文 娜，毛瓊玲，左書(shū)瑞，陳國(guó)通*

(1.新疆維吾爾自治區(qū)分析測(cè)試研究院，新疆烏魯木齊 830011；2. 新疆維吾爾自治區(qū)第三人民醫(yī)院檢測(cè)中心，新疆烏魯木齊 830011)

利巴韋林又名病毒唑,系廣譜強(qiáng)效的抗病毒藥,為單磷酸次黃嘌呤核苷脫氫酶抑制劑,抑制肌紅蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)闉踯账?阻礙病毒核酸的合成,阻止病毒復(fù)制和傳播,從而達(dá)到抗病毒的作用[1]。該類(lèi)藥物易產(chǎn)生耐藥性,使病毒發(fā)生變異,長(zhǎng)期使用對(duì)機(jī)體細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用,其對(duì)人體產(chǎn)生的最突出的安全性問(wèn)題是溶血性貧血、遺傳毒性、生殖毒性和致癌性等[2]。

β-受體激動(dòng)劑主要包括克侖特羅(俗稱(chēng)“瘦肉精”)、妥布特羅、沙丁胺醇、噴布特羅、萊克多巴胺、西馬特羅、氯丙那林、非諾特羅、特布他林共9種，該類(lèi)化合物曾經(jīng)作為藥物用于治療支氣管哮喘[3]。 這些藥物的高合成代謝潛能使其可被用于運(yùn)動(dòng)學(xué)和動(dòng)物飼養(yǎng)學(xué)，以提高肌肉合成、減少身體脂肪，但大劑量的使用會(huì)導(dǎo)致其在動(dòng)物體內(nèi)殘留蓄積，其在肌肉、腎臟、肝臟、肺臟中的殘留蓄積量依次升高，殘留蓄積濃度可達(dá)100～500 ng/g，人食用了這種豬肉后可能會(huì)產(chǎn)生劇烈腹痛、肌肉震顫等癥狀[3]，因此限制或禁止在食用動(dòng)物養(yǎng)殖中使用 β-受體激動(dòng)劑[3]。

目前還未有利巴韋林和β-受體激動(dòng)劑殘留同時(shí)測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)方法。已有的方法都是單獨(dú)檢測(cè)這2種藥物[4-8]，對(duì)于同一種基質(zhì)來(lái)說(shuō)要進(jìn)行2次前處理、2次上機(jī)，才能完成一個(gè)基質(zhì)2個(gè)項(xiàng)目的測(cè)定，不僅要多耗費(fèi)試劑，還要多耗費(fèi)人力，對(duì)于檢測(cè)任務(wù)繁重的檢測(cè)人員來(lái)說(shuō)效率低下。該研究以現(xiàn)有文獻(xiàn)方法[9-10]為基礎(chǔ),建立了利巴韋林和β-受體激動(dòng)劑殘留同時(shí)檢測(cè)的UPLC-MS/MS方法,以期為檢測(cè)人員提供技術(shù)幫助。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1儀器。Waters UPLC(H-Class) Xevo TQ-S micro高效液相色譜質(zhì)譜儀(美國(guó) Waters 公司);漩渦振蕩器;高速離心機(jī); 多位氮?dú)鉂饪s儀; Milli-Q 默克超純水制備系統(tǒng)(德國(guó) MERCK公司); Agilent Bond Elut Plexa PCX 固相萃取小柱(60 mg，3 mL，美國(guó) Agilent 公司)。

1.1.2試劑。利巴韋林標(biāo)準(zhǔn)品(純度 99.35%)，購(gòu)自德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司。利巴韋林-13C5內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，購(gòu)自德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司。9種受體激動(dòng)劑標(biāo)準(zhǔn)品克侖特羅、妥布特羅、沙丁胺醇、噴布特羅、萊克多巴胺、西馬特羅、氯丙那林、非諾特羅、特布他林，純度 99%左右，均購(gòu)自德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司。同位素內(nèi)標(biāo)物克侖特羅D-9、沙丁胺醇D-3，均購(gòu)自德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司。甲酸(HPLC級(jí))、甲醇(HPLC級(jí))、β-鹽酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶，均購(gòu)自德國(guó) Merck 公司。乙酸鈉(分析純)、冰醋酸(分析純)、氫氧化鈉(分析純)、異丙醇(分析純)、乙酸乙酯(分析純)、高氯酸(分析純)、氯化鈉(分析純)。去離子水由Milli-Q 超純水系統(tǒng)(德國(guó) Merck公司)制得。

1.1.3樣品來(lái)源。全疆14個(gè)地州市市場(chǎng)上在售的牛肉、豬肉、羊肉、豬肝、雞肉。

1.2 溶液的配制

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制。分別精密稱(chēng)取利巴韋林、克侖特羅、妥布特羅、沙丁胺醇、噴布特羅、萊克多巴胺、西馬特羅、氯丙那林、非諾特羅、特布他林標(biāo)準(zhǔn)品,用甲醇分別配制成100 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

1.2.2混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液(1 μg/mL)的配制。分別準(zhǔn)確吸取1.0 mL 利巴韋林、克侖特羅、妥布特羅、沙丁胺醇、噴布特羅、萊克多巴胺、西馬特羅、氯丙那林、非諾特羅、特布他林標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液至 100 mL 容量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,搖勻。

1.2.3利巴韋林內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液的配制。稱(chēng)取適量利巴韋林-13C5內(nèi)標(biāo)，用甲醇溶解,并稀釋配制成100 μg/mL的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液。

1.2.4受體激動(dòng)劑同位素內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備溶液的配制。稱(chēng)取適量克侖特羅D-9、沙丁胺醇D-3，用甲醇溶解并稀釋配制成100 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)貯備液。

1.2.5同位素內(nèi)標(biāo)工作溶液的配制。將上述利巴韋林、受體激動(dòng)劑同位素內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備溶液用甲醇適當(dāng)稀釋?zhuān)渲瞥墒荏w激動(dòng)劑內(nèi)標(biāo)10 ng/mL、利巴韋林內(nèi)標(biāo)100 ng/mL。

1.3 樣品處理稱(chēng)取2.0 g(精確至 0.01 g) 已制備好的樣品于50 mL離心管中,加入 8 mL乙酸鈉(0.20 mol/L)緩沖液(pH 5.2)，充分混勻，加入50 μLβ-鹽酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶,混勻后， 37 ℃水浴12 h。添加100 μL同位素內(nèi)標(biāo)工作溶液(受體激動(dòng)劑內(nèi)標(biāo)10 ng/mL，利巴韋林內(nèi)標(biāo)100 ng/mL)于水解后樣品中,加蓋置于漩渦振蕩器振蕩15 min，離心10 min(5 000 r/min),取上清液加入0.1 mol/L高氯酸溶液5 mL，混合均勻，用高氯酸調(diào)節(jié) pH 至 1.0±0.3，以 5 000 r/min 的速度離心 10 min后,將全部上清液置于另一個(gè) 50 mL 離心管中，用10 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié) pH 至 11.0±0.1,加入10 mL飽和氯化鈉溶液和10 mL異丙醇-乙酸乙酯(6+4)混合溶液,充分提取，在 5 000 r/min 下離心10 min,轉(zhuǎn)移全部有機(jī)相，在40 ℃水浴下氮?dú)獯蹈蒣9]。

將 PCX柱連接到真空過(guò)柱裝置。將上述殘?jiān)芤荷现?依次用 2 mL水、2 mL 2%甲酸水溶液和 2 mL甲醇洗滌柱子并徹底抽干,最后用 2 mL的 5%氨水甲醇溶液洗脫柱子上的待測(cè)成分。 洗脫液在 40 ℃ 水浴下氮?dú)獯蹈蒣9]。準(zhǔn)確加入1.00 mL 0.1%甲酸/水-甲醇溶液 (95+5),超聲混勻。過(guò)濾，供UPLC-MS/MS檢測(cè)。

1.4 UPLC-MS/MS條件

1.4.1液相色譜條件。色譜柱為Waters BEH-C18柱(100 mm×2.1 mm,1.8 μm); 流動(dòng)相為含0.1%甲酸的水溶液(A),甲醇(B); 梯度洗脫程序見(jiàn)表1，流速為0.3 mL/min;進(jìn)樣量3 μL;柱溫為30 ℃。

1.4.2質(zhì)譜條件。離子源為ESI電噴霧離子源,正離子模式；毛細(xì)管電壓3.5 kV; 錐孔電壓30.0 V；去溶劑溫度500 ℃；去溶劑氣流1 000 L/h；錐孔氣流20 L/h；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)掃描模式。監(jiān)測(cè)離子、碰撞能量等見(jiàn)表2～3。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedure

2 結(jié)果與分析

2.1 酶的選擇由于利巴韋林以原藥、利巴韋林單磷酸酯、利巴韋林二磷酸酯和利巴韋林三磷酸酯等形式存在,所以必須對(duì)體內(nèi)磷酸酯化的利巴韋林進(jìn)行酶解才能對(duì)利巴韋林總量進(jìn)行測(cè)定[10-11]。而受體激動(dòng)劑也是要進(jìn)行酶解才能對(duì)克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺總量進(jìn)行測(cè)定，所以該研究采用GB/T 22286—2008方法和SN/T 4519—2016方法對(duì)陽(yáng)性肌肉樣本進(jìn)行酶解，對(duì)比酸性磷酸酯酶和β-鹽酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶酶解后的利巴韋林、9種受體激動(dòng)劑的總量。結(jié)果表明,按照GB/T 22286—2008方法用β-鹽酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶酶解 12 h 后的利巴韋林含量比SN/T 4519—2016方法酸性磷酸酯酶酶解測(cè)得利巴韋林的量增加了 10%，9種受體激動(dòng)劑的總量也比酸性磷酸酯酶酶解測(cè)得的量高6%。所以該研究選擇β-鹽酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶37 ℃水浴12 h作為酶解條件。

2.2 固相萃取柱的選擇固相萃取法一直是降低基質(zhì)干擾、富集目標(biāo)物和提高檢測(cè)靈敏度最好的凈化方法。該研究嘗試了 MCX、PBA、PCX 等固相萃取小柱,發(fā)現(xiàn)MCX小柱對(duì)利巴韋林、受體激動(dòng)劑的重復(fù)性較差,PCX 小柱的回收率較PBA小柱的優(yōu)勢(shì)較為明顯,使得利巴韋林和9種受體激動(dòng)劑都能得到較好的保留。

2.3 定量方法的選擇一是按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的要求[9，12]，利巴韋林和受體激動(dòng)劑都按照內(nèi)標(biāo)法來(lái)定量；二是經(jīng)比較,采用內(nèi)標(biāo)法分析得到的利巴韋林和9種受體激動(dòng)劑回收率在90%以上,比外標(biāo)法計(jì)算得到的回收率高。故該研究采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行分析計(jì)算。但同位素內(nèi)標(biāo)量少且貴，大批量樣品篩查時(shí)成本較高，建議陽(yáng)性樣品再用內(nèi)標(biāo)法定量。

2.4 色譜柱的選擇該研究時(shí)間有點(diǎn)短只是對(duì)Waters BEH-C18柱(100 mm×2.1 mm,1.8 μm)和ACQUITY UPLC?HSS T3 (150 mm×2.1 mm,1.8 μm)色譜柱進(jìn)行了比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Waters BEH-C18柱能將利巴韋林與內(nèi)源性化合物較好分離，且9種受體激動(dòng)劑也能較好分離，BEH-C18柱應(yīng)用廣泛，可以檢測(cè)多種農(nóng)藥獸藥，方便檢測(cè)人員在同一根色譜柱下完成多種檢測(cè)任務(wù)，故選擇Waters BEH-C18柱。

2.5 流動(dòng)相的選擇液相色譜流動(dòng)相常用的有機(jī)溶劑有甲醇和乙腈，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),當(dāng)定容液中有甲醇、流動(dòng)相中有乙腈時(shí)，目標(biāo)物色譜峰峰形變寬，影響分離度，將乙腈改成甲醇后，目標(biāo)物色譜峰峰形較好，再比較乙腈、甲醇的毒性、價(jià)格、提取率后，建議從提取到流動(dòng)相都選用甲醇。當(dāng)流動(dòng)相中加入0.1%甲酸時(shí)可以增加利巴韋林和9種受體激動(dòng)劑的信號(hào)響應(yīng),加入乙酸銨時(shí),可以改善色譜峰形[7]，但每次檢測(cè)完后需要大量純水清洗色譜柱、泵，清洗不干凈會(huì)腐蝕儀器零件，降低柱效，考慮到樣品量、分析時(shí)間、色譜柱柱效、儀器耐受等因素,該研究采用甲醇-含0.1%甲酸的水溶液作為流動(dòng)相。

2.6 質(zhì)譜條件的選擇該研究采用ESI離子源進(jìn)行分析。將 1 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液在正離子模式下進(jìn)行母離子掃描,確定利巴韋林和9種受體激動(dòng)劑的母離子。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，利巴韋林有m/z245、m/z267這2個(gè)母離子，雖然m/z245 響應(yīng)較小,但其為加氫峰且較為穩(wěn)定,故選擇其作為母離子;然后對(duì)其子離子進(jìn)行全掃描,其碎片離子主要為m/z113.0、m/z95.9、m/z132.9。m/z113.0 響應(yīng)較高,可作為定量離子。經(jīng)優(yōu)化碰撞能量參數(shù),得到了最佳質(zhì)譜條件,質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)見(jiàn)表2。受體激動(dòng)劑按照國(guó)標(biāo)方法找到其母離子及子離子,見(jiàn)表3。

表2 利巴韋林定性定量離子對(duì)、錐孔電壓、碰撞能量Table 2 Qualitative and quantitative ion pairs,cone voltage,collision energy of ribavirin

表3 9種受體激動(dòng)劑的定性離子對(duì)、定量離子對(duì)、錐孔電壓、碰撞能量Table 3 Qualitative ion pair,quantitative ion pair,cone hole voltage,capillary voltage of 9 receptor agonists

2.7 基質(zhì)影響根據(jù)市場(chǎng)監(jiān)測(cè)需求，采集市場(chǎng)的豬肉和雞肉作為基質(zhì),按該方法進(jìn)行測(cè)定。選擇其中不含利巴韋林、9種受體激動(dòng)劑的豬肉和雞肉作為基質(zhì)空白,分別添加定量濃度水平的利巴韋林、9種受體激動(dòng)劑標(biāo)準(zhǔn)溶液，與相應(yīng)無(wú)基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行比較。結(jié)果表明，樣品基質(zhì)不會(huì)干擾目標(biāo)化合物的測(cè)定,用內(nèi)標(biāo)法定量更能消除不同因素對(duì)結(jié)果的影響。質(zhì)譜圖見(jiàn)圖1～2。

2.8 線性范圍以目標(biāo)物峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)、目標(biāo)物的濃度為橫坐標(biāo)繪制各目標(biāo)物的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。利巴韋林按照濃度為2、5、10、30、50、100、200 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)樣,結(jié)果表明,利巴韋林濃度在 1～100 μg/kg 呈良好的線性關(guān)系(R2>0.999)。9種受體激動(dòng)劑按照濃度為 0.5、1.0、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)樣,結(jié)果表明,在0.25～50.00 μg/kg呈良好的線性關(guān)系(R2>0.999)。具體見(jiàn)表4。

2.9 回收率在空白豬肉及雞肉樣品中,添加利巴韋林和克侖特羅、妥布特羅、沙丁胺醇、噴布特羅、萊克多巴胺、西馬特羅、氯丙那林、非諾特羅、特布他林定量檢出限的1倍、3倍、10倍3個(gè)水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗(yàn)。按該研究中前處理方法測(cè)定。每個(gè)濃度平行測(cè)定6個(gè)樣品。結(jié)果表明(表5)，10種目標(biāo)物的回收率為84.6%～108.0%,RSD為1.6%～5.2%,滿(mǎn)足食品理化檢測(cè)中的質(zhì)控要求[13]。

2.10 方法應(yīng)用應(yīng)用該研究中的方法測(cè)定了全疆14個(gè)地州市市場(chǎng)上在售的約700個(gè)主要樣本(牛肉、豬肉、羊肉、豬肝、雞肉)中利巴韋林和9種受體激動(dòng)劑殘留量,結(jié)果表明(表6)，個(gè)別豬肉中檢出利巴韋林、克倫特羅，牛肉中檢出克倫特羅，其他畜禽肉未發(fā)現(xiàn)非法使用10種藥物的現(xiàn)象。

圖1 利巴韋林標(biāo)準(zhǔn)品定量離子(a)和定性離子(b)質(zhì)譜圖Fig.1 Mass spectrum of quantitative ion (a) and qualitative ion (b) of ribavirin standard

圖2 9種受體激動(dòng)劑標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定量離子、定性離子質(zhì)譜圖Fig.2 Mass spectrum of quantitative ion and qualitative ion of nine receptor agonist reference materials

表4 利巴韋林、9種受體激動(dòng)劑標(biāo)準(zhǔn)工作曲線Table 4 Standard working curves of ribavirin and 9 receptor agonists

表5 10種目標(biāo)物回收率測(cè)試結(jié)果(n=6)Table 5 Recovery rate test results of 10 target substances

3 結(jié)論與討論

該研究建立了利巴韋林與9種β-受體激動(dòng)劑的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)檢測(cè)方法，提高食品檢測(cè)人員檢測(cè)效率。在樣品前處理中,采用β-鹽酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶酶解，用高氯酸調(diào)節(jié) pH,沉淀蛋白后離心,上清液用異丙醇-乙酸乙酯提取,經(jīng)固相萃取柱凈化，前處理步驟可以將利巴韋林和9種受體激動(dòng)劑同時(shí)處理。在UPLC-MS/MS上同時(shí)檢測(cè)這10種目標(biāo)物，且能達(dá)到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)要求的檢出限(利巴韋林1.00 μg/kg，9種受體激動(dòng)劑的檢出限均為 0.25 μg/kg)，線性范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)良好,回收率在84.6%～108.0%,RSD為1.6%～5.2%，滿(mǎn)足食品理化檢測(cè)中的質(zhì)控要求[13]。該方法在一次前處理一次上機(jī)檢測(cè)的同時(shí)，完成了10種藥物的監(jiān)測(cè)，節(jié)省檢測(cè)成本，提高工作效率，可用于各種畜禽肉中利巴韋林與β-受體激動(dòng)劑殘留量的定量檢測(cè)及風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)。

表6 畜禽肉檢出情況Table 6 Detection of livestock and poultry meat