王璐, 張媛, 羅靜, 彭韶, 盛光耀

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科(河南鄭州 450052)

兒童潰瘍性結(jié)腸炎是發(fā)生在直腸與結(jié)腸的炎癥性腸病[1]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，潰瘍性結(jié)腸炎患兒腸黏膜組織內(nèi)存在免疫炎癥細(xì)胞浸潤，如單核巨噬細(xì)胞等，其主要癥狀為腹痛、腹瀉、便血等，嚴(yán)重時(shí)會(huì)出現(xiàn)消化道穿孔、腸梗阻等[2-3]。近幾年，隨著我國人民生活方式改變，兒童潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病率逐年上升，且與成人相比，兒童更易出現(xiàn)較為嚴(yán)重的潰瘍性結(jié)腸炎，病情易遷延不愈[4]。目前潰瘍性結(jié)腸炎病因尚不明確，但大部分學(xué)者認(rèn)為與自身免疫失調(diào)、環(huán)境因素等有關(guān)[5]。兒童潰瘍性結(jié)腸炎主要治療方法包括免疫治療、手術(shù)治療等，但部分患兒經(jīng)治療后出現(xiàn)難治性、復(fù)發(fā)性潰瘍性結(jié)腸炎，導(dǎo)致治療失敗[6]。因此，尋找潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病機(jī)制，對(duì)于控制潰瘍性結(jié)腸炎復(fù)發(fā)有重要意義。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)廣泛存在于血漿、血清及組織中，其可調(diào)節(jié)機(jī)體免疫炎癥反應(yīng)等[7]。?；撬嵘险{(diào)基因1(taurine up-regulated gene 1，TUG1)具有炎癥反應(yīng)的作用[8]。血漿lncRNA TUG1在冠心病患者中表達(dá)上調(diào)，且與白細(xì)胞介素(interleukin，IL)6表達(dá)水平呈正相關(guān)[9]。猜測lncRNA TUG1可能在潰瘍性結(jié)腸炎中也發(fā)揮作用。因此，本研究擬納入89例潰瘍性結(jié)腸炎患兒，分析lncRNA TUG1在潰瘍性結(jié)腸炎患兒血清中的表達(dá)及臨床意義，以期為臨床上研究潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2018年10月至2020年1月本院收治的活動(dòng)期潰瘍性結(jié)腸炎患兒89例(研究組)，男48例，女41例，年齡6～12歲，平均(8.85±2.03)歲。病發(fā)部位：直腸11例，左側(cè)結(jié)腸14例，廣泛結(jié)腸64例。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合2010版《兒童炎癥性腸病診斷規(guī)范共識(shí)意見》中兒童潰瘍性結(jié)腸炎[10]診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)兒童潰瘍性結(jié)腸炎疾病活動(dòng)指數(shù)(Pediatric ulcerative colitis activity，PUCAI)≥10分；(3)患兒家長能全面了解、描述患兒近期飲食情況；(4)患兒家長知情同意并簽署知情同意書。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并活動(dòng)性結(jié)核；(2)合并結(jié)腸穿孔、腸道細(xì)菌性感染、病毒性感染腸炎；(3)合并惡性腫瘤；(4)合并嚴(yán)重心、肝、腎障礙性疾病；(5)伴有自身免疫性疾病。

同期選擇在本院體檢的健康兒童101例為對(duì)照組，男52例，女49例，年齡6～12歲，平均(8.63±2.11)歲。研究組、對(duì)照組性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意(SS-2018-36)。

1.2 內(nèi)鏡下潰瘍性結(jié)腸炎嚴(yán)重程度評(píng)價(jià) 采用PUCAI評(píng)價(jià)病情程度[4]，輕度活動(dòng)期為10～34分，中度活動(dòng)期為35～64分，重度活動(dòng)期為65～85分。PUCAI總分范圍為0～85分，PUCAI分值越高，表示疾病活動(dòng)性越強(qiáng)。依據(jù)PUCAI將活動(dòng)期潰瘍性結(jié)腸炎患者分為輕度組(10～34分)36例，中度組(35～64分)31例，重度組(65～85分)22例。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集 采集健康兒童體檢當(dāng)天和潰瘍性結(jié)腸炎兒童入院檢查時(shí)清晨空腹靜脈血3～4 mL，離心(4℃，3 000 r/min，25 min)，留上清，凍存于-80℃冰箱。

1.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測血清中l(wèi)ncRNA TUG1表達(dá) 用總RNA提取試劑盒(購于北京索萊寶科技有限公司)提取總血清RNA，然后用nanodrop1000微量紫外可見分光光度計(jì)(購于美國NanoDrop Tech公司)測定RNA分別在280 nm和260 nm處吸光度，并計(jì)算A260/280值，A260/280值介于1.8～2.0，表示提取的RNA可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)探究。用Qiagen逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(購于德國Qiagen公司)逆轉(zhuǎn)錄RNA合成cDNA。用HieffTM qPCR SYBR? Green Master Mix(購于翌圣生物科技(上海)股份有限公司)建立25 μL熒光反應(yīng)體系，引物由擎科生物科技有限公司合成，見表1。用7300實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(購于美國ABI公司)對(duì)lncRNA TUG1及內(nèi)參β-actin進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)條件：95℃，3 min；95℃，30 s；59℃，30 s；72℃，40 s；35個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt算法計(jì)算lncRNA TUG1的相對(duì)表達(dá)量。

表1qRT-PCR引物序列

1.3.3 酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA)檢測血清中IL-1β、IL-6水平 用ELISA法檢測血清IL-1β、IL-6水平，操作步驟依據(jù)IL-1β、IL-6 ELISA試劑盒(購于美國abcam公司)詳細(xì)步驟說明書。

1.4 隨訪 所有患兒出院后，隨訪2年，隨訪方式為門診復(fù)查或電話隨訪。隨訪內(nèi)容為：記錄患兒病情復(fù)發(fā)情況，分為復(fù)發(fā)組52例和未復(fù)發(fā)組37例。隨訪終點(diǎn)為患兒潰瘍性結(jié)腸炎復(fù)發(fā)或隨訪結(jié)束。復(fù)發(fā)定義[11]：患兒經(jīng)治療進(jìn)入緩解期后，隨訪中表現(xiàn)出臨床癥狀加重，需要增加藥量或改用其他藥物控制，或需要外科干預(yù)治療。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料用例(%)表示，采用2檢驗(yàn)。計(jì)量資料符合正態(tài)分布，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組比較行單因素方差分析，兩組間均數(shù)進(jìn)一步相比行SNK-q檢驗(yàn)。Pearson法分析血清lncRNA TUG1與IL-1β、IL-6的相關(guān)性。用受試者工作特征(ROC)曲線評(píng)價(jià)血清lncRNA TUG1水平診斷潰瘍性結(jié)腸炎的價(jià)值。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組細(xì)胞因子IL-1β和IL-6的ELISA檢測水平的比較 與對(duì)照組相比，研究組血清IL-1β、IL-6水平較高(P<0.05)，見表2。

表2 細(xì)胞因子IL-1β和IL-6的ELISA檢測水平的比較

2.2 兩組血清lncRNA TUG1 PCR檢測水平比較 與對(duì)照組相比，研究組血清lncRNA TUG1相對(duì)表達(dá)水平較高(P<0.05)，見表3。

表3 兩組血清lncRNA TUG1 PCR檢測水平比較

2.3 亞組血清lncRNA TUG1 PCR檢測水平比較 與輕度組比較，中度組、重度組血清lncRNA TUG1相對(duì)表達(dá)水平較高(P<0.05)，與中度組比較，重度組血清lncRNA TUG1相對(duì)表達(dá)水平較高(P<0.05)，見表4。

2.4 研究組血清中l(wèi)ncRNA TUG1 PCR水平與IL-1β、IL-6 ELISA水平相關(guān)性分析Pearson法分析顯示，血清中l(wèi)ncRNA TUG1 PCR水平與IL-1β、IL-6 ELISA水平呈正相關(guān)(r=0.544，P=0.000；r=0.714，P=0.000)，見圖1～2。

表4 亞組血清lncRNA TUG1 PCR檢測水平比較

圖1 血清lncRNA TUG1表達(dá)水平與IL-1β相關(guān)性分析

圖2 血清lncRNA TUG1表達(dá)水平與IL-6相關(guān)性分析

2.5 血清lncRNA TUG1表達(dá)水平診斷潰瘍性結(jié)腸炎的敏感度和特異度 ROC曲線顯示，lncRNA TUG1診斷潰瘍性結(jié)腸炎的曲線下面積(area under curve，AUC)為0.861(95%CI:0.802～0.920)，其敏感度為82.00%，特異度為89.10%。見圖3。

圖3 血清lncRNA TUG1表達(dá)水平診斷潰瘍性結(jié)腸炎的ROC曲線

2.6 復(fù)發(fā)組和未復(fù)發(fā)組血清lncRNA TUG1表達(dá)水平比較 與未復(fù)發(fā)組比較，復(fù)發(fā)組血清lncRNA TUG1相對(duì)表達(dá)水平較高(P<0.05)，見表5。

表5 復(fù)發(fā)組和未復(fù)發(fā)組血清lncRNA TUG1表達(dá)水平比較

3 討論

兒童潰瘍性結(jié)腸炎是炎癥性腸病，病變多累及結(jié)腸黏膜及黏膜下層，病理上由直腸連續(xù)擴(kuò)散至結(jié)腸甚至全結(jié)腸[12]。潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病機(jī)制已在免疫細(xì)胞活化、炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)及環(huán)境等方面展開研究，但目前仍未清楚其發(fā)病機(jī)制[13]。Chapuy等[14]研究顯示，潰瘍性結(jié)腸炎結(jié)腸黏膜中炎癥反應(yīng)依賴于IL-1β表達(dá)水平升高。張鏢等[15]研究顯示，IL-1β、IL-6在潰瘍性結(jié)腸炎小鼠中具有重要作用，可影響病情進(jìn)展。本研究顯示，研究組血清IL-1β、IL-6水平明顯高于對(duì)照組，提示活動(dòng)期潰瘍性結(jié)腸炎患兒體內(nèi)存在炎癥。

lncRNA已被證明是調(diào)控染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的重要因子，通過與染色質(zhì)、轉(zhuǎn)錄因子、RNA和蛋白質(zhì)的相互作用發(fā)揮其功能[16]。lncRNA可通過調(diào)控NF-κB信號(hào)通路、炎癥反應(yīng)等生理過程而參與潰瘍性結(jié)腸炎病理過程[17]。lncRNA TUG1是一種有價(jià)值的lncRNA，在多種人類疾病中發(fā)現(xiàn)其表達(dá)失調(diào)[18]。Tian等[19]研究顯示，在潰瘍性結(jié)腸炎小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，TUG1過表達(dá)通過抑制 miR-29b-3p表達(dá)，促進(jìn)CDK2 表達(dá)，從而促進(jìn)結(jié)腸上皮細(xì)胞增殖并抑制結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡，最終減弱了小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的進(jìn)展。本研究顯示，研究組血清lncRNA TUG1相對(duì)表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，且輕度組、中度組、重度組血清lncRNA TUG1相對(duì)表達(dá)水平依次顯著升高，提示lncRNA TUG1可能參與兒童活動(dòng)期潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生、發(fā)展。但本研究結(jié)果與Tian等[19]結(jié)果不同，可能因?yàn)槿伺c小鼠是不同物種，TUG1表達(dá)結(jié)果不一致。李彥等[20]研究顯示，膿毒癥大鼠肺組織中l(wèi)ncRNA TUG1呈高表達(dá)，lncRNA TUG1高表達(dá)通過下調(diào)miR-26a而促進(jìn)脂多糖誘導(dǎo)的單核巨噬細(xì)胞細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)。Yue等[21]研究顯示，多發(fā)性硬化癥小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞中，lncRNA TUG1呈高表達(dá)，并促進(jìn)腫瘤壞死因子-α、IL-6水平表達(dá)增加，此過程依賴于lncRNA TUG1促進(jìn)NF-κB信號(hào)通路。本研究進(jìn)一步研究顯示，lncRNA TUG1與IL-1β、IL-6呈正相關(guān)，提示lncRNA TUG1可能通過影響患兒體內(nèi)炎癥進(jìn)而影響兒童病情。猜測lncRNA TUG1可能通過影響某種機(jī)制來影響患兒體內(nèi)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致兒童活動(dòng)期潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)生。Zhu等[22]研究顯示，lncRNA TUG1在慢性心力衰竭患者血清中呈上調(diào)，對(duì)慢性心力衰竭具有一定的診斷價(jià)值，并且可評(píng)估慢性心力衰竭患者2年生存率。ROC曲線顯示，lncRNA TUG1診斷潰瘍性結(jié)腸炎的AUC為0.861，其敏感度為82.00%，特異度為89.10%，提示血清lncRNA TUG1對(duì)兒童活動(dòng)期潰瘍性結(jié)腸炎具有診斷價(jià)值，可為兒童活動(dòng)期潰瘍性結(jié)腸炎的診斷提供參考。為探究lncRNA TUG1與潰瘍性結(jié)腸炎患兒預(yù)后關(guān)系，本研究發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)組血清lncRNA TUG1相對(duì)表達(dá)水平顯著高于未復(fù)發(fā)組，提示lncRNA TUG1水平變化可能對(duì)活動(dòng)期潰瘍性結(jié)腸炎預(yù)后也有影響。綜合本研究，猜測lncRNA TUG1可能與兒童活動(dòng)期潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病機(jī)制有關(guān)，可為臨床上兒童活動(dòng)期潰瘍性結(jié)腸炎的的診斷提供指導(dǎo)。

綜上所述，潰瘍性結(jié)腸炎患兒血清lncRNA TUG1表達(dá)水平上升，lncRNA TUG1對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎具有診斷價(jià)值，可能影響患兒體內(nèi)炎癥反應(yīng)及預(yù)后。但本研究尚未深入探究lncRNA TUG1影響兒童活動(dòng)期潰瘍性結(jié)腸炎的機(jī)制，后續(xù)仍需探究。

利益相關(guān)聲明：所有作者均聲明不存在任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)說明：王璐、彭韶：負(fù)責(zé)提出研究選題、設(shè)計(jì)研究方案、實(shí)施研究過程、采集整理和分析數(shù)據(jù)；王璐、張媛、羅靜：負(fù)責(zé)調(diào)研整理文獻(xiàn)、設(shè)計(jì)論文框架、起草論文、修訂論文、終審論文；王璐、盛光耀：負(fù)責(zé)獲取研究經(jīng)費(fèi)、技術(shù)或材料支持和指導(dǎo)性支持。