mL細(xì)管冷凍程序

解凍時(shí)，將每個(gè)樣本取3根細(xì)管在60℃解凍12 s，精液與解凍液按照1﹕9的體積比稀釋，在30℃的條件下孵育20 min后，對精子的質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估。

1.4 精液質(zhì)量評(píng)估

通過計(jì)算機(jī)輔助精液分析(computer-assisted sperm analysis, CASA )系統(tǒng)對精子的運(yùn)動(dòng)特性進(jìn)行測定，本研究中主要記錄精子的活率（motility，MOT）和活力（progressive motility，PMOT）進(jìn)行后續(xù)分析，選擇凍后活率和活力最高和最低的3頭公豬精液分別設(shè)置為GFE組和PFE組。精子質(zhì)膜完整性（plasma membrane integrity，PMI）通過精子尾部低滲腫脹法（hypo-osmotic Swelling Test，HOST）進(jìn)行檢測[15]。按照線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1；索萊寶生物科技有限公司）的使用說明對精子的線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）進(jìn)行檢測。

1.5 精子蛋白質(zhì)組學(xué)分析

采用TMT定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對精子蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行分析[16]。主要步驟為蛋白質(zhì)的提取和酶解、TMT標(biāo)記、高PH 反相分離、nano-HPLC-MS/MS分析，最后進(jìn)行數(shù)據(jù)庫搜索。本研究采用Ensembl數(shù)據(jù)庫（Sus scrofa 11.1）進(jìn)行搜索，肽段經(jīng)過1% FDR和1 unique peptide質(zhì)控過濾，篩選差異倍數(shù)1.2倍以上，F(xiàn)DR≤0.05的蛋白質(zhì)作為DAPs。

1.6 生物信息學(xué)分析

通過GO數(shù)據(jù)庫(http://www.geneontology.org/)對DAPs進(jìn)行GO富集，通過KEGG數(shù)據(jù)庫（Kanehisa，2008）對DAPs的生物通路（Pathway）進(jìn)行注釋，以FDR≤0.05為閾值，滿足此條件的GO term/pathway定義為在DAPs中顯著富集的GO term/pathway。利用STRING蛋白質(zhì)互作數(shù)據(jù)庫(http://string-db.org)進(jìn)行DAPs的互作網(wǎng)絡(luò)分析并利用Cytoscape軟件構(gòu)建互作關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖。

1.7 數(shù)據(jù)分析

統(tǒng)計(jì)分析主要采用SPSS Statistics 20軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或單因素方差分析。＜0.05被認(rèn)為存在顯著差異，結(jié)果用Mean±SEM表示。

2 結(jié)果

2.1 二花臉公豬精子耐凍性的個(gè)體差異

通過對14頭公豬冷凍精液解凍后的活率和活力進(jìn)行對比分析，選擇凍后活率、活力最高和最低的3頭分別設(shè)置為GFE組和PFE組。如圖 1所示，GFE組和PFE組的凍前活率和活力不存在顯著差異（＞0.05），但GFE組的凍后活率和活力顯著高于PFE組（＜0.001）。此外，通過對解凍后精子的質(zhì)膜完整性和線粒體膜電位進(jìn)行對比分析，發(fā)現(xiàn)兩者在GFE組和PFE組中均存在顯著差異（＜0.01），進(jìn)一步證實(shí)GFE組和PFE組精子的凍后質(zhì)量存在顯著差異。

A：精子凍前活率（P-F MOT）,凍后活率差異（F-T MOT）；B：精子凍前活力（P-F PMOT）,凍后活力（F-T PMOT）差異；C：精子凍后質(zhì)膜完整性（PMI）差異；D：精子凍后線粒體膜電位（MMP）差異。數(shù)據(jù)以Mean±SEM表示（n=3），***代表p＜0.001,**代表p＜0.01

2.2 精子蛋白質(zhì)的鑒定與分析

通過TMT蛋白質(zhì)組學(xué)分析，對檢測的肽段結(jié)果進(jìn)行質(zhì)控過濾，在GFE組和PFE組精子蛋白質(zhì)中共鑒定出3 767種蛋白質(zhì)（FDR≤1%，unique petide≥1, 圖2-A）?；贕FE組和PFE組精子蛋白質(zhì)表達(dá)量信息，進(jìn)行主成分分析（principal component analysis, PCA），GFE組和PFE組蛋白質(zhì)被分成兩個(gè)不同的簇（圖2-B），這表明兩個(gè)比較組間蛋白質(zhì)豐度存在差異。在鑒定出的蛋白質(zhì)中，共篩選出138個(gè)DAPs（差異倍數(shù)≥1.2，F(xiàn)DR≤0.05），與GFE組相比，PFE組有109個(gè)DAPs顯著上調(diào)，29個(gè)DAPs顯著下調(diào)（圖 2-C，D）。

A：總蛋白及肽段鑒定結(jié)果；B：GFE組和PFE組PCA分析結(jié)果（橙點(diǎn)代表GFE，藍(lán)點(diǎn)代表PFE）；C和D：差異蛋白鑒定結(jié)果（C：紅色柱子代表上調(diào)蛋白，藍(lán)色柱子代表下調(diào)蛋白；D：紅點(diǎn)代表上調(diào)蛋白，藍(lán)點(diǎn)代表無差異蛋白，橙點(diǎn)代表下調(diào)蛋白）

2.3 DAPs的功能注釋

通過對DAPs進(jìn)行 GO富集分析，結(jié)果表明，共124個(gè)DAPs富集到47個(gè)GO term，在生物進(jìn)程（BP）方面，主要富集到“cellular process” “single-organism process”“metabolic process”“biological regulation”“regulation of biological process”等 GO term；在分子功能（MF）方面，主要富集到“binding”“catalytic activity”等 GO term；在細(xì)胞成分（CC）方面，主要富集到“cell”“cell part”“organelle”“membrane”“extracellular region”等GO term。前20個(gè)GO term如圖3-A。

通過對DAPs進(jìn)行 KEGG富集分析，結(jié)果表明，DAPs主要富集到“Renin-angiotensin system” “Complement and coagulation cascades”“Platelet activation”等pathway（圖3-B）。

2.4 DAPs的互作網(wǎng)絡(luò)分析

通過對DAPs的string分析，并利用Cytoscape 7.1軟件構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（圖 4-A），可以更加清晰的闡明DAPs之間的相互作用。PPI網(wǎng)絡(luò)中共有53 nodes和69 edges。其中有8個(gè)具有強(qiáng)互作關(guān)系的蛋白ALB、ACRBP、ACR、ZAN、ZPBP2、HSPA5、FGB、FGG。此外，通過MCODE插件檢測PPI網(wǎng)絡(luò)中的重疊子網(wǎng)，發(fā)現(xiàn)4個(gè)主要的重疊子網(wǎng)。重疊子網(wǎng)（圖4-B）中的蛋白質(zhì)ACRBP、ELSPBP1、ZAN、ZPBP和ACR主要富集于single fertilization、sexual reproduction、spermatid development等與動(dòng)物生殖生理以及精子發(fā)生密切相關(guān)的功能。其中一個(gè)重疊子網(wǎng)（圖4-C）的FGA、FGB、FGG則富集于補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)中相互作用，另一重疊子網(wǎng)（圖4-D）的PRCP、ANPEP、MME在腎素-血管緊張素系統(tǒng)通路中相互作用。

3 討論

鑒于二花臉豬的優(yōu)良特性以及加強(qiáng)種業(yè)資源保護(hù)與利用等方面的需要，提高二花臉豬冷凍精液的質(zhì)量具有十分重大的意義。不同耐凍性的豬精子間存在遺傳差異，且無論從基因、轉(zhuǎn)錄本，還是蛋白質(zhì)的角度，越來越多的精子耐凍性標(biāo)志物被發(fā)現(xiàn)[5-11]。蛋白質(zhì)作為生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者，蛋白質(zhì)的差異能夠產(chǎn)生最直接的影響。因此，為篩選出影響二花臉公豬精子耐凍性的關(guān)鍵蛋白質(zhì)，對不同耐凍性的精子蛋白質(zhì)組進(jìn)行了比較分析，結(jié)果共檢測到3 767個(gè)蛋白質(zhì)，其中138個(gè)DAPs符合篩選標(biāo)準(zhǔn)，相較于GFE組，109個(gè)DAPs在PFF組中表達(dá)上調(diào)，29個(gè)DAPs在PFF組中表達(dá)下調(diào)。

3.1 公豬精子耐凍性與氧化還原蛋白的相關(guān)性

研究結(jié)果中大量氧化還原蛋白在兩組間表達(dá)差異顯著。豬精液冷凍過程中發(fā)生的氧化還原反應(yīng)容易引起精液中活性氧（ROS）的動(dòng)態(tài)平衡被打破，且由于豬精子質(zhì)膜上多不飽和脂肪酸的含量高于其他物種，導(dǎo)致豬精子質(zhì)膜更容易受到ROS的攻擊而引發(fā)氧化損傷[2,17]。因此冷凍過程中的氧化還原反應(yīng)對精子的凍后質(zhì)量具有重要影響。GSTM3是一種重要的抗氧化酶，參與細(xì)胞的保護(hù)使其免受氧化應(yīng)激的損傷，提高精子的功能和受精能力。近期研究表明GSTs與哺乳動(dòng)物精子線粒體功能、質(zhì)膜穩(wěn)定性密切相關(guān)，并維持精子內(nèi)的ROS平衡，調(diào)節(jié)線粒體Ca2+的動(dòng)態(tài)平衡，從而維持精子的活力[18]。與LLAVANERA等[10]的研究結(jié)果一致，GSTM3在低耐凍性的皮特蘭公豬精子中表達(dá)顯著上調(diào)，且GSTM3被認(rèn)為可作為精子耐凍性的蛋白標(biāo)志物。PRDX5也是一種細(xì)胞保護(hù)性抗氧化酶，和GSTM3一樣在PFE組精子呈現(xiàn)高表達(dá)，PRDX5可抵御內(nèi)源性或外源性過氧化物攻擊，在精子中保護(hù)精子免受ROS誘導(dǎo)的氧化損傷，分析牛精清蛋白對精子凍后活力的影響也表明PRDX5與精子凍后活力呈負(fù)相關(guān)[19]。對于抗氧化蛋白在低耐凍性精子中高表達(dá)的原因，有推測說抗氧化蛋白過高表達(dá)是ROS釋放增加的反應(yīng)，過高的ROS水平對精子產(chǎn)生氧化損傷，又或說精子過高的抗氧化蛋白導(dǎo)致ROS濃度低于正常水平，而正常濃度的ROS是啟動(dòng)獲能和頂體反應(yīng)所必需的[19-20]。

此外，部分在GFE組高表達(dá)的抗氧化蛋白可以在精子的冷凍過程中發(fā)揮對精子的保護(hù)作用，正如先前的研究中表明，HSP90是一種普遍存在的分子伴侶，可抵抗細(xì)胞的氧化應(yīng)激和凋亡，其在高耐凍性精子的表達(dá)顯著高于低耐凍性精子，保護(hù)精子在冷凍過程中免受ROS的損傷[21]。在筆者的研究中也發(fā)現(xiàn)了大量相關(guān)蛋白（ALB、PDIA1、PDIA4等）。ALB具有抗氧化性，可以結(jié)合包括自由基在內(nèi)的多種配體，保護(hù)精子免受脂質(zhì)過氧化，其含量可以作為精子內(nèi)的抗氧化指標(biāo)，在研究公牛精子及精漿蛋白質(zhì)的抗氧化性中被廣泛論證[22]。PDI家族蛋白（PDIA1、PDIA4）作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的氧化還原折疊催化劑，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)折疊過程中催化硫醇氧化、還原或異構(gòu)化，通過協(xié)調(diào)細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)調(diào)節(jié)生理和病理效應(yīng)[23]。綜上所述，氧化還原相關(guān)蛋白在精子的冷凍過程中可能發(fā)揮重要作用，但其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

A：GO富集分析前20 GO term結(jié)果（Y軸：GO term，X軸：蛋白占比，顏色變化代表q值）；B：KEGG富集分析前20 pathway結(jié)果（Y軸：通路名稱，X軸：富集指數(shù)，圓圈大小代表蛋白數(shù)量，顏色變化代表q值）

A：所有DAPs的string分析的PPI網(wǎng)絡(luò)圖（藍(lán)色圓圈代表下調(diào)蛋白，紅色圓圈代表上調(diào)蛋白，圓圈大小代表互作級(jí)別，線條顏色蛋白互作強(qiáng)弱）；B、C和D：PPI網(wǎng)絡(luò)中的重疊子網(wǎng)（藍(lán)色圓圈代表下調(diào)蛋白，紅色圓圈代表上調(diào)蛋白）

3.2 公豬精子耐凍性與精子發(fā)生和功能蛋白的相關(guān)性

本研究中，還分析得到大量與精子發(fā)生和功能相關(guān)的蛋白質(zhì)存在差異。GFE組中高表達(dá)的HSPA5是HSP70家族的成員之一，具有調(diào)節(jié)精子活力和凋亡的作用，在德州驢的GFE組精清中也發(fā)現(xiàn)其高表達(dá)[24]。HSPA5的表達(dá)差異與先前研究中HSP90AA1[8]和HSP90[21]分別在不同耐凍性的公豬和公牛精子中表達(dá)一致，且HSP90AA1和HSP90被認(rèn)為可作為預(yù)測精子耐凍性的標(biāo)志物。MFGE8在促進(jìn)精子與卵子透明帶的黏附中發(fā)揮關(guān)鍵作用，已有研究表明MFGE8對豬精子的冷凍保存產(chǎn)生負(fù)面影響，其推測MFGE8在射精過程中與精子結(jié)合，冷凍過程中精子長期暴露于MFGE8中，而MFGE8與其他蛋白相互作用對精子產(chǎn)生毒害作用，從而使精子的活力降低[11]。筆者的研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)MFGE8在PFE中表達(dá)上調(diào)。此外還有大量與精子頂體反應(yīng)、透明帶結(jié)合等受精相關(guān)的蛋白（ACR、ZAN、ZPBP等）在PFE組中的表達(dá)較GFE組上調(diào)，但當(dāng)前尚未有研究闡述這些蛋白與精子冷凍性能的關(guān)系。

研究表明DNAH1的基因突變是引起精子鞭毛異常的主導(dǎo)遺傳因素，由DNAH1突變引起的鞭毛異常的發(fā)生率為24.6%，小鼠的同源DNAH1基因純合敲除，精子速度和活力顯著降低，導(dǎo)致不育癥[25]。鞭毛與精子運(yùn)動(dòng)和結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，精子的活力高低依賴于鞭毛的結(jié)構(gòu)完整性，在精子獲能過程中，精子會(huì)產(chǎn)生不對稱的鞭毛跳動(dòng)，稱為過度活化，是獲能的一個(gè)重要環(huán)節(jié)[26]。PFE組中高表達(dá)的DNAH1可能對鞭毛的運(yùn)動(dòng)功能有促進(jìn)作用，容易促使精子發(fā)生過度活化，從而引起精子在冷凍過程中過早獲能，過早獲能的精子對冷凍損傷的敏感性增強(qiáng)，從而引起精子的凍后活力下降[27]。除了DNAH1，還鑒定到與精子鞭毛相關(guān)的DNAH7和CUL3在PFE中的表達(dá)也顯著高于GFE組。

3.3 公豬精子耐凍性與能量蛋白的相關(guān)性

研究中還發(fā)現(xiàn)部分能量相關(guān)的蛋白質(zhì)在PFE組精子中的表達(dá)高于GFE組。Pedrosa等[7]同樣發(fā)現(xiàn)豬精子和精漿中能量相關(guān)的miRNA在耐凍性差的精子和精漿中高表達(dá)，可見能量相關(guān)蛋白可能與精子耐凍性相互關(guān)聯(lián)。在精子中，糖酵解是精子中產(chǎn)生ATP的主要代謝途徑之一，ATP是維持精子活力和精子獲能所必需的能量來源，當(dāng)精子中缺失糖酵解的相關(guān)酶，會(huì)明顯影響精子的超激活運(yùn)動(dòng)并引起多種信號(hào)和代謝缺陷，這些缺陷可能是導(dǎo)致雄性不育的原因[28]。本研究PFE組高表達(dá)的HK1、PGM1是糖酵解相關(guān)蛋白，且HK1為糖酵解的關(guān)鍵酶，兩者高表達(dá)可能促進(jìn)ATP的過量產(chǎn)生，使精子在凍融過程中或凍融后提前獲能，最終導(dǎo)致精子死亡，這與VILAGRAN等[29]的研究結(jié)果相似，其確定在PFE中高表達(dá)的TPI是糖酵解途徑中的一種酶，可作為預(yù)測精子耐凍性的指標(biāo)。

3.4 公豬精子耐凍性與炎癥和凋亡蛋白的相關(guān)性

Fraser等[6]在不同耐凍性豬精子RNA-Seq轉(zhuǎn)錄組分析中發(fā)現(xiàn)，許多與炎癥和凋亡相關(guān)的基因在低耐凍性豬精子中表達(dá)顯著上調(diào)，這些基因的表達(dá)與精子的耐凍力呈負(fù)相關(guān)，可能觸發(fā)精子在冷凍過程中的凋亡樣變化機(jī)制，導(dǎo)致冷凍損傷的增加。筆者的研究結(jié)果中也觀察到了這一現(xiàn)象，THBS1、ELSPBP1和CP等與凋亡和炎癥相關(guān)的蛋白在PFE組中的表達(dá)顯著上調(diào)。研究表明THBS1以劑量依賴的方式直接誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞凋亡，其可能是原始生殖細(xì)胞（PGCs）中的促凋亡因子[30]。且THBS1的功能富集于MAPK通路的激活（GO:0000187），MAPK通路可調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和凋亡，此外MAPK通路的激活還與精子中酪氨酸磷酸化水平的增加有關(guān)，冷凍過程中精子蛋白磷酸化與豬精子獲能樣變化有關(guān)，這些都有可能導(dǎo)致精子凍后活力的降低[6]。ELSPBP1在附睪頭部和附睪體高表達(dá)，與公牛的生育能力呈負(fù)相關(guān)，研究表明ELSPBP1可能作為附睪液中促凋亡配體的下游成分，而具有與死亡精子結(jié)合的特異性[31]。CP則是一種炎癥相關(guān)蛋白，在炎癥、感染和創(chuàng)傷期間的血清濃度升高，且炎癥可以導(dǎo)致肝臟CP mRNA的含量迅速增加[32]。

3.5 公豬精子耐凍性與腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）通路蛋白的相關(guān)性

通過蛋白STRING分析，PPI網(wǎng)絡(luò)中一個(gè)重疊子網(wǎng)的三個(gè)蛋白MME、ANPEP和PRCP在腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）通路中相互作用。一些組織和細(xì)胞具有固有的RAS，這種RAS通過不同的旁分泌和自分泌機(jī)制在局部發(fā)揮作用,在睪丸、附睪、輸精管、前列腺、精漿和精子中都發(fā)現(xiàn)了RAS的成分，已有證據(jù)表明RAS在雄性生殖中參與腎小管收縮、精子發(fā)生、精子成熟、獲能、頂體胞吐和受精等方面[33]。RAS是由多條軸組成的復(fù)雜系統(tǒng)，局部RAS對睪丸和精子功能以及精子生理過程的作用都涉及到四條關(guān)鍵軸，MME作用于ACE2/Ang (1-7)/ MasR軸，該軸在調(diào)節(jié)類固醇發(fā)生和精子發(fā)生中起著關(guān)鍵作用，ANPEP作用于Ang IV/AT4R-IRAP軸，該軸與抑制睪丸睪酮的產(chǎn)生有關(guān)，進(jìn)而調(diào)節(jié)精子的發(fā)生，且MME和ANPEP的表達(dá)都與精子活力呈負(fù)相關(guān)[34]?？梢奟AS在雄性生殖系統(tǒng)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，在PFE組中高表達(dá)的MME、ANPEP和PRCP在RAS中相互作用，可能對精子的生成和功能產(chǎn)生影響，但其導(dǎo)致精子產(chǎn)生低耐凍性的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究利用TMT技術(shù)對二花臉公豬不同耐凍性精子進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)分析，共鑒定出138個(gè)DAPs。通過對DAPs的生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)DAPs主要集中于氧化還原相關(guān)蛋白（GSTM3、PRDX5、ALB、PDIA1、PDIA4等），精子發(fā)生與功能相關(guān)蛋白（HSPA5、MFGE8、DNAH1、DNAH7、CUL3等），能量相關(guān)蛋白（HK1、PGM1等）以及凋亡與炎癥相關(guān)蛋白（THBS1、ELSPBP1、CP等），有3個(gè)DAPs（MME、ANPEP和PRCP）在腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）中相互作用。總之，研究結(jié)果表明二花臉公豬不同耐凍性的精子蛋白質(zhì)組成存在顯著差異，這些DAPs可作為預(yù)測精子耐凍性的候選蛋白，但其對精子耐凍性的影響機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

[1] 劉鑫, 李振, 鄧世陽, 顧岳清, 黃媛, 劉楊, 李東鋒, 盧元鵬, 韋偉, 陳杰, 張立凡. 二花臉豬種質(zhì)特性的分子基礎(chǔ)研究進(jìn)展. 畜牧與獸醫(yī), 2016, 48(12): 109-113.

LIU X, LI Z, DENG S Y, GU Y Q, HUANG Y, LIU Y, LI D F, LU Y P, WEI W, CHEN J, ZHANG L F. Research Progress on molecular basis of Erhualian pig germplasm characteristics. Animal Husbandry & Veterinary Medicine, 2016, 48(12): 109-113. (in Chinese)

[2] 吳夢, 劉雪芹, 劉子嘉, 肖普英, 丁玉春, 劉作華, 葛良鵬. 豬精液超低溫冷凍保存研究進(jìn)展. 中國畜牧雜志, 2019, 55(7): 35-40. doi:10.19556/j.0258-7033.2019-07-035.

WU M, LIU X Q, LIU Z J, XIAO P Y, DING Y C, LIU Z H, GE L P. Research progress on cryopreservation of boar semen. Chinese Journal of Animal Science, 2019, 55(7): 35-40. doi:10.19556/j.0258- 7033.2019-07-035. (in Chinese)

[3] YESTE M. Sperm cryopreservation update: Cryodamage, markers, and factors affecting the sperm freezability in pigs. Theriogenology, 2016, 85(1): 47-64. doi:10.1016/j.theriogenology.2015.09.047.

[4] WATSON P F. Recent developments and concepts in the cryopreservation of spermatozoa and the assessment of their post-thawing function. Reproduction, Fertility, and Development, 1995, 7(4): 871-891. doi:10.1071/rd9950871.

[5] MA?KOWSKA A, BRYM P, PAUKSZTO ?, JASTRZ?BSKI J P, FRASER L. Gene polymorphisms in boar spermatozoa and their associations with post-thaw semen quality. International Journal of Molecular Sciences, 2020, 21(5): 1902. doi:10.3390/ijms21051902.

[6] FRASER L, BRYM P, PAREEK C S, MOGIELNICKA-BRZOZOWSKAM, PAUKSZTO ?, JASTRZ?BSKI J P, WASILEWSKA-SAKOWSKA K, MA?KOWSKA A, SOBIECH P, ?UKOWSKI K. Transcriptome analysis of boar spermatozoa with different freezability using RNA- Seq. Theriogenology, 2020, 142: 400-413. doi:10.1016/j.theriogenology. 2019.11.001.

[7] PEDROSA A C, ANDRADE TORRES M, VILELA ALKMIN D, PINZON J E P, KITAMURA MARTINS S M M, COELHO DA SILVEIRA J, FURUGEN CESAR DE ANDRADE A. Spermatozoa and seminal plasma small extracellular vesicles miRNAs as biomarkers of boar semen cryotolerance. Theriogenology, 2021, 174: 60-72. doi:10.1016/j.theriogenology.2021.07.022.

[8] CASAS I, SANCHO S, BALLESTER J, BRIZ M, PINART E, BUSSALLEU E, YESTE M, FàBREGA A, RODRíGUEZ-GIL J E, BONET S. The HSP90AA1 sperm content and the prediction of the boar ejaculate freezability. Theriogenology, 2010, 74(6): 940-950. doi:10.1016/j.theriogenology.2010.04.021.

[9] PRIETO-MARTíNEZ N, VILAGRAN I, MORATó R, RIVERA DEL áLAMO M M, RODRíGUEZ-GIL J E, BONET S, YESTE M. Relationship of aquaporins 3 (AQP3), 7 (AQP7), and 11 (AQP11) with boar sperm resilience to withstand freeze-thawing procedures. Andrology, 2017, 5(6): 1153-1164. doi:10.1111/andr.12410.

[10] LLAVANERA M, DELGADO-BERMúDEZ A, FERNANDEZ- FUERTES B, RECUERO S, MATEO Y, BONET S, BARRANCO I, YESTE M. GSTM3, but not IZUMO1, is a cryotolerance marker of boar sperm. Journal of Animal Science and Biotechnology, 2019, 10: 61. doi:10.1186/s40104-019-0370-5.

[11] GUIMAR?ES D B, BARROS T B, VAN TILBURG M F, MARTINS J A M, MOURA A A, MORENO F B, MONTEIRO-MOREIRA A C, MOREIRA R A, TONIOLLI R. Sperm membrane proteins associated with the boar semen cryopreservation. Animal Reproduction Science, 2017, 183: 27-38. doi:10.1016/j.anireprosci.2017.06.005.

[12] 王欣悅, 石田培, 趙志達(dá), 胡文萍, 尚明玉, 張莉. 基于綿羊胚胎骨骼肌蛋白質(zhì)組學(xué)的PI3K-AKT信號(hào)通路分析. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2020, 53(14): 2956-2963. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2020.14.018.

WANG X Y, SHI T P, ZHAO Z D, HU W P, SHANG M Y, ZHANG L. The analysis of PI3K-AKT signal pathway based on the proteomic results of sheep embryonic skeletal muscle. Scientia Agricultura Sinica, 2020, 53(14): 2956-2963. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2020. 14.018. (in Chinese)

[13] 劉鍇棟, 莫億偉, 馮少嫻, 吳婉儀, 黎海利, 鐘軍弟, 袁長春. 番荔枝花發(fā)育不同階段的差異蛋白質(zhì)組分析. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2018, 51(1): 149-159. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.01.014.

LIU K D, MO Y W, FENG S X, WU W Y, LI H L, ZHONG J D, YUAN C C. Comparative proteomic analysis in different developmental stages of sugar-apple (L.) flowers. Scientia Agricultura Sinica, 2018, 51(1): 149-159. doi:10.3864/j.issn.0578- 1752.2018.01.014. (in Chinese)

14] REGO J P A, MARTINS J M, WOLF C A, VAN TILBURG M, MORENO F, MONTEIRO-MOREIRA A C, MOREIRA R A, SANTOS D O, MOURA A A. Proteomic analysis of seminal plasma and sperm cells and their associations with semen freezability in Guzerat bulls. Journal of Animal Science, 2016, 94(12): 5308-5320. doi:10.2527/jas.2016-0811.

[15] VAZQUEZ J M, MARTINEZ E A, MARTINEZ P, GARCIA-ARTIGA C, ROCA J. Hypoosmotic swelling of boar spermatozoa compared to other methods for analysing the sperm membrane. Theriogenology, 1997, 47(4): 913-922. doi:10.1016/S0093-691X(97)00046-0.

[16] SHAN X, YU T, YAN X, WU J L, FAN Y N, GUAN X Y, FANG F G, LIN Y H, ZHANG Y H, LI Y S, LIU Y. Proteomic analysis of healthy and atretic porcine follicular granulosa cells. Journal of Proteomics, 2021, 232: 104027. doi:10.1016/j.jprot.2020.104027.

[17] MANDAL R, BADYAKAR D, CHAKRABARTY J. Role of membrane lipid fatty acids in sperm cryopreservation. Advances in Andrology, 2014, 2014: 190542. doi:10.1155/2014/190542.

[18] LLAVANERA M, DELGADO-BERMúDEZ A, OLIVES S, MATEO-OTERO Y, RECUERO S, BONET S, FERNáNDEZ- FUERTES B, YESTE M, BARRANCO I. Glutathione S-transferases play a crucial role in mitochondrial function, plasma membrane stability and oxidative regulation of mammalian sperm. Antioxidants (Basel, Switzerland), 2020, 9(2): 100. doi:10.3390/antiox9020100.

[19] GOMES F P, PARK R, VIANA A G, FERNANDEZ-COSTA C, TOPPER E, KAYA A, MEMILI E, YATES J R, MOURA A A. Protein signatures of seminal plasma from bulls with contrasting frozen- thawed sperm viability. Scientific Reports, 2020, 10: 14661. doi:10.1038/s41598-020-71015-9.

[20] NAGDAS S K, BUCHANAN T, RAYCHOUDHURY S. Identification of peroxiredoxin-5 in bovine cauda epididymal sperm. Molecular and Cellular Biochemistry, 2014, 387(1/2): 113-121. doi:10.1007/s11010- 013-1876-3.

[21] WANG P, WANG Y F, WANG H, WANG C W, ZAN L S, HU J H, LI Q W, JIA Y H, MA G J. HSP90 expression correlation with the freezing resistance of bull sperm. Zygote (Cambridge, England), 2014, 22(2): 239-245. doi:10.1017/S096719941300004X.

[22] VINCE S, ?AJA I ?, SAMARD?IJA M, BALI? I M, VILI? M, ?URI?I? D, VALPOTI? H, MARKOVI? F, MILINKOVI?-TUR S. Age-related differences of semen quality, seminal plasma, and spermatozoa antioxidative and oxidative stress variables in bulls during cold and warm periods of the year. Animal, 2018, 12(3): 559-568. doi:10.1017/S1751731117001811.

[23] SOARES MORETTI A I, MARTINS LAURINDO F R. Protein disulfide isomerases: Redox connections in and out of the endoplasmic. Archives of Biochemistry and Biophysics, 2017, 617: 106-119. doi:10.1016/j.abb.2016.11.007.

[24] YU J, LI M, JI C L, LI X X, LI H J, LIU G Q, WANG Y T, LIU G Y, WANG T, CHE X N, LEI C Z, DANG R H, ZHAO F W. Comparative proteomic analysis of seminal plasma proteins in relation to freezability of Dezhou donkey semen. Animal Reproduction Science, 2021, 231: 106794. doi:10.1016/j.anireprosci.2021.106794.

[25] WANG W L, TU C F, TAN Y Q. Insight on multiple morphological abnormalities of sperm flagella in male infertility: What is new? Asian Journal of Andrology, 2020, 22(3): 236-245. doi:10.4103/aja.aja_ 53_19.

[26] STIVAL C, DEL C PUGA MOLINA L, PAUDEL B, BUFFONE M G, VISCONTI P E, KRAPF D. Sperm capacitation and acrosome reaction in mammalian sperm. Advances in Anatomy, Embryology, and Cell Biology, 2016, 220: 93-106. doi:10.1007/978-3-319-30567-7_5.

[27] KHAN I M, CAO Z B, LIU H Y, KHAN A, RAHMAN S U, KHAN M Z, SATHANAWONGS A, ZHANG Y H. Impact of cryopreservation on spermatozoa freeze-thawed traits and relevance OMICS to assess sperm cryo-tolerance in farm animals. Frontiers in Veterinary Science, 2021, 8: 609180. doi:10.3389/fvets.2021.609180.

[28] HUANG Z H, DANSHINA P V, MOHR K, QU W D, GOODSON S G, O’CONNELL T M, O’BRIEN D A. Sperm function, protein phosphorylation, and metabolism differ in mice lacking successive sperm-specific glycolytic enzymes. Biology of Reproduction, 2017, 97(4): 586-597. doi:10.1093/biolre/iox103.

[29] VILAGRAN I, CASTILLO J, BONET S, SANCHO S, YESTE M, ESTANYOL J M, OLIVA R. Acrosin-binding protein (ACRBP) and triosephosphate isomerase (TPI) are good markers to predict boar sperm freezing capacity. Theriogenology, 2013, 80(5): 443-450. doi:10.1016/j.theriogenology.2013.05.006.

[30] ZHU W H, YANG M, SHANG J N, XU Y L, WANG Y L, TAO Q Q, ZHANG L, DING Y Y, CHEN Y G, ZHAO D D, WANG C L, CHU M X, YIN Z J, ZHANG X D. miR-222 inhibits apoptosis in porcine follicular granulosa cells by targeting the THBS1gene. Animal Science Journal, 2019, 90(6): 719-727. doi:10.1111/asj.13208.

[31] D'AMOURS O, FRENETTE G, BORDELEAU L J, ALLARD N, LECLERC P, BLONDIN P, SULLIVAN R. Epididymosomes transfer epididymal sperm binding protein 1 (ELSPBP1) to dead spermatozoa during epididymal transit in bovine. Biology of Reproduction, 2012, 87(4): 94, 1-11. doi:10.1095/biolreprod.112.100990.

[32] HELLMAN N E, GITLIN J D. Ceruloplasmin metabolism and function. Annual Review of Nutrition, 2002, 22: 439-458. doi:10. 1146/annurev.nutr.22.012502.114457.

[33] LEUNG P S, SERNIA C. The renin-angiotensin system and male reproduction: new functions for old hormones. Journal of Molecular Endocrinology, 2003, 30(3): 263-270. doi:10.1677/jme.0.0300263.

[34] GIANZO M, SUBIRáN N. Regulation of male fertility by the renin-angiotensin system. International Journal of Molecular Sciences, 2020, 21(21): 7943. doi:10.3390/ijms21217943.

Proteomic Analysis of Sperm with Different Freezing Tolerance in Erhualian Boar

1Department of Animal Genetics and Breeding, College of Animal Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095;2Jiangsu Changshu Animal Husbandry Industry and Commerce Co., Ltd., Changshu 215500, Jiangsu

【Objective】Erhualian pig is one of the excellent indigenous pig breeds in China. Frozen semen can improve the utilization rate of Erhualian boar and strengthen the protection of germplasm resources. However, the frozen semen of Erhualian pigs can not meet the production demand. This study analyzed the proteomics of Erhualian boar sperm with different freezing tolerance to promote the screening of protein markers of Erhualian boar sperm freezing tolerance, analyze the influencing factors of sperm freezing tolerance from the genetic level, and provide reference basis for improving sperm freezing tolerance. 【Method】In this study, semen from14 Erhualian boars were frozen and their quality was analyzed. Boars with good and poor freezability ejaculates (GFE and PFE, n=3) were selected respectively, according to the motility and progressive motility of frozen-thawed spermatozoa. Using tandem mass tag (TMT) analyzed the sperm proteomics of GFE and PFE, and the differentially abundant proteins (DAPs) of spermatozoa of GFE and PFE were identified. The functions of DAPs were annotated by GO enrichment analysis, and the biological pathways of DAPs were annotated by KEGG enrichment analysis. The interaction network of DAPs was analyzed by STRING protein interaction database, and the protein-protein interaction (PPI) network was constructed by Cytoscape software. 【Result】The study found that there were 138 DAPs between GFE and PFE. Compared with GFE, 109 DAPs were up-regulated and 29 DAPs were down-regulated in PFE. GO enrichment analysis showed that a total of 124 DAPs were enriched to 47 GO terms, mainly enriched in “cellular process” “single-organism process” “binding” “cell” “cell part” and so on. KEGG enrichment analysis showed that DAPs were mainly enriched in “Renin-angiotensin system” “Complement andcoagulation cascades” “Platelet activation” and so on. There were 53 nodes and 69 edges in the PPI network, among which 8 proteins showed high combine_score, including ALB, ACRBP, ACR, ZAN, ZPBP2, HSPA5, FGB and FGG. The functions of these proteins were mainly enriched in GO terms closely related to animal reproductive physiology and spermatogenesis, such as “single fertilization” “sexual reproduction” and “spermatid development”. Further analysis shows that DAPs in GFE and PFE mainly included redox related proteins (GSTM3, PRDX5, ALB, PDIA1, PDIA4), spermatogenesis and sperm function related proteins (HSPA5, MFGE8, DNAH1, DNAH7, CUL3), energy related proteins (HK1, PGM1), apoptosis and inflammation related proteins (THBS1, ELSPBP1, CP), and PPI network analysis shows that three DAPs (MME, ANPEP and PRCP) interact in renin-angiotensin system (RAS). 【Conclusion】There are significant differences in sperm protein components of Erhualian boar with different freezing tolerance, which may affect the freezing performance of sperm. These DAPs can be used as candidate protein markers of sperm freezing tolerance.

Erhualian boar; sperm freezing tolerance; TMT; differentially abundant proteins

10.3864/j.issn.0578-1752.2022.23.014

2021-09-18；

2021-12-28

江蘇省種業(yè)振興揭榜掛帥項(xiàng)目（JBGS（2021）026）、農(nóng)業(yè)農(nóng)村部地方豬遺傳材料采集制作專項(xiàng)課題（19190632）、農(nóng)業(yè)農(nóng)村部都市農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題（UA201909）

童世鋒，E-mail：sftong9518@163.com。通信作者劉楊，E-mail：yangliu@njau.edu.cn

（責(zé)任編輯 林鑒非）