劉潮，盛妍妍，姜斌，盧旗陽(yáng)，韓利紅

（曲靖師范學(xué)院生物資源與食品工程學(xué)院/云南省高校特色果酒技術(shù)創(chuàng)新與應(yīng)用工程研究中心，云南曲靖 655011）

0 引言

【研究意義】靈芝屬（Ganoderma）隸屬于多孔菌科（Polyporaceae Fr.ex Corda），包含487個(gè)分類記錄（http：//www.indexfungorum.org/），廣泛分布于世界各地。一些靈芝屬物種富含多糖肽、靈芝酸、萜類、甾醇和生物堿等活性物質(zhì)，具有抗增殖、抗氧化、抗衰老、抗腫瘤和抗菌活性（Liu，2021）。由于分布廣泛及生活史的復(fù)雜性，靈芝屬真菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)多樣，導(dǎo)致物種分類困難，系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系混亂（Li et al.，2019b）。線粒體具有獨(dú)立的基因組，不同類群物種的線粒體基因組大小和復(fù)雜程度差異較大，由于具有單親遺傳和快速進(jìn)化等特征，線粒體基因組已成為真核生物物種起源、系統(tǒng)發(fā)育、分子進(jìn)化和群體遺傳等研究的有效工具（韓利紅等，2022a；康瑞萍等，2022）。因此，開展靈芝屬真菌線粒體基因組特征及進(jìn)化研究，對(duì)該屬真菌物種起源和資源開發(fā)利用均具有重要指導(dǎo)意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】靈芝屬真菌具有悠久的食藥用歷史，被視為中醫(yī)藥寶庫(kù)中的珍品。近年來，得益于潛在藥用價(jià)值的逐步挖掘，靈芝屬真菌被廣泛栽培，并逐步形成重要的產(chǎn)業(yè)。靈芝屬于1881年由芬蘭真菌學(xué)家Peter Adolph Karsten命名，模式種為亮蓋靈芝（Ganoderma lucidum），該物種在世界各地均有報(bào)道（戴玉成等，2013）。20世紀(jì)50年代，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所首次實(shí)現(xiàn)靈芝的人工栽培（李欽艷等，2016）。隨著靈芝需求量的快速增長(zhǎng)，多個(gè)性狀良好的靈芝菌株也陸續(xù)問世（Liu，2021）。其中，鐵杉靈芝（G.tsugae）的孢子粉和子實(shí)體切片，在亞洲長(zhǎng)期被用作提高免疫力的傳統(tǒng)藥材，紫芝（G.sinense）中提取的多糖和聚糖已被用作臨床藥物（Chan et al.，2017）。靈芝屬物種也是一類可引起針葉樹和闊葉樹木材腐爛的病原真菌，狹長(zhǎng)孢靈芝（G.boninense）的大型木質(zhì)子實(shí)體生長(zhǎng)在樹干上，具有降解木質(zhì)素和纖維素的能力，可引起樹木莖腐病，導(dǎo)致全球農(nóng)作物和林木的經(jīng)濟(jì)損失（Bharudin et al.，2022）。與非致病性靈芝屬的基因組相比，狹長(zhǎng)孢靈芝基因組中含有607個(gè)專有基因，可能在其宿主致病過程中發(fā)揮作用（Sulaiman et al.，2018）。亮蓋靈芝包含417個(gè)碳水化合物活性酶（Carbohydrateactive enzymes，CAZy）基因，其在木質(zhì)纖維素降解方面具有較高的潛力（Chen et al.，2012；Xu et al.，2021）。靈芝屬真菌子實(shí)體的外部形態(tài)特征和內(nèi)部顯微結(jié)構(gòu)分類難度大，研究中多結(jié)合分子生物學(xué)證據(jù)來輔助靈芝屬物種鑒定（Cao et al.，2012）。核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（Internal transcribed spacer，ITS）是物種分類研究的有效工具，基于ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育分析是靈芝屬物種分類的重要依據(jù)，但該分子標(biāo)記并未將屬下所有物種區(qū)分開（Fryssouli et al.，2020）。而真菌線粒體基因組序列在大型真菌的進(jìn)化和系統(tǒng)發(fā)育研究中發(fā)揮越來越重要的作用（韓利紅等，2022a）。一般情況下，線粒體基因組形成典型的環(huán)狀雙鏈結(jié)構(gòu)，編碼多個(gè)參與細(xì)胞呼吸的蛋白質(zhì)和RNA分子，大多數(shù)真菌線粒體基因組均包含15個(gè)蛋白編碼基因（Protein-coding gene，PCG）、2個(gè)rRNA編碼基因和26個(gè)tRNA編碼基因（Ye et al.，2020）。線粒體基因組通常屬于單親遺傳，導(dǎo)致不同譜系間基因重組機(jī)會(huì)較少（Liu，2021）。真菌線粒體基因組大小、基因排列、結(jié)構(gòu)、重復(fù)序列及內(nèi)含子數(shù)量等存在較大差異，一定程度上反映了真核生物的起源和物種進(jìn)化水平（Sandor et al.，2018；Li et al.，2019b）。在大多數(shù)真菌中，線粒體基因組在菌株和種群之間的遺傳變異水平總體上低于其核基因組（Sandor et al.，2018）。與部分基因片段相比，由完整線粒體基因組構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹的分辨率更高（Li et al.，2019b）。研究發(fā)現(xiàn)，蟲草屬（Cordyceps）線粒體基因組結(jié)構(gòu)保守，而變灰青霉（Penicillium canescens）線粒體基因組發(fā)生了基因重排，兩類真菌線粒體基因均主要受純化選擇影響（韓利紅等，2022a；康瑞萍等，2022），線粒體基因組序列可作為真菌物種分類的重要分子標(biāo)記（Wang et al.，2018；Ma et al.，2022）。茯苓（Wolfiporia cocos）線粒體基因組密碼子使用偏性研究為真菌物種分子進(jìn)化及轉(zhuǎn)基因研究提供了理論參考（韓利紅等，2022b）。【本研究切入點(diǎn)】隨著測(cè)序技術(shù)在真菌系統(tǒng)發(fā)育研究的深入，越來越多的真菌線粒體基因組被公布（Li et al.，2019b；Li et al.，2021；韓利紅等，2022a）。目前，鮮見有關(guān)靈芝屬線粒體基因組比較研究的相關(guān)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】基于已公布的靈芝屬線粒體基因組數(shù)據(jù)，利用生物信息學(xué)方法，對(duì)靈芝屬真菌的遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)行研究，以期為靈芝資源的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 序列獲取

從NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)下載靈芝屬物種11個(gè)線粒體基因組序列及注釋信息（表1）。此外，通過NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的SRA數(shù)據(jù)庫(kù)，下載狹長(zhǎng)孢靈芝（G.boninense）、G.wiiroense及Ganodermasp.物種共計(jì)4個(gè)基因組高通量測(cè)序數(shù)據(jù)，使用GetOrganelle軟件組裝獲得線粒體基因組scaffold序列，參考其他靈芝屬物種拼接為完整的線粒體基因組，使用Mitos2在線軟件（http：//mitos2.bioinf.uni-leipzig.de/index.py）進(jìn)行注釋。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組特征分析.利用MEGA X軟件統(tǒng)計(jì)線粒體基因組4種堿基構(gòu)成。利用MISA在線工具檢測(cè)SSR數(shù)量及位置分布，設(shè)置單核苷酸最小重復(fù)數(shù)10，二核苷酸5，三核苷酸4，四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸均為3。利用mVISTA在線軟件，以喜熱靈芝（G.calidophilum）線粒體基因組序列（MH252535）為參照，分析靈芝屬物種線粒體基因組序列變異情況。利用MAFFT軟件比對(duì)線粒體蛋白編碼基因串聯(lián)序列，使用DnaSP軟件分析線粒體蛋白編碼序列（Coding sequence，CDS）的核苷酸多樣性（Pi）。

1.2.2 基因進(jìn)化分析.利用PAML X軟件的CODEML算法，采用位點(diǎn)模型法對(duì)蛋白編碼基因正選擇位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，分析靈芝屬真菌線粒體基因的進(jìn)化情況。利用EMBOSS網(wǎng)站的cusp程序分析蛋白編碼基因的相對(duì)同義密碼子使用度（Relative synonymous codon usage，RSCU）。

1.2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析.以瓣環(huán)栓菌（Trametes cingulata）、胭脂紅栓孔菌（T.coccinea）、毛栓菌（T.hirsuta）、變色栓菌（T.versicolor）和長(zhǎng)絨毛栓菌（T.villosa）5個(gè)栓菌屬物種為外類群，使用MAFFT軟件進(jìn)行完整線粒體基因組多序列比對(duì)，通過IQ-TREE軟件基于最大似然法（Maximum likelihood，ML）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，建樹模型為GTR+F+R4，步長(zhǎng)值為1000。

2 結(jié)果與分析

2.1 線粒體基因組組成

靈芝屬真菌線粒體基因組大小為50603~124588 bp，平均82473 bp，其中喜熱靈芝（G.calidophilum）的線粒體基因組最大（124588 bp），其次是樹舌靈芝（119803 bp），以四川靈芝線粒體基因組最?。?0603 bp）。靈芝屬真菌線粒體基因組平均GC含量為26.7%，其中白肉靈芝（G.leucocontextum）線粒體基因組GC含量最高（27.3%），以喜熱靈芝最低（25.4%）。靈芝屬真菌線粒體基因組均含有15個(gè)保守的蛋白編碼基因，2個(gè)rRNA基因和25~29個(gè)tRNA基因（表1）。

2.2 重復(fù)序列分析結(jié)果

利用MISA對(duì)靈芝屬真菌線粒體SSR進(jìn)行分析，15個(gè)基因組中共檢測(cè)到628個(gè)SSR位點(diǎn)，單個(gè)基因組中平均含有42個(gè)（圖1）。其中，單核苷酸重復(fù)比例最高（37.9%），其次為三核苷酸重復(fù)和四核苷酸重復(fù)，分別占21.8%和22.6%，六核苷酸重復(fù)最少（2.9%）（圖1-A）。單核苷酸重復(fù)中，A/T型占比95.9%；二核苷酸重復(fù)中，AT/AT型占87.9%；三堿基重復(fù)中，AAT/ATT占89.7%；四堿基重復(fù)中，AAAT/ATTT和AATT/AATT分別占比78.8%和15.2%。SSR分析結(jié)果表明，靈芝屬線粒體基因組SSR主要由AT堿基構(gòu)成（圖1-B）。

圖1 靈芝屬線粒體基因組SSR類型及分布情況Fig.1 SSR type and distribution of mitochondrial genome of Ganoderma species

2.3 基因組序列多樣性分析結(jié)果

以喜熱靈芝線粒體基因組（MH252535）為參照，使用mVISTA軟件對(duì)靈芝屬線粒體基因組序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果（圖2）顯示，靈芝屬真菌線粒體基因組序列差異較大，非編碼區(qū)（內(nèi)含子和基因間隔區(qū)）的變異水平高于編碼區(qū)。靈芝屬真菌線粒體基因組大小和內(nèi)含子長(zhǎng)度呈線性正相關(guān)，線性相關(guān)系數(shù)（R2）為0.9626（P＜0.001）（圖3），表明線粒體基因組大小與內(nèi)含子密切相關(guān)，內(nèi)含子長(zhǎng)度的增加直接導(dǎo)致線粒體基因組的增大。利用DnaSP軟件分析靈芝屬線粒體蛋白編碼基因序列的多態(tài)性，結(jié)果（圖4）顯示，nad6、nad3和cob的Pi值均大于0.05，說明這些基因的編碼區(qū)序列的變異度較高，而atp8、atp9和nad4L的Pi值較低，表明這些基因的序列較保守。

圖2 靈芝屬線粒體基因組序列比較結(jié)果Fig.2 Comparison of mitochondrial genome sequences of Ganoderma species

圖3 靈芝屬線粒體基因組大小與內(nèi)含子長(zhǎng)度的相關(guān)分析Fig.3 Correlation analysis between mitochondrial genome sizes and intron lengths of Ganoderma species

圖4 靈芝屬線粒體蛋白編碼基因序列的多態(tài)性分析Fig.4 Polymorphism analysis of mitochondrial protein-coding gene sequences of Ganoderma species

2.4 密碼子使用偏性分析

對(duì)15個(gè)保守蛋白編碼基因的密碼子使用偏性分析結(jié)果顯示，27個(gè)密碼子屬于高頻密碼子（RSCU大于1.00），其中13個(gè)以A結(jié)尾，14個(gè)以T結(jié)尾（圖5）。每種氨基酸的高頻密碼子均為AT含量較高的密碼子。雖然精氨酸（Arg）和亮氨酸（Leu）均有6個(gè)密碼子，但均只有1個(gè)高頻密碼子，其中Arg密碼子AGA的RSCU達(dá)5.85，Leu密碼子TTA的RSCU為5.33。終止密碼子偏好使用TAA。

圖5 靈芝屬真菌線粒體基因組密碼子RSCU分布情況Fig.5 RSCU distribution of mitochondrial genome codon of Ganoderma fungi

2.5 基因進(jìn)化分析結(jié)果

利用PAML軟件對(duì)靈芝屬真菌線粒體基因組蛋白編碼基因的正選擇進(jìn)行分析，結(jié)果（圖6）顯示，15個(gè)保守蛋白編碼基因的非同義突變速率/同義突變速率比值（dN/dS）介于0（atp8和atp9）~0.72（cox1），均小于1.00，cox1和nad6基因的dN/dS比值明顯高于其他基因，表明進(jìn)化過程中靈芝屬線粒體蛋白編碼基因主要受純化選擇影響。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)貝葉斯分析，發(fā)現(xiàn)cob、cox1和nad2基因分別含有4、1和1個(gè)正選擇位點(diǎn)（概率＞0.95）（表2）。

表2 基于位點(diǎn)模型的靈芝屬真菌線粒體蛋白編碼基因正選擇分析Table 2 Positive selection analysis of mitochondrial protein-coding gene of Ganoderma fungi based on the site model

圖6 靈芝屬真菌線粒體蛋白編碼基因dN/dS分析Fig.6 dN/dS analysis of the mitochondrial protein-coding gene of Ganoderma fungi

2.6 系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果

基于完整線粒體基因組序列，以栓菌屬物種為外類群構(gòu)建靈芝屬物種的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，結(jié)果（圖7）顯示，靈芝屬物種主要分為2個(gè)聚類組，所有節(jié)點(diǎn)支持率均為100%，且同一物種的不同樣本聚類在一起。聚類組1由紫芝、狹長(zhǎng)孢靈芝和G.wiiroense構(gòu)成。聚類組2中，喜熱靈芝與白肉靈芝和鐵杉靈芝聚在一支，與樹舌靈芝、梅氏靈芝、四川靈芝和亮蓋靈芝構(gòu)成姊妹類群。

圖7 基于靈芝屬真菌線粒體基因組構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.7 Phylogenetic tree based on mitochondrial genome of Ganoderma fungi

3 討論

線粒體基因組是獨(dú)立于細(xì)胞核染色體外的另一基因組，在許多細(xì)胞過程中發(fā)揮重要功能。截至目前，多個(gè)靈芝屬真菌線粒體基因組已被公布（Li et al.，2013；Li et al.，2019b；Utomo et al.，2019）。研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)真菌線粒體基因組均含有14個(gè)能量代謝相關(guān)基因和1個(gè)rps3基因，構(gòu)成真菌線粒體基因組的核心蛋白編碼基因（Sandor et al.，2018）。靈芝屬真菌線粒體均含有15個(gè)保守的線粒體基因，而各基因組間的內(nèi)含子長(zhǎng)度和基因組序列等方面表現(xiàn)出高度的遺傳多樣性（Liu，2021）。真菌線粒體基因組大小的差異較大，主要與基因中內(nèi)含子的數(shù)量和長(zhǎng)度有關(guān)（Zhang et al.，2015；Sandor et al.，2018；Li et al.，2019b；Wang et al.，2021）。本研究結(jié)果表明，喜熱靈芝具有最大的線粒體基因組（124588 bp），四川靈芝和亮蓋靈芝基因組較小（50603~60635 bp），說明靈芝屬真菌的線粒體基因組在物種的進(jìn)化過程中發(fā)生了較大變化。靈芝屬真菌的線粒體基因組大小與內(nèi)含子長(zhǎng)度呈線性正相關(guān)，支持了以述前人研究結(jié)論。地衣至少經(jīng)歷了2次完整的線粒體基因組內(nèi)含子丟失，線粒體基因組減小和復(fù)雜性降低成為真菌專性共生的標(biāo)志特征（Pogoda et al.，2019）。蛹蟲草（Cordyceps militaris）線粒體基因組中的每個(gè)內(nèi)含子經(jīng)歷了1~4次插入或刪除事件，而內(nèi)含子含量的動(dòng)態(tài)變化可能與基因的水平轉(zhuǎn)移有關(guān)（Zhang et al.，2015；Wang et al.，2021）。湯氏多毛菌（Hirsutella thompsonii）的線粒體基因組內(nèi)含子可能經(jīng)歷了1~2個(gè)獲得或丟失事件，線粒體基因組大小受內(nèi)含子數(shù)目影響（Wang et al.，2018）。內(nèi)含子數(shù)量是玉米大斑病菌（Exserohilum turcicum）和嘴突凸臍蠕孢菌（E.rostratum）線粒體基因組大小差異的主要誘因（Ma et al.，2022），說明內(nèi)含子在真菌線粒體基因組進(jìn)化過程中發(fā)揮重要作用，是線粒體遺傳變異的關(guān)鍵因素。

GC含量直接影響基因組的突變和重組頻率，是物種進(jìn)化的重要參數(shù)（韓利紅等，2022c）。線粒體基因組GC含量較低，間接反映了密碼子的偏好性使用（Zhang et al.，2021）。靈芝屬真菌種間的線粒體基因組GC含量差異明顯，其中白肉靈芝GC含量較高，喜熱靈芝GC含量較低，可能與白肉靈芝主要生長(zhǎng)在溫度偏低的高原地區(qū)，而喜熱靈芝主要生長(zhǎng)在高溫的熱帶地區(qū)有關(guān)（Li et al.，2019b）。靈芝屬真菌的線粒體基因組GC含量（26.6%）高于鵝膏屬（Amanita）（24.6%）（Li et al.，2020a）和牛肝菌屬（Boletus）真菌（23.2%）（Li et al.，2021），而低于茯苓（34.8%）（Chen et al.，2020；韓利紅等，2022b）。本研究對(duì)15個(gè)蛋白編碼基因的密碼子使用偏性分析結(jié)果顯示，靈芝屬真菌偏好使用A/T結(jié)尾的密碼子，Arg和Leu有6個(gè)密碼子，但僅偏好使用AGA和TTA。De Queiroz等（2018）、Zhang等（2020）從廣東蟲草（Tolypocladium guangdongense）等其他真菌中也得出同樣的結(jié)論，而Li等（2019b）對(duì)5種靈芝的研究結(jié)果與本研究結(jié)論略有不同，可能是因?yàn)樵撗芯康幕蛑羞€包含了多個(gè)orf基因。真菌的線粒體基因組均偏好使用AT含量較高的密碼子，與基因組GC含量較低有直接關(guān)系?；蜻M(jìn)化分析結(jié)果顯示，靈芝屬真菌線粒體基因均受到純化選擇作用，與乳菇屬（Lactarius）（Li et al.，2019a）、蠟?zāi)伲↙accaria）（Li et al.，2020b）和栓菌屬（Chen et al.，2021）等物種研究結(jié)果類似。研究顯示，蟲草屬真菌細(xì)胞色素c氧化酶基因cox1在種群分化中起重要作用（Zhong et al.，2022）。靈芝屬真菌基因cox1的dN/dS比值達(dá)0.72，且存在正選擇位點(diǎn)，其可能在靈芝屬真菌環(huán)境適應(yīng)性進(jìn)化過程中發(fā)揮作用。

由于靈芝屬真菌在全球分布廣泛且物種多樣，容易發(fā)生名稱誤用，可靠的分子標(biāo)記是靈芝屬真菌物種分類和鑒定的重要基礎(chǔ)。我國(guó)早期的藥用真菌書籍多以G.lucidum記錄產(chǎn)自國(guó)內(nèi)的靈芝，而戴玉成等（2013）等研究認(rèn)為我國(guó)廣泛分布和栽培的靈芝與歐洲的G.lucidum并非同種，并將我國(guó)廣泛分布的靈芝命名為G.lingzhi（Cao et al.，2012）。本研究中，基于靈芝屬物種15個(gè)線粒體基因組序列獲得了一個(gè)支持良好的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，且系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示，紫芝、狹長(zhǎng)孢靈芝和G.wiiroense聚為一支（Utomo et al.，2019；Bharudin et al.，2022），而喜熱靈芝與白肉靈芝和鐵杉靈芝的親緣關(guān)系較近，樹舌靈芝、梅氏靈芝、四川靈芝和亮蓋靈芝則親緣關(guān)系較近。Wang等（2012）根據(jù)形態(tài)學(xué)和ITS+IGS+rpb2基因進(jìn)化組合分析，認(rèn)為亮蓋靈芝（G.lucidum）與四川靈芝（G.sichuanense）是同一物種，本研究認(rèn)為雖然二者聚類關(guān)系較近，卻不應(yīng)該劃分為同種，線粒體基因組可為靈芝屬物種分類提供有力分子系統(tǒng)發(fā)育證據(jù)。

4 結(jié)論

靈芝屬真菌的線粒體基因組在進(jìn)化過程中發(fā)生明顯的遺傳變異，基因組長(zhǎng)度主要與內(nèi)含子插入和刪除有關(guān)，蛋白編碼基因密碼子使用偏性強(qiáng)。