李素萍，喻達(dá)輝，李應(yīng)清，王 培，郭 穎，白麗蓉

(北部灣大學(xué)海洋學(xué)院，廣西北部灣海洋生物多樣性養(yǎng)護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西欽州 535011)

雙殼類動(dòng)物的貝殼都是鈣代謝產(chǎn)物，含有90%以上的CaCO3晶體和百分之幾的生物大分子基質(zhì)[1]。近10年，人們?yōu)殛U明殼的形成機(jī)制作出了許多努力，已從雙殼貝類中鑒定出10余種基質(zhì)蛋白[2-5]。然而，以往對(duì)貝殼形成的分子機(jī)制研究集中于基質(zhì)蛋白的純化和表征上，而忽略了貝類鈣代謝的機(jī)制。鈣離子不僅是參與雙殼類動(dòng)物許多生理過程的調(diào)節(jié)劑，而且是參與殼結(jié)構(gòu)形成的主要陽(yáng)離子，在貝殼的形成過程中，需要大量的鈣離子不斷沉積在基質(zhì)蛋白形成的骨架上[6]。Ca2+攝取、積累、轉(zhuǎn)運(yùn)、摻入的機(jī)制以及這些過程中涉及的特定調(diào)節(jié)劑仍然是一個(gè)有吸引力的領(lǐng)域，有待進(jìn)一步研究。

鈣調(diào)蛋白(Calmodulin，CaM)是一種主要的細(xì)胞內(nèi)鈣受體，存在于許多不同的細(xì)胞類型中，是動(dòng)物中最保守的蛋白質(zhì)之一。CaM以鈣離子(Ca2+)依賴性方式結(jié)合并調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶。它參與一系列細(xì)胞過程，包括分泌、細(xì)胞分裂和分化、DNA復(fù)制和修復(fù)、肌肉收縮和糖原代謝、滲透細(xì)胞體積調(diào)節(jié)和細(xì)胞內(nèi)通訊[7]。在高等脊椎動(dòng)物中，CaM由多種基因編碼，如人和小鼠的CaM I、II和III，雞的CaM I和II[8-9]。在雙殼類生物中，鈣調(diào)蛋白可以調(diào)節(jié)Ca2+-ATPase膜系統(tǒng)來(lái)捕獲環(huán)境中的Ca2+，細(xì)胞外CaM或CaM樣蛋白(CaMLP)和CaM或CaMLP結(jié)合蛋白被認(rèn)為在生物礦化中起重要作用[10-11]。CaM基因在外套膜裙帶及外套膜外表皮上高表達(dá)，外套膜主要參與貝殼形成過程中Ca2+的分泌，因此，雙殼類動(dòng)物體內(nèi)的CaM不僅是參與許多生理過程的調(diào)控，而且是貝殼結(jié)構(gòu)形成的主要調(diào)控因素[12]。

香港牡蠣(Crassostreahongkongensis)分布于我國(guó)南部沿海，是兩廣地區(qū)最常見、最主要的牡蠣養(yǎng)殖種類之一，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[13-15]。但香港牡蠣生長(zhǎng)速度緩慢，養(yǎng)殖周期長(zhǎng)，沿海地區(qū)臺(tái)風(fēng)頻繁，牡蠣養(yǎng)殖深受其害，常常造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，故在香港牡蠣的養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中，一直存在著提高生長(zhǎng)速度、縮短養(yǎng)殖周期的強(qiáng)烈需求[16]。香港牡蠣的生長(zhǎng)與貝殼形成密切相關(guān)，為提高香港牡蠣生長(zhǎng)速度、縮短養(yǎng)殖周期，加快貝殼的形成，探究貝殼形成的分子礦化機(jī)制是重中之重[17-19]。目前，CaM作為生物體內(nèi)重要的調(diào)控蛋白，是貝殼形成的主要調(diào)控因素，因此以香港牡蠣為研究對(duì)象，對(duì)香港牡蠣貝殼形成的分子礦化機(jī)制進(jìn)行研究。

筆者采用RACE技術(shù)克隆了香港牡蠣CaM基因cDNA全長(zhǎng)序列，并分析其核酸和氨基酸序列，預(yù)測(cè)CaM二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，并采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)香港牡蠣CaM基因在不同組織中的表達(dá)情況，對(duì)香港牡蠣CaM基因的功能進(jìn)行深入研究，旨在為研究香港牡蠣貝殼形成機(jī)制及CaM基因蛋白功能研究提供分子理論基礎(chǔ)，為生產(chǎn)實(shí)踐提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料香港牡蠣采集于廣西欽州市東風(fēng)市場(chǎng)，取其新鮮的外套膜、鰓、閉殼肌、性腺、心臟、血淋巴、觸唇和消化腺8個(gè)組織立即放入液氮速凍，置-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 總RNA提取與cDNA的合成取香港牡蠣的閉殼肌、外套膜、鰓、血液、性腺、心臟、觸唇和消化腺8個(gè)組織用研磨儀研磨，參照TransZol Up Plus RNA Kit試劑盒(全式金)提取總RNA，使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)RNA的完整性并用Little Lunatic(USA)測(cè)定其濃度，用TransScript II One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix反轉(zhuǎn)錄試劑盒(全式金)合成模板cDNA，置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 RACE獲得香港牡蠣CaM基因cDNA全長(zhǎng)根據(jù)GenBank中已知的太平洋牡蠣(Crassostreagigas)CaM基因cDNA全長(zhǎng)序列，設(shè)計(jì)特異性引物CaM-F和CaM-R，擴(kuò)增出目的片段，反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，運(yùn)行35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。PCR產(chǎn)物用DNA膠回收試劑盒(TIANGEN)純化，參照pEASY?-T1 Cloning Kit(全式金)說(shuō)明書進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化，陽(yáng)性克隆送生工生物工程(上海)有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與長(zhǎng)牡蠣CaM基因cDNA序列比對(duì)，相似性極高。

根據(jù)測(cè)序出的目的片段設(shè)計(jì)5′RACE和3′RACE擴(kuò)增的基因特異性引物，參照5′RACE試劑盒(北京百奧博萊科技)說(shuō)明進(jìn)行上游未知片段擴(kuò)增，利用引物5′RACE-A將模板RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，模板cDNA經(jīng)加帽反應(yīng)使用引物5′RACE-B進(jìn)行第1輪反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃變性5 min；50 ℃退火2 min，72 ℃延伸4 min，進(jìn)行1個(gè)循環(huán)；94 ℃變性40 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸3 min，進(jìn)行29個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸15 min。以稀釋20倍的第1輪PCR產(chǎn)物為模板，用引物5′RACE-C進(jìn)行第2輪反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃變性40 s；55 ℃退火1 min，72 ℃延伸3 min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸15 min。

參照3′RACE試劑盒(北京百奧博萊科技)說(shuō)明進(jìn)行下游未知片段擴(kuò)增，使用引物3′RACE-A進(jìn)行第1輪反應(yīng)，反應(yīng)條件為：55 ℃ 2 min，72 ℃ 40 min，1個(gè)循環(huán)；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸3 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 15 min。以稀釋20倍的第1輪PCR產(chǎn)物為模板，引物3′RACE-B進(jìn)行第2輪反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 40 s；55 ℃ 1 min，72 ℃ 3 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸15 min。將2輪反應(yīng)之后的5′RACE和3′RACE PCR產(chǎn)物分別進(jìn)行膠回收后進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化，陽(yáng)性克隆送生工生物工程(上海)有限公司測(cè)序。引物序列見表1。

表1 試驗(yàn)所用引物序列Table 1 Sequences of primers in this study

1.4 生物信息學(xué)分析利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的Blast(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)、ORFfinder(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)和ChromasPro.2.1.3等軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證分析并拼接出全長(zhǎng)cDNA序列。使用ProtParam(http：//web.expasy.org/protparam/)預(yù)測(cè)該蛋白的基本理化性質(zhì)；使用Soft Berry-Psite(http：//linux1.softberry.com/berry.phtml)預(yù)測(cè)蛋白功能位點(diǎn)；使用Signa1P 4.1 Server(http：//www.cbs.dtu.dk/services/Sig-nalP)預(yù)測(cè)信號(hào)肽序列；使用TMpred(http：//www.cbs.dtudk/services/TMHMM)預(yù)測(cè)跨膜結(jié)構(gòu)域；使用SMART(http：//smart.embl-heidelberg.de/)預(yù)測(cè)該蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域；使用SOPMA(https：//npsa-prabi.ibcp.fr/NPSA/npsa_sopma.html)和SWISS-MODEL(https：//swissmodel.expasy.org/interactive)分別預(yù)測(cè)該蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)；使用PSORTⅡPrediction軟件(https：//psort.hgc.jp/form2.html)進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析；使用Clustalx1.81軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)；使用MEGA 7.0軟件的鄰接法(neighbor-joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，進(jìn)化距離的計(jì)算采用Kimura雙參數(shù)模式。

1.5 熒光定量PCR分析以香港牡蠣8個(gè)組織的cDNA為模板，根據(jù)全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)定量引物qRTCaM-F和qRTCaM-R，以GAPDH為內(nèi)參基因，每個(gè)樣品進(jìn)行3次重復(fù)。參照TransStart? Tip Green qPCR SuperMix熒光定量試劑盒(全式金)進(jìn)行qRT-PCR，反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性30 s；94 ℃變性5 s，55 ℃退火15 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 s。數(shù)據(jù)由Roche LightCycler 96軟件生成并記錄，按照2-ΔΔCt計(jì)算組織表達(dá)水平，采用SPSS 22軟件進(jìn)行單因素方差分析法(one-way ANOVA)，Tukey檢驗(yàn)，P<0.05表示顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 香港牡蠣CaM基因cDNA全長(zhǎng)序列以香港牡蠣的cDNA為模板，使用RACE試劑盒獲得香港牡蠣鈣調(diào)蛋白ChCaM基因序列全長(zhǎng)cDNA(Gen Bank登錄號(hào)為：MZ192519)，其全長(zhǎng)為770 bp，開放閱讀框(Open reading frame，ORF)為450 bp，5′非編碼區(qū)(5′-UTR)54 bp及3′非編碼區(qū)(3′-UTR)266 bp，香港牡蠣CaM基因編碼149個(gè)氨基酸。通過SMART在線分析軟件預(yù)測(cè)香港牡蠣CaM含有4個(gè)EF-hand結(jié)構(gòu)域，分別位于12～40、48～76、85～113、121～149位氨基酸(圖1)。針對(duì)香港牡蠣CaM蛋白質(zhì)進(jìn)行理化性質(zhì)分析，發(fā)現(xiàn)氨基酸理論分子量為16.82 kD，帶正電荷的氨基酸殘基(Arg+Lys)有15個(gè)，帶負(fù)電荷的氨基酸殘基(Asp+Glu)有38個(gè)，理論等電點(diǎn)為4.14。該蛋白脂溶指數(shù)(Aliphatic index)為64.83，親水性(GRAVY)總平均值為-0.656，半衰期約為30 h，不穩(wěn)定指數(shù)為31.08，因此該蛋白是一類穩(wěn)定的親水性蛋白質(zhì)。Soft Berry-Psite預(yù)測(cè)該蛋白功能位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)香港牡蠣CaM具有2個(gè)N-肉豆蔻酰化位點(diǎn)，7個(gè)酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)，2個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)和1個(gè)N-糖基化位點(diǎn)(圖2)。使用SignalP 4.1 Server程序未能預(yù)測(cè)到信號(hào)肽信號(hào)；使用TMpred軟件未發(fā)現(xiàn)跨膜結(jié)構(gòu)，不屬于跨膜蛋白；利用PSORTⅡPrediction軟件對(duì)香港牡蠣CaM蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析發(fā)現(xiàn)該蛋白在細(xì)胞質(zhì)中分布最多，占52.2%，在分泌系統(tǒng)小泡中分布最少，為4.3%，細(xì)胞核和線粒體中分別為30.4%和13.0%。

注：方框表示起始密碼子和終止密碼子，綠色陰影部分為鈣調(diào)蛋白結(jié)構(gòu)域，黃色陰影部分為AATAAA加尾信號(hào) Note：The boxes represent the start and stop codons，the green area represents the calmodulin domain，and the yellow area represents the AATAAA tail addition signal圖1 香港牡蠣CaM基因的核酸序列和氨基酸序列Fig.1 Nucleotide and deduced amino acid sequence from ChCaM gene

圖2 香港牡蠣CaM的功能位點(diǎn)預(yù)測(cè)Fig.2 Prediction of functional site of ChCaM

2.2 香港牡蠣CaM結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)使用SOPMA工具對(duì)香港牡蠣CaM蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，CaM預(yù)測(cè)蛋白包含59.73% α螺旋(alpha helix)、6.04%延伸鏈(extended strand)、9.40% β轉(zhuǎn)角(beta turn)和24.83%不規(guī)則卷曲(random coil)(圖3)。通過SWISS-MODEL對(duì)香港牡蠣和人的CaM基因編碼的蛋白進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)模擬，模擬發(fā)現(xiàn)二者蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)相似性極高(圖4)。

注：藍(lán)色.α螺旋;紅色.延伸鏈;綠色.β轉(zhuǎn)角;粉紅.不規(guī)則卷曲 Note：Blue.Alpha helix;Red.Extended strand;Green.Beta turn;Pink.Random coil圖3 香港牡蠣CaM蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.3 Predicted two-dimensional structure of ChCaM

注：a.香港牡蠣；b.人；c.疊加 Note：a.Crassostrea hongkongensis;b.Homo sapiens;c.Overlay圖4 CaM蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.4 Predicted three-dimensional structure of CaM

2.3 香港牡蠣CaM氨基酸序列同源性從NCBI下載11個(gè)其他物種CaM氨基酸序列(表2)，經(jīng)DNAstar軟件對(duì)香港牡蠣與其他物種的CaM進(jìn)行氨基酸序列同源性分析(圖5)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)香港牡蠣和長(zhǎng)牡蠣的CaM同源性最高，相似度高達(dá)100%，美洲牡蠣次之，達(dá)到98.7%，其他物種的相似度為93%～97%。運(yùn)用DNAMAN軟件將香港牡蠣CaM的氨基酸序列與其他已公布的8種生物進(jìn)行多重序列比對(duì)分析(圖6)，結(jié)果顯示，香港牡蠣CaM氨基酸序列與長(zhǎng)牡蠣和美洲牡蠣有較高的相似性，而與魚類、甲殼類和哺乳動(dòng)物序列相似性相對(duì)較低；CaM氨基酸排序呈現(xiàn)很高的相似性和高度保守性。結(jié)果表明，CaM的氨基酸序列具有典型的鈣調(diào)蛋白特征(EF-hand結(jié)構(gòu)域)，發(fā)現(xiàn)以上9個(gè)物種均有4個(gè)EF-hand結(jié)構(gòu)域(I、II、III和IV)，且它們表現(xiàn)出彼此的序列同源性。每個(gè)結(jié)構(gòu)域由12個(gè)氨基酸殘基組成，其中6個(gè)作為金屬-蛋白質(zhì)復(fù)合物中Ca2+的配體[如天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)]。CaM基因所編碼的氨基酸序列高度保守，尤其表現(xiàn)在EF-hand結(jié)構(gòu)域Ca2+結(jié)合位點(diǎn)上，暗示CaM基因在機(jī)體中有極其重要的功能和作用。

2.4ChCaM基因系統(tǒng)進(jìn)化樹為比較不同物種CaM基因序列的親緣關(guān)系，從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中查找其他物種CaM基因cDNA序列，用MEGA 7.0軟件構(gòu)建ChCaM與其他物種的系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖7)，結(jié)果顯示，香港牡蠣CaM與長(zhǎng)牡蠣的遺傳距離最近，并與美洲牡蠣、蝦夷扇貝和池蝶蚌等雙殼類動(dòng)物聚為一大支，具有較高的同源性，而與文昌魚和虹鱒等魚類、人和小鼠等哺乳動(dòng)物以及中華絨螯蟹和克氏原螯蝦等甲殼類動(dòng)物分支較長(zhǎng)，距離較遠(yuǎn)，同源性較低。

2.5 香港牡蠣CaM基因的組織特性表達(dá)使用SPSS 22.0軟件進(jìn)行單因素分析，通過實(shí)時(shí)定量PCR的方法檢測(cè)香港牡蠣CaM mRNA在各個(gè)組織中的表達(dá)量，結(jié)果表明，CaM基因在香港牡蠣各個(gè)組織中均有表達(dá)，其中鰓組織的表達(dá)量最高，其次為外套膜、消化腺、觸唇、血淋巴、性腺、閉殼肌，在心臟的表達(dá)量最低(圖8)。

圖5 香港牡蠣CaM氨基酸與其他11個(gè)物種的同源百分比Fig.5 Percent identity of CaM amino acids of Crassostrea hongkongensis and other 11 species

表2 同源百分比與序列比對(duì)所用物種Table 2 Species used in alignment and percent identity

3 討論

3.1 香港牡蠣CaM基因cDNA序列特征和系統(tǒng)進(jìn)化鈣調(diào)蛋白是貝類中重要的調(diào)控蛋白，是鈣離子結(jié)合蛋白家族成員，能夠結(jié)合微量鈣離子，對(duì)真核細(xì)胞內(nèi)的酶起到激活作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生命活動(dòng)，進(jìn)而調(diào)控Ca2+的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和分泌[20-21]。該研究利用RACE技術(shù)克隆獲得香港牡蠣CaM基因的cDNA序列，全長(zhǎng)為770 bp，編碼149個(gè)氨基酸。生物信息學(xué)分析香港牡蠣CaM蛋白具有4個(gè)典型的EF-hand結(jié)構(gòu)域，能夠與鈣離子結(jié)合，屬于典型的鈣離子結(jié)合蛋白家族成員，這與已有研究報(bào)道的合浦珠母貝體內(nèi)的鈣調(diào)蛋白的結(jié)構(gòu)域相似[10]。鈣調(diào)蛋白是一種由148個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)，可形成2個(gè)球狀區(qū)域，由1個(gè)靈活的中心連接器連接[22]。

注：顏色表示氨基酸序列相似度(黑色.100%；粉色.70%；綠色.50%及以上；白色.50%以下)，上方綠色箭頭表示4個(gè)EF-hand結(jié)構(gòu)域，紅色方框?yàn)镋F-hand鈣結(jié)合域 Note：The color indicates the similarity of amino acid sequence(black.100%;Pink.70%;Green.≥50% and <70%;White.<50%).Green arrow indicates 4 EF-hand domains above，the red box is EF-hand calcium-binding domain圖6 香港牡蠣CaM氨基酸序列與其他物種CaM的序列比對(duì)Fig.6 Alignment CaM amino acid of Crassostrea hongkongensis and other species

注：括號(hào)中為GenBank登錄號(hào) Note：The GenBank entry number is given in parentheses圖7 CaM核酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.7 Phylogenetic tree of CaM from various species

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05) Note：Different lowercase letters indicate significantly different (P<0.05)圖8 CaM基因在香港牡蠣不同組織的表達(dá)情況Fig.8 Expression pattern of CaM gene in different tissues of Crassostrea hongkongensis

每個(gè)區(qū)域結(jié)合EF-hand基序中的2個(gè)鈣離子，這是鈣結(jié)合蛋白中普遍存在的一個(gè)基序，因此鈣調(diào)蛋白可以結(jié)合4個(gè)鈣離子，與哺乳動(dòng)物人和軟體動(dòng)物香港牡蠣的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果一致。鈣結(jié)合位點(diǎn)為12個(gè)氨基酸，包含許多負(fù)電荷或極性氨基酸殘基，如天冬氨酸、谷氨酸和天冬酰胺，這些氨基酸的側(cè)鏈與Ca2+形成離子鍵。CaM含有豐富氧原子側(cè)鏈的氨基酸殘基，即使在Ca2+濃度很低的環(huán)境中也能吸引鈣離子促進(jìn)Ca2+與氨基酸結(jié)合。氨基酸的功能位點(diǎn)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，其4個(gè)EF-hand結(jié)構(gòu)域上有1個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，2個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)，3個(gè)酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)等，表明其在細(xì)胞與細(xì)胞間結(jié)合和信號(hào)傳導(dǎo)過程中起著重要作用。

鈣調(diào)蛋白是一種必需的蛋白質(zhì)，也是一種穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，任何一種鈣調(diào)蛋白編碼基因的突變或者鈣調(diào)蛋白結(jié)合位點(diǎn)的損傷通常都是致命的[7]。來(lái)自不同脊椎動(dòng)物物種的CaM基因編碼具有相同氨基酸序列的相同CaM分子，表明其在脊椎動(dòng)物進(jìn)化過程中高度保守[23]。此外，2個(gè)不同的無(wú)脊椎動(dòng)物海葵(Metridiumsenile)和池蝶蚌(Hyriopsisschlegeli)也編碼相同的CaM蛋白，表明CaM蛋白在無(wú)脊椎動(dòng)物進(jìn)化過程中也高度保守[23-24]。通過多序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)香港牡蠣CaM基因與長(zhǎng)牡蠣CaM基因的同源性最高，核酸序列同源性為97.11%，氨基酸序列同源性高達(dá)100%，說(shuō)明CaM蛋白在雙殼類動(dòng)物進(jìn)化過程中高度保守，進(jìn)一步反映了這種蛋白質(zhì)在細(xì)胞正常功能中的重要性。比較香港牡蠣CaM基因核酸序列EF-hand結(jié)構(gòu)域之間的同源性，發(fā)現(xiàn)EFh1和EFh3與EFh2和EFh4核酸序列具有高度同源性，均為57.5%，表明參與鈣離子結(jié)合的部分分子比其他部位更保守[10]。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn)，香港牡蠣CaM基因和長(zhǎng)牡蠣CaM基因位于同一分支，說(shuō)明香港牡蠣和長(zhǎng)牡蠣的親緣關(guān)系較近，與其他物種的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，這與他們的生物學(xué)分類相符。由此推測(cè)，CaM保守結(jié)構(gòu)域在進(jìn)化過程中具有較高的保守性，并且不同物種有不同的差異性。

3.2 香港牡蠣CaM基因的組織表達(dá)分析貝殼形成是一個(gè)復(fù)雜、精密調(diào)控的生物礦化過程，自然條件下構(gòu)成貝殼的碳酸鈣晶體并不是在單一組織作用下形成的，而是多個(gè)組織共同作用的結(jié)果[25-26]。熒光定量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，CaM基因在香港牡蠣鰓組織中表達(dá)量最高，是心臟組織表達(dá)量的(198.57±4.00)倍，與合浦珠母貝和池蝶蚌CaM基因組織表達(dá)趨勢(shì)相同[24]。在雙殼類動(dòng)物中，鰓是從水中吸收鈣的主要器官，在膜Ca2+-ATP酶系統(tǒng)中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[27-28]。香港牡蠣CaM在鰓組織中高表達(dá)，說(shuō)明CaM在香港牡蠣鰓吸收和積累鈣的過程中具有重要的調(diào)控作用。在軟體動(dòng)物中，外套膜與貝殼直接接觸的區(qū)域能夠分泌角質(zhì)層和鈣化層[29]，是殼的形成過程中的關(guān)鍵調(diào)控因子。筆者發(fā)現(xiàn)CaM基因在香港牡蠣外套膜組織中表達(dá)量是心臟組織的表達(dá)量的(183.64±7.18)倍，這與其他動(dòng)物的報(bào)道相似。這暗示了香港牡蠣CaM基因通過鰓和外套膜組織共同參與調(diào)控Ca2+的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和分泌等鈣代謝途徑。由此推測(cè)香港牡蠣貝殼的形成是由鰓從外界環(huán)境中吸收Ca2+并轉(zhuǎn)運(yùn)到外套膜中，并通過鈣泵將離子從外套膜運(yùn)輸?shù)酵馓浊环置谥行纬韶悮?。因此，在貝類貝殼形成的生物礦化過程中，鈣調(diào)蛋白被認(rèn)為有極其重要的作用。

4 結(jié)論

該研究克隆了香港牡蠣CaM基因cDNA序列，全長(zhǎng)為770 bp，編碼149個(gè)氨基酸，具有4個(gè)EF-hand結(jié)構(gòu)域。通過多序列比對(duì)及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn)，香港牡蠣CaM基因與長(zhǎng)牡蠣CaM基因的同源性最高(97.11%)，并且位于同一分支。熒光定量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，CaM基因在香港牡蠣各組織中都有表達(dá)，其中鰓組織的表達(dá)量最高，其次為外套膜、消化腺、觸唇、血淋巴、性腺、閉殼肌，心臟的表達(dá)量最低。該研究結(jié)果將有望為香港牡蠣貝殼形成的生物礦化機(jī)制及CaM基因功能研究提供基礎(chǔ)資料。