王朝，方東路，張攀容，姜雯，裴斐，胡秋輝，馬寧

基于TMT定量蛋白質(zhì)組學(xué)揭示納米包裝雙孢蘑菇采后冷藏生理代謝規(guī)律

1南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院/江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心/江蘇高校糧油質(zhì)量安全控制及深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210023；2南京林業(yè)大學(xué)輕工與食品學(xué)院，南京 210037

【背景】雙孢蘑菇采后極易發(fā)生開傘、失水及褐變等品質(zhì)劣變現(xiàn)象，極大地影響了其貯藏品質(zhì)和商業(yè)價(jià)值。前期研究已證實(shí)納米包裝可有效延緩雙孢蘑菇采后的品質(zhì)劣變，但其保鮮機(jī)制仍不清晰?！灸康摹勘狙芯客ㄟ^串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)記（TMT）定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，對(duì)納米包裝和普通聚乙烯包裝的雙孢蘑菇貯藏期間的差異表達(dá)蛋白進(jìn)行分析，進(jìn)一步探究納米包裝保鮮雙孢蘑菇的作用機(jī)制?！痉椒ā恳噪p孢蘑菇為研究對(duì)象，用納米包裝對(duì)其進(jìn)行保鮮，并以普通聚乙烯包裝作為對(duì)照。對(duì)貯藏期間雙孢蘑菇進(jìn)行蛋白提取和胰蛋白酶解，并通過TMT標(biāo)記及液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)，篩選出差異表達(dá)蛋白，結(jié)合生物信息學(xué)分析，研究差異蛋白所參與的主要代謝途徑，同時(shí)利用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qPCR）技術(shù)，在基因?qū)用骝?yàn)證差異蛋白的表達(dá)水平?！窘Y(jié)果】納米包裝有效維持了雙孢蘑菇的外觀品質(zhì)，并且延緩了細(xì)胞膜透性的增加。隨著貯藏時(shí)間的增加，兩組包裝的差異蛋白數(shù)目增多，在貯藏中期（6 d）和貯藏末期（10 d），差異蛋白分別達(dá)到62個(gè)和148個(gè)，其中納米包裝和普通包裝有共同差異蛋白22個(gè)。結(jié)合生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)這些差異蛋白主要與能量代謝和脂代謝等功能途徑相關(guān)。對(duì)脂代謝途徑進(jìn)行重點(diǎn)分析，結(jié)果顯示納米包裝對(duì)雙孢蘑菇的膜脂代謝具有調(diào)控作用，相較于普通包裝組，納米包裝組的脂肪酸合成酶、磷酸膽堿孢苷酰轉(zhuǎn)移酶和磷脂酸磷酸酯酶呈上調(diào)趨勢(shì)，同時(shí)下調(diào)了膜脂降解關(guān)鍵酶如磷脂酶D和脂肪酶的活性；從基因水平上來看，編碼這些蛋白的基因表達(dá)與組學(xué)結(jié)果相一致?！窘Y(jié)論】利用TMT定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，能對(duì)不同包裝雙孢蘑菇貯藏期間的差異蛋白進(jìn)行篩選和分析。納米包裝調(diào)節(jié)了雙孢蘑菇的膜脂代謝，抑制了膜脂降解相關(guān)酶的表達(dá)，有效延緩了細(xì)胞膜透性的增加，維持了細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能，進(jìn)而延緩雙孢蘑菇貯藏期間的品質(zhì)劣變。

納米包裝；雙孢蘑菇；貯藏保鮮；蛋白質(zhì)組學(xué)

0 引言

【研究意義】雙孢蘑菇（），也稱為白蘑菇，是世界上種植和消費(fèi)最廣泛的食用蘑菇之一，不僅味道鮮美，而且營養(yǎng)價(jià)值豐富[1]。但由于雙孢蘑菇采后代謝旺盛，容易導(dǎo)致褐變、腐爛等現(xiàn)象[2]。傳統(tǒng)的食用菌保鮮方式有低溫冷藏、氣調(diào)包裝、涂膜保鮮等[3]，但由于成本、安全和保鮮效果不理想等原因，存在著一定的局限性。而納米包裝作為一種新型包裝材料，在防霧、抑菌、清除乙烯等方面具有明顯優(yōu)勢(shì)[4]，筆者團(tuán)隊(duì)前期研制了一種納米材料包裝袋，相比于普通商業(yè)包裝袋，納米包裝能抑制食用菌的呼吸速率，減少活性氧積累，有效地緩解了食用菌在貯藏期間的品質(zhì)劣變[5-7]。然而，對(duì)于納米包裝保鮮雙孢蘑菇的作用機(jī)制，尚未有更深入的研究，因此，利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)進(jìn)一步探究雙孢蘑菇采后的代謝規(guī)律，對(duì)豐富食用菌保鮮體系研究具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】目前，高通量蛋白質(zhì)組學(xué)分析技術(shù)作為一種高效、準(zhǔn)確的蛋白質(zhì)分離鑒定手段[8]，已成功應(yīng)用于對(duì)果蔬、農(nóng)作物、肉制品等的分子過程調(diào)控機(jī)制研究[9]，串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)記（tandem mass tag，TMT）定量蛋白質(zhì)分析技術(shù)便是其中被廣泛使用的一種。對(duì)于被分離和鑒定后的蛋白質(zhì)，可通過生物信息學(xué)分析對(duì)其功能和代謝途徑進(jìn)行研究[10]。從生物學(xué)角度來看，基因的表達(dá)狀態(tài)對(duì)其相應(yīng)的蛋白質(zhì)表達(dá)具有調(diào)控作用，而通過實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR）技術(shù)，能夠?qū)Σ煌锓N的基因表達(dá)水平進(jìn)行有效分析[11]。Fang等[12]利用TMT標(biāo)記結(jié)合液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)不同包裝金針菇貯藏期間細(xì)胞蛋白組進(jìn)行分離鑒定，研究其保鮮機(jī)制；楊波若等[13]通過TMT蛋白質(zhì)組學(xué)，分析了影響豬肉持水性能的差異蛋白；韓冉等[14]采用TMT蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)合生物信息學(xué)分析，研究了小麥淀粉糯性變異的機(jī)制?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】筆者前期已經(jīng)證實(shí)納米包裝能改善雙孢蘑菇的貯藏品質(zhì)，但大多只停留在單一物質(zhì)或酶面層，尚未有更深入的機(jī)理研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究以雙孢蘑菇為試驗(yàn)對(duì)象，利用TMT定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，對(duì)納米包裝保鮮雙孢蘑菇的代謝規(guī)律進(jìn)行研究；同時(shí)通過生物信息學(xué)分析，定位差異蛋白的功能和代謝途徑，并從基因水平對(duì)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行檢測(cè)，為進(jìn)一步研究納米包裝對(duì)食用菌保鮮的作用機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2020年11月至2021年6月在南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院進(jìn)行。

1.1 試驗(yàn)材料

納米包裝袋的制備參照FANG等[4]的方法。30%納米銀、35%納米二氧化鈦、10%納米二氧化硅及25%納米凹凸棒土混合制成納米粉體；然后將其與低密度聚乙烯、低密度線性聚乙烯、分散劑、潤滑劑、偶聯(lián)劑按15﹕46﹕22﹕10﹕5﹕2的比例混勻制成納米復(fù)合母粒；最后將7.5%納米復(fù)合母粒、8%防霧劑和84.5%聚乙烯塑料顆?；旌霞庸こ砷L、寬、厚分別為25 cm、25 cm和40 μm的納米包裝薄膜。對(duì)照組為不添加納米復(fù)合母粒的普通聚乙烯塑料薄膜。

雙孢蘑菇采購自五河眾興菌業(yè)科技有限公司。樣品運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室后，將其放入4℃冰箱預(yù)冷12 h。挑選菇體完整、顏色潔白、未開傘、無病蟲害和機(jī)械損傷、菌蓋直徑30—40 mm的雙孢蘑菇，用利刀削去菇柄泥漬部分，用納米包裝袋和普通聚乙烯膜包裝袋進(jìn)行分裝。每袋裝入雙孢菇（200±5）g，每個(gè)處理組和對(duì)照組各3袋，置于溫度為4℃、相對(duì)濕度為90%條件下貯藏。貯藏期為10 d，每隔2 d取樣一次，將樣品用液氮研磨至粉末狀，保存于-80℃超低溫冰箱待測(cè)，其中，選取第0、6和10天的樣品進(jìn)行TMT定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析，每個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)的樣品進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2 儀器與試劑

儀器：FreeZone 2.5冷凍干燥機(jī)，美國Labconco公司；Agilent 1100 series高pH分離液相色譜儀，美國Agilent公司；Q Exactive HF質(zhì)譜儀，美國Thermo Scientific公司；GL-21M型高速冷凍離心機(jī)，上海市離心機(jī)械研究所有限公司；DDS-11A型電導(dǎo)率儀，上海盛磁儀器有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州國華電器有限公司；Chemidocxrs+凝膠成像系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司；ELX800酶標(biāo)儀，美國Bio-Tek公司；7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)，美國Thermo Scientific公司。

試劑：甲醇（HPLC級(jí)）、乙腈（HPLC級(jí)）、蔗糖、氯化鈉購自南京化學(xué)試劑有限公司；二硫蘇糖醇（DTT）、甲酸（HPLC級(jí)）、-巰基乙醇、醋酸銨、苯基甲磺酰氟（PMSF）購自上海麥克林生化科技有限公司；胰蛋白酶購于北京華利世科技有限公司；碘乙酰胺、四乙基硼氫化銨（TEAB）、Tris-HCl、EDTA·2Na、柱式真菌總RNA抽提純化試劑盒購于上海生工生物工程股份有限公司；TMTpro 16標(biāo)記試劑盒購于美國Thermo Scientific公司；HiScript III RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、ChamQ? SYBR qPCR Master Mix（Low ROX Premixed）qPCR試劑盒購于南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 外觀品質(zhì)及相對(duì)電導(dǎo)率測(cè)定 對(duì)第0、2、4、6、8和10天的雙孢蘑菇進(jìn)行拍照觀察，記錄其貯藏期間的表觀變化情況。相對(duì)電導(dǎo)率參考Barman等[15]的方法并稍作修改。將雙孢蘑菇豎切成厚度為3 mm的薄片，后用打孔器將薄片處理成20塊圓片。將圓片放入40 mL蒸餾水中，立即測(cè)定懸浮液的電導(dǎo)值，記為P0，靜置10 min后，測(cè)量電導(dǎo)值P1，最后煮沸10 min后測(cè)定電導(dǎo)值P2。相對(duì)電導(dǎo)率根據(jù)以下公式進(jìn)行計(jì)算：

相對(duì)電導(dǎo)率（%）=[(P1-P0)/(P2-P0)]×100

1.3.2 蛋白提取 蛋白的提取參考FANG等[12]的方法并稍作修改。取5 g樣品加入10 mL蛋白提取液（0.25 mol·L-1Tris-HCl，pH 8.0，含24% w/v蔗糖、0.1 mol·L-1NaCl、0.04 mol·L-1EDTA·2Na、0.01 mol·L-1DTT）充分混勻。加入10 mL酚-Tris-HCl（0.5 mol·L-1，pH 7.8），4℃靜置30 min。樣品于4℃，7 100×離心10 min，收集上層。加入5倍體積的預(yù)冷0.1 mol·L-1醋酸銨-甲醇溶液，-20℃靜置12 h。然后4℃，12 000×離心10 min，收集沉淀。沉淀用5倍體積的預(yù)冷甲醇清洗，并于4℃、12 000×離心10 min，收集沉淀后用5倍體積丙酮清洗兩遍。將沉淀常溫干燥后溶于10 mL裂解緩沖液（50 mmol·L-1tris-HCl，pH 7.2，2% v/v-巰基乙醇和1 mmol·L-1苯基甲磺酰氟），溶解3 h。最后將溶液12 000×離心20 min，收集上清液待用。

1.3.3 胰蛋白酶解 胰蛋白酶解參照Wang等[16]的方法并稍作修改。將100 μg蛋白溶于20 μL TEAB（pH 8.5）中，加入0.5 μL 10 mmol·L-1DTT并在55℃條件下孵育0.5 h。加入碘乙酰胺，使其終濃度為10 mmol·L-1，避光靜置15 min。溶液中加入6倍體積的丙酮沉淀蛋白，-20℃靜置12 h。溶液于4℃、8 000×離心10 min收集沉淀并使丙酮揮發(fā)。沉淀中加入100 μL TEAB（100 mmol·L-1）。最后加入胰蛋白酶（蛋白質(zhì)﹕胰蛋白酶=50﹕1，w/w）于37℃下消化12 h。酶解后的樣品凍干后于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 TMT標(biāo)記 取凍干樣品用50 μL TEAB（100 mmol·L-1，pH 8.5）重懸。標(biāo)記反應(yīng)根據(jù)TMTpro（ThermoScientific）試劑盒說明書進(jìn)行操作，流程見圖1。取TMTpro試劑，平衡至室溫，加入20 μL無水乙腈，充分振蕩后離心。取10 μL TMTpro到樣品中，混勻，靜置1 h。每個(gè)樣品加入5 μL 5%羥胺，孵育15 min。收集樣品，凍干后于-80℃保存。

1.3.5 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè) 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)參考FANG等[17]的方法，并稍作修改。流動(dòng)相A為0.1%的甲酸溶液，流動(dòng)相B為含0.1%甲酸的乙腈溶液。流速為0.35 μL?min-1，梯度洗脫方法：0 min，2% B；1 min，6% B；52 min，35% B；54 min，90% B；60 min，90% B。質(zhì)譜條件：一級(jí)MS質(zhì)量分辨率設(shè)為120 000，質(zhì)譜掃描設(shè)定為全掃描荷質(zhì)比m/z為350—1 650；所有MS/MS圖譜采集使用數(shù)據(jù)依賴型的正離子模式下的高能碰撞裂解完成，碰撞能量設(shè)為32；MS/MS的分辨率設(shè)為60 000，動(dòng)態(tài)排除時(shí)間設(shè)為40 s。

1.3.6 生物信息學(xué)分析 將質(zhì)譜檢測(cè)數(shù)據(jù)通過uniprot-database傘菌目數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，并運(yùn)用SEQUEST?搜索引擎的Proteome Discoverer 2.4（美國Thermofisher公司）處理。將數(shù)據(jù)歸一化處理后，利用Gene ontology數(shù)據(jù)庫和KEGG 數(shù)據(jù)庫對(duì)差異蛋白的功能和其參與代謝的通路進(jìn)行分析。

1.3.7 qPCR分析 按照ChamQ SYBR qPCR Master Mix試劑盒操作說明進(jìn)行qPCR分析。反應(yīng)體系包括10 μL 2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix、2 μL cDNA、0.8 μL引物和7.2 μL Nuclease-free H2O。用于qPCR的引物由上海生工生物有限公司合成，以為內(nèi)參（表1）。qPCR程序設(shè)置見表2。

表1 qPCR引物序列

表2 qPCR條件設(shè)置

1.3.8 結(jié)果統(tǒng)計(jì)與分析 采用2?ΔΔCT法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。使用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，顯著性分析采用Duncan test，當(dāng)＜0.05時(shí)，差異顯著。

圖1 TMT定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析不同包裝雙孢蘑菇代謝規(guī)律流程圖

2 結(jié)果

2.1 不同包裝雙孢蘑菇貯藏期間的外觀質(zhì)量及細(xì)胞膜透性變化

雙孢蘑菇的表觀品質(zhì)是影響消費(fèi)者購買的重要因素，也是評(píng)判雙孢蘑菇質(zhì)量優(yōu)劣與否的基礎(chǔ)指標(biāo)，能在一定程度上反映出蘑菇的新鮮程度。如圖2-A所示，新鮮雙孢蘑菇潔白、菌蓋表面無破損，但隨著貯藏時(shí)間的增加，雙孢蘑菇的外觀品質(zhì)逐漸降低，其中，普通包裝組從4 d開始，逐漸表現(xiàn)出較為明顯的褐變現(xiàn)象，當(dāng)貯藏10 d時(shí)，已經(jīng)呈現(xiàn)出較為嚴(yán)重的表觀衰敗，并伴有菌蓋破膜和水漬狀斑塊。而納米包裝組則保持了較好的外觀品質(zhì)，尤其到了貯藏末期，納米包裝組表現(xiàn)出的褐變程度要明顯好于普通包裝組。

細(xì)胞膜透性是評(píng)價(jià)膜系統(tǒng)完整性的一個(gè)重要指標(biāo)，一般而言，細(xì)胞膜透性越大，細(xì)胞的損傷程度就越嚴(yán)重；此外，它也在一定程度上反映了果蔬的老化程度[18]。細(xì)胞膜透性通常用相對(duì)電導(dǎo)率（%）表示，如圖2-B所示，兩組包裝雙孢蘑菇在貯藏期間的細(xì)胞膜透性不斷增大，而相較于普通包裝組，納米包裝組的增長趨勢(shì)較為平緩。其中，納米包裝組第6、8和10天的細(xì)胞膜透性分別為15.3、16.9和19.3，顯著低于對(duì)照組的18.5、22.0和26.9。

2.2 差異表達(dá)蛋白篩選

使用傘菌目數(shù)據(jù)庫uniprot-database進(jìn)行蛋白數(shù)據(jù)檢索，Proteome Discover 2.4進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。根據(jù)數(shù)據(jù)庫檢索得到的蛋白數(shù)據(jù)，按照Score Sequest HT＞0、Unique Peptides≥1的標(biāo)準(zhǔn)篩選可信蛋白，共鑒定出可信蛋白3 099個(gè)。當(dāng)差異倍數(shù)FC＞1.5或FC＜0.8，且＜0.05時(shí)，蛋白被認(rèn)為有顯著差異。由圖3可知，不同包裝處理的雙孢蘑菇在貯藏期間的蛋白表達(dá)具有差異性。由圖3-A可知，在貯藏6 d時(shí)，有差異表達(dá)蛋白62個(gè)，其中，與普通包裝組相比，納米包裝組上調(diào)蛋白39個(gè)，下調(diào)蛋白23個(gè)；在貯藏10 d時(shí)，差異表達(dá)蛋白148個(gè)，其中納米包裝相較于普通包裝組分別上調(diào)和下調(diào)蛋白91個(gè)和57個(gè)（圖3-B）。雙孢蘑菇生理代謝旺盛，采摘后蒸騰作用和呼吸作用不斷增強(qiáng)，極易引發(fā)其品質(zhì)的劣變[19-20]。因此，由于雙孢蘑菇旺盛的生理代謝，隨著貯藏時(shí)間的延長，兩組包裝差異蛋白數(shù)不斷增加，說明不同包裝對(duì)雙孢蘑菇采后貯藏的影響不斷增大。

*表示處理間差異顯著（P＜0.05）。下同 *indicate sinificant difference (P＜0.05). The same as below

A：貯藏6 d時(shí)納米包裝組和普通包裝組差異表達(dá)蛋白；B：貯藏10 d時(shí)納米包裝組和普通包裝組差異表達(dá)蛋白

2.3 差異表達(dá)蛋白統(tǒng)計(jì)分析

火山圖可更直觀地展示樣本間差異表達(dá)物的分布情況，常被用于蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)等的測(cè)序結(jié)果研究[21]。如圖4所示，每個(gè)點(diǎn)即為一個(gè)蛋白，藍(lán)色的點(diǎn)表示下調(diào)表達(dá)蛋白，紅色的點(diǎn)為上調(diào)表達(dá)蛋白，灰色點(diǎn)則為非顯著差異表達(dá)蛋白。其橫坐標(biāo)log2（FC）距0點(diǎn)越遠(yuǎn)則表示蛋白差異越大。因此，由圖4-A與圖4-B可知，隨著貯藏時(shí)間的延長，在差異表達(dá)蛋白數(shù)量增加的同時(shí)，其顯著性也隨之增加，這可能是由于納米包裝組與普通包裝組雙孢蘑菇間的代謝差異性不斷增大所致。另外，通過對(duì)同一包裝組的不同貯藏期與CK組新鮮雙孢蘑菇的分析，如圖4-C韋恩圖所示，6 d與10 d的納米包裝組相較于新鮮樣品有101個(gè)相同的差異表達(dá)蛋白，而6 d與10 d的普通包裝組與新鮮樣品比有145個(gè)相同的差異表達(dá)蛋白，這表明不同包裝處理組對(duì)雙孢蘑菇貯藏期間的蛋白表達(dá)有不同的影響，從而導(dǎo)致不同的保鮮效果。

A：貯藏6 d時(shí)納米包裝組和普通包裝組差異表達(dá)蛋白火山圖；B：貯藏10 d時(shí)納米包裝組和普通包裝組差異表達(dá)蛋白火山圖；C：貯藏期間納米包裝組和普通包裝組差異表達(dá)蛋白韋恩圖。N：納米包裝組；P：普通包裝組；CK：新鮮組

2.4 GO富集與KEGG富集分析

利用GO數(shù)據(jù)庫對(duì)納米包裝組和普通包裝組的差異表達(dá)蛋白進(jìn)行GO功能富集分析，將差異表達(dá)蛋白劃分為生物過程（BP）、細(xì)胞組分（CC）和分子功能（MF）3大類，分別挑選出每類最為富集的功能節(jié)點(diǎn)，以探究不同包裝差異蛋白所屬的功能區(qū)域。如圖5-A所示，兩組包裝差異表達(dá)蛋白在生物過程中最為富集的節(jié)點(diǎn)分別為：糖代謝過程、翻譯過程、蛋白質(zhì)成熟、細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、三羧酸循環(huán)、囊泡介導(dǎo)轉(zhuǎn)運(yùn)、蛋白質(zhì)折疊和脂肪酸代謝過程；差異蛋白在細(xì)胞組分中最為富集的節(jié)點(diǎn)分別為：胞外區(qū)、細(xì)胞膜、核小體、核仁和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜；差異蛋白在分子功能類別中最為富集的節(jié)點(diǎn)分別為：金屬離子結(jié)合、RNA結(jié)合、水解酶活性、氧化還原酶活性、FAD綁定、NAD綁定、核糖體結(jié)構(gòu)成分、翻譯起始因子活性、蛋白激酶調(diào)節(jié)活性和GTP綁定。

圖5 不同包裝組雙孢蘑菇貯藏期間差異表達(dá)蛋白的GO（A）與KEGG（B）分析

KEGG是系統(tǒng)分析蛋白質(zhì)在細(xì)胞中代謝途徑的主要公共數(shù)據(jù)庫，參與同一途徑的蛋白質(zhì)共同執(zhí)行它們的生物學(xué)功能[22-23]，利用KEGG數(shù)據(jù)庫對(duì)兩組包裝差異表達(dá)蛋白進(jìn)行通路分析，從而進(jìn)一步探究差異蛋白的生物學(xué)功能。選取兩個(gè)包裝組中差異表達(dá)蛋白富集最為顯著的20條KEGG通路，結(jié)果如圖5-B所示，差異蛋白的主要代謝途徑有檸檬酸循環(huán)、丙酮酸代謝、酮體合成與降解、脂肪酸生物合成和脂肪酸降解等。

對(duì)兩組包裝差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)一步分析，共篩選出31個(gè)差異蛋白（表3）。在這些蛋白中，XP_ 006456433.1、XP_006457863.1在貯藏6 d時(shí)下調(diào)，10 d時(shí)無顯著變化，其中，XP_006457863.1尚未表征；而XP_006456433.1主要參與催化葡萄糖生成過氧化氫，最后使木質(zhì)素發(fā)生降解的過程[24]，6 d時(shí)納米包裝下調(diào)了XP_006456433.1的表達(dá)進(jìn)而延緩了雙孢蘑菇的木質(zhì)化過程，10 d時(shí)可能由于兩組包裝木質(zhì)素累積進(jìn)程相近而變化不顯著。此外，XP_006453957.1、XP_006458170.1在6 d時(shí)無顯著變化，10 d時(shí)出現(xiàn)下調(diào)，以及XP_006456371.1、XP_006463403.1等5個(gè)蛋白在6 d時(shí)變化不顯著，在10 d時(shí)發(fā)生上調(diào)。另外，有XP_006462684.1、XP_006453790.1等22個(gè)蛋白是兩組包裝在貯藏6 d與10 d時(shí)的共同差異蛋白，其中，有上調(diào)蛋白12個(gè)，下調(diào)蛋白10個(gè)。

2.5 生物信息學(xué)與通路分析

通過對(duì)差異蛋白的生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)納米包裝對(duì)雙孢蘑菇的能量代謝具有調(diào)控作用，在貯藏期間，相較于普通包裝，納米包裝組的雙孢蘑菇中ATP激酶（XP_006454339.1）與ATP結(jié)合蛋白（XP_006455684.1）均得到上調(diào)，延緩了納米組蘑菇的能量虧損。此外，線粒體作為真核生物產(chǎn)生能量的主要場所[25]，納米包裝組中的線粒體膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（XP_006454789.1）也呈上調(diào)趨勢(shì)，從而維持線粒體電子傳遞鏈的穩(wěn)態(tài)，延緩了雙孢蘑菇的衰老過程。另外，納米包裝對(duì)雙孢蘑菇細(xì)胞膜水平同樣具有調(diào)控作用，納米包裝組中的XP_006456371.1、XP_006454643.1和XP_006454671.1等膜組分蛋白均為上調(diào)。具體的膜脂代謝調(diào)控途徑如圖6所示，相較于普通包裝組，納米組雙孢蘑菇中的XP_006459152.1檸檬酸合酶（citrate synthase，CS）、XP_006453790.1脂肪酶（lipase，LPS）和XP_006462684.1磷脂酶D（phospholipase D，PLD）呈現(xiàn)下調(diào)，并且隨著貯藏時(shí)間的延長，它們?cè)?0 d時(shí)相比于6 d時(shí)下調(diào)更為顯著；而XP_006459063.1脂肪酸合酶（fatty acid synthase，F(xiàn)AS）、XP_006453826.1磷酸膽堿孢苷酰轉(zhuǎn)移酶（phosphocholine cytidylyltransferase，CTP）和XP_006456787.1磷脂酸磷酸酯酶（phosphatidate phosphatase，PPase）則呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)，相較于6 d，它們?cè)谫A藏末期（10 d）上調(diào)趨勢(shì)更顯著。

紅色表示上調(diào)，綠色表示下調(diào) Red means up-regulation, and green means down-regulation

表3 不同包裝組雙孢蘑菇貯藏期間主要差異表達(dá)蛋白

“/”表示該蛋白質(zhì)無顯著性變化 “/” means that the protein has no significant change

2.6 膜脂代謝差異表達(dá)蛋白的基因驗(yàn)證

通過對(duì)以上通路的分析，為了進(jìn)一步研究雙孢蘑菇貯藏期間膜脂代謝差異蛋白在基因水平的表達(dá)變化，對(duì)編碼CS、FAS、CTP、PLD、PPase和LPS的基因進(jìn)行qPCR驗(yàn)證。如圖7所示，的相對(duì)表達(dá)呈現(xiàn)出先降低后上升，又再降低的趨勢(shì)，這種變化可能是由于雙孢蘑菇在貯藏過程中脂代謝波動(dòng)所致[26]，而納米包裝組的表達(dá)始終顯著低于普通包裝組，這有利于維持貯藏過程中的脂類平衡；對(duì)于，納米包裝組的表達(dá)為先下降后略有上升，而普通包裝組總體上為下降趨勢(shì)，這表明納米包裝組可通過維持脂肪酸的合成能力來延緩雙孢蘑菇在貯藏過程中的脂肪酸降解；的表達(dá)總體呈下降趨勢(shì)，其中納米包裝組在6、8和10 d的表達(dá)要顯著高于普通包裝組，這有助于維持細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)；兩組包裝雙孢蘑菇的表達(dá)為先上升后下降趨勢(shì)，并且2、4、6和10 d時(shí)納米包裝組的表達(dá)水平要顯著低于普通包裝組，表明納米包裝抑制了的表達(dá)，進(jìn)而延緩了細(xì)胞膜的水解；的表達(dá)也呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，雙孢蘑菇通過提高的表達(dá)來延緩脂類的損失程度，其中納米包裝組的表達(dá)要高于普通包裝組，且在2、6和10 d達(dá)到顯著水平；在普通包裝組中為先上升后下降的趨勢(shì)，在6 d達(dá)到表達(dá)高峰，而納米包裝組則在2 d時(shí)有最高表達(dá)，而后降低，且在4、6、8和10 d顯著低于普通包裝組，表明納米包裝抑制了的表達(dá)，進(jìn)而緩解膜脂的降解。以上差異蛋白在基因水平的表達(dá)與組學(xué)結(jié)果相符，這再次表明，納米包裝可以通過調(diào)控以上蛋白的基因表達(dá)，進(jìn)而影響雙孢蘑菇的膜脂代謝途徑，以實(shí)現(xiàn)延緩其衰老和品質(zhì)劣變的目的。

圖7 不同包裝組雙孢蘑菇貯藏期間膜脂代謝途徑差異蛋白的qPCR分析

3 討論

3.1 納米包裝提升雙孢蘑菇采后的貯藏品質(zhì)

新鮮的雙孢蘑菇水分含量高、組織細(xì)嫩，且生理代謝旺盛[19]，尤其是采收后，蒸騰作用與呼吸代謝增強(qiáng)，使子實(shí)體老化加劇，極易發(fā)生褐變、失水萎蔫和破膜開傘等現(xiàn)象，最終導(dǎo)致品質(zhì)劣變[20]。本研究結(jié)果表明，與普通包裝相比，納米包裝有效維持了雙孢蘑菇采后的表觀品質(zhì)，在整個(gè)貯藏期間未發(fā)生明顯的褐變現(xiàn)象，筆者課題組前期的研究表明，納米包裝還能保持雙孢蘑菇的營養(yǎng)品質(zhì)，例如維持總糖和蛋白質(zhì)的含量[27]，從而延緩其采后衰老進(jìn)程。雙孢蘑菇在貯藏過程中，膜脂過氧化程度不斷加劇，導(dǎo)致細(xì)胞膜透性增大，嚴(yán)重破壞了細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)與功能，但納米包裝能延緩細(xì)胞膜透性的增加，丙二醛（MDA）是反映膜脂過氧化水平的重要指標(biāo)，在前期工作中，已經(jīng)對(duì)兩組包裝雙孢蘑菇的MDA含量變化進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)MDA含量隨貯藏時(shí)間的增加而升高，納米包裝組的MDA含量始終低于普通包裝組[27]，這也進(jìn)一步解釋了本研究中納米組細(xì)胞膜透性較低的原因，說明納米包裝有效緩解了雙孢蘑菇貯藏期間的膜脂過氧化，進(jìn)而延緩了細(xì)胞膜透性的增加，減少了細(xì)胞膜損傷，更有利于提升雙孢蘑菇的貯藏品質(zhì)。

3.2 納米包裝調(diào)控雙孢蘑菇的能量代謝和膜脂代謝

在貯藏過程中，兩組包裝的差異蛋白數(shù)量不斷增加，它們主要與能量代謝和脂代謝等途徑相關(guān)。ATP作為細(xì)胞最直接的能量供應(yīng)來源，對(duì)果蔬采后的正常生理代謝功能起著重要作用，而貯藏期間的能量不足則會(huì)加速新鮮蘑菇質(zhì)量的惡化[28]。在筆者前期的研究中，已經(jīng)證明納米包裝對(duì)食用菌貯藏期間能量代謝的調(diào)控作用[4,6,27,29-30]，采后4 d時(shí)納米包裝組雙孢蘑菇的呼吸速率比普通包裝組低9%；此外，納米包裝還緩解了其能荷的下降，在貯藏末期，納米組的雙孢蘑菇仍保持了較高的能荷水平。因此，本研究也再一次表明，納米包裝可以調(diào)控雙孢蘑菇的能量代謝，維持了其貯藏過程中的能量狀態(tài)，有助于保持雙孢蘑菇的正常生理功能和緩解采后衰老。

細(xì)胞膜將酶與底物隔開使細(xì)胞形成區(qū)室化分布，這對(duì)保持細(xì)胞正常的生理功能至關(guān)重要，研究表明，細(xì)胞膜損傷是導(dǎo)致果蔬品質(zhì)劣變的主要因素之一[31-32]。YAO等[33]通過甘氨酸甜菜堿處理西葫蘆，減少了膜脂過氧化程度，減輕了其冷害的發(fā)生；LIU等[34]發(fā)現(xiàn)，低溫貯藏荔枝果實(shí)，可降低其膜透性和膜磷脂的降解以延長貯藏時(shí)間。本研究發(fā)現(xiàn)納米包裝對(duì)雙孢蘑菇的膜脂代謝途徑同樣具有調(diào)控作用（圖6）。三羧酸循環(huán)是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、脂肪和糖相互關(guān)聯(lián)及轉(zhuǎn)化的樞紐，而乙酰輔酶A在這些代謝過程中起著關(guān)鍵作用[35]。一方面，CS作為三羧酸循環(huán)限速酶，可以催化乙酰輔酶A與草酰乙酸的縮合產(chǎn)物生成檸檬酸，后者再進(jìn)入三羧酸循環(huán)[36]；另一方面，乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A又在FAS系統(tǒng)的催化下生成脂肪酸進(jìn)入脂代謝[37]。而納米包裝組抑制了的表達(dá)，提高了的表達(dá)，減少雙孢蘑菇能量損耗，同時(shí)也有助于維持雙孢蘑菇體內(nèi)脂質(zhì)的平衡[38]。磷脂是細(xì)胞膜系統(tǒng)的主要成分，在細(xì)胞結(jié)構(gòu)、分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和膜流動(dòng)性中起關(guān)鍵作用，其中，磷脂酰膽堿（phosphatidylcholine，PC）和磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，PE）是維持細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的主要磷脂[39]，PC通過CDP-膽堿途徑合成，而CTP是其主要的限速酶[40]。在貯藏期間，相較于普通組，納米組的呈不斷上調(diào)趨勢(shì)，更有利于PC的合成，從而維持膜結(jié)構(gòu)；PLD作為磷脂代謝的起始酶，可以水解PC、PE等膜磷脂組分[41]，LPS也是參與磷脂水解的關(guān)鍵酶，可將甘油二酯轉(zhuǎn)化為游離脂肪酸[34]，這種由細(xì)胞膜磷脂水解所造成的膜結(jié)構(gòu)破壞，會(huì)最終導(dǎo)致膜功能的喪失，而納米包裝抑制了及的表達(dá)，從而減少了雙孢蘑菇的膜損傷。根據(jù)前期的研究，這種抑制作用可能是由于納米包裝調(diào)控了貯藏環(huán)境的氣體組成，加上納米材料具有抑菌和清除乙烯的作用，進(jìn)而改善雙孢蘑菇的內(nèi)源代謝和減少外部侵染所致[42]。另外，PLD水解過程會(huì)產(chǎn)生磷脂酸（phosphatidic acid，PA），PA的積累則會(huì)加劇膜脂過氧化程度[43]，而PPase作為磷酸酯酶的一種，能催化PA的水解生成二酰甘油，二酰甘油則是三酰甘油合成的關(guān)鍵前體物質(zhì)，有助于脂肪的合成[44]。因此，在納米包裝組雙孢蘑菇的高表達(dá)有效地維持了細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能。從基因?qū)用嫔峡?，這些差異蛋白的表達(dá)趨勢(shì)與組學(xué)結(jié)果相符，表明納米包裝能調(diào)控雙孢蘑菇的膜脂代謝，延緩細(xì)胞膜損傷，進(jìn)而維持細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)與功能，最終保持雙孢蘑菇的貯藏品質(zhì)。

4 結(jié)論

隨著貯藏時(shí)間的增加，兩組包裝的差異表達(dá)蛋白數(shù)目不斷增大，到貯藏10 d時(shí)，共鑒定差異表達(dá)蛋白148個(gè)。這些蛋白主要參與到能量代謝及脂代謝等代謝途徑。其中，納米包裝通過抑制、和的相對(duì)表達(dá)，以及提高、和的表達(dá)量，可延緩雙孢蘑菇在貯藏過程中的細(xì)胞膜損傷，有效緩解了其采后品質(zhì)劣變。

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Physiological Metabolic Role of Nanocomposite PackagedDuring Postharvest Cold Storage Analyzed by TMT-Based Quantitative Proteomics

1College of Food Science and Engineering, Nanjing University of Finance and Economics/Jiangsu Collaborative Innovation Center for Modern Grain Circulation and Safety/Key Laboratory of Grains and Oils Quality Control and Processing, Nanjing 210023;2College of Light Industry and Food Engineering, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037

【Background】() is prone to quality deterioration, such as umbrella opening, water loss, and browning after harvest, which seriously affects the storage quality and commercial value. Our previous research has confirmed that the nanocomposite packaging material (Nano-PM) could effectively delay the postharvest quality deterioration of, but the preservation mechanism is still unclear. 【Objective】In this study, the differentially expressed proteins ofin Nano-PM and polyethylene packaging material (Normal-PM) during storage were analyzed by Tandem Mass Tag (TMT) quantitative proteomics technology. The preservation mechanism of Nano-PM onwas further explored. 【Method】was taken as the research object. The Nano-PM was used for the preservation of, and the Normal-PM was used as the control. The protein extraction and trypsin hydrolysis were performed onduring storage. The differentially expressed proteins were screened by TMT labeling and liquid chromatography-tandem mass spectrometry detection. Combined with bioinformatics analysis, the main metabolic pathways involved in differential proteins were studied. Quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR) technology was used to determine the gene expression levels of differential proteins. 【Result】The Nano-PM effectively maintained the appearance quality ofand delayed the increase of cell membrane permeability. The number of differential proteins in two groups increased during storage. In the middle (6 d) and late (10 d) stages of storage, the numbers of differential proteins were 62 and 148, respectively. Among them, 22 differential proteins were common. Combined with bioinformatics analysis, these differential proteins were mainly related to pathways, such as energy metabolism and lipid metabolism. The lipid metabolism pathway was mainly analyzed, and the results showed that the Nano-PM had a regulatory effect on the membrane lipid metabolism of. Compared with the Normal-PM, the protein expression of fatty acid synthase, phosphorylcholine cytidylyltransferase, and phosphatidic acid phosphatase under Nano-PM were up-regulated, while the protein expression of key enzymes in membrane lipid degradation, such as phospholipase D and lipase, were down-regulated. At the gene level, the expression of genes encoding these proteins were consistent with the proteomics results. 【Conclusion】The differential proteins of different packagedduring storage could be screened and analyzed by TMT-based quantitative proteomics technology. Nano-PM regulated the membrane lipid metabolism of, and inhibited the expression of membrane lipid degradation-related enzymes, which effectively delayed the increase in cell membrane permeability of, maintained the structure and function of the cell membrane, and delayed the quality deterioration ofduring storage.

nanocomposite packaging;; preservation; proteomics

10.3864/j.issn.0578-1752.2022.23.013

2022-03-09；

2022-05-25

江蘇省自然科學(xué)基金（BK20201395）、江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目（PAPD）

王朝，E-mail：wangchaonufe@163.com。通信作者馬寧，E-mail：maning@nufe.edu.cn

（責(zé)任編輯 趙伶俐）