何 帥，章雨竹，呂念詞，張以芳，柴 俊

（1.眉山職業(yè)技術(shù)學(xué)院，云南 眉山 620010；2.云南農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650031；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，云南 昆明 650201）

【研究意義】豬圓環(huán)病毒2 型（PCV2）被認(rèn)為是豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病的主要病原體，主要侵害機(jī)體的免疫系統(tǒng)，造成免疫抑制，每年對(duì)世界各地的養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失［1-2］。PCV2在豬群中普遍存在，與大多數(shù)單鏈RNA 病毒一樣具有快速的核苷酸更新率，增加了PCV2 的遺傳變異［3-4］。因此，對(duì)PCV2 流行毒株的研究將有利于預(yù)測(cè)病毒的遺傳演變趨勢(shì)和評(píng)估現(xiàn)有疫苗的保護(hù)效果。【前人研究進(jìn)展】我國(guó)于1998 年首次發(fā)現(xiàn)PCV2，2001—2003 年在我國(guó)不同地區(qū)進(jìn)行了一次全面的PCV2 分子流行病學(xué)調(diào)查［5］，目前研究報(bào)道PCV2 有6 個(gè)基因亞型，即PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d、PCV2e 和PCV2h［6］，F(xiàn)ranzo 等［7］提出了一個(gè)新的分類方案，基于3 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)：最大基因型內(nèi)p-距離為13%（根據(jù)ORF2基因計(jì)算），相應(yīng)內(nèi)部節(jié)點(diǎn)處的bootstrap 支持度高于70%，具有至少15 個(gè)可用序列。根據(jù)該方案可定義8 種基因型（PCV-2a～PCV-2h），其中6 種是以前提出的。PCV2 的核苷酸高取代率，使得PCV2 流行毒株的基因亞型持續(xù)發(fā)生演變，讓流行形勢(shì)變得更為復(fù)雜。PCV2 病毒粒子直徑14～17 nm，呈20 面體對(duì)稱結(jié)構(gòu)，無(wú)囊膜，含有共價(jià)閉合的單股環(huán)狀負(fù)鏈DNA，其基因組大小為1 767 bp 或1 768 bp，ORF1（945 nt）是復(fù)制酶（Rep）蛋白，編碼病毒DNA 復(fù)制相關(guān)的蛋白質(zhì)，ORF2（702 nt 或705 nt）是衣殼（Cap）蛋白、病毒主要抗原決定簇［8-9］。豬圓環(huán)病毒家族成員包括PCV1、PCV2、PCV3 和首次在我國(guó)湖南發(fā)現(xiàn)的PCV4［10］。1999 年Naya 等［11］首次在患呼吸系統(tǒng)疾病的牛的肺組織或流產(chǎn)牛胎兒的肺組織中發(fā)現(xiàn)圓環(huán)病毒PCR 產(chǎn)物，與分離自豬的PCV2 型基因組幾乎完全相同，核苷酸序列同源性達(dá)99%，該報(bào)道證明了豬圓環(huán)病毒與牛呼吸道合胞病毒、牛病毒性腹瀉病毒混合感染牛。2014 年我國(guó)Zhai等［12-13］對(duì)奶牛、水牛和黃牛樣品采用PCR 分析，結(jié)果表明PCV2感染僅存在于水牛（16%，8/50）中，此外，在同一只水牛樣品中，通過(guò)PCR 鑒定出不同PCV2 亞型DNA。【本研究切入點(diǎn)】目前云南省尚無(wú)PCV2 在非自然宿主（牛）群體中流行情況的研究報(bào)道，本研究對(duì)云南地區(qū)PCV2 在豬、牛群體間的感染情況進(jìn)行調(diào)查，可以有效彌補(bǔ)這一空白。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】調(diào)查云南地區(qū)PCV2 在豬、牛群體間的流行情況，豐富PCV2 在非自然宿主（牛）群體中流行病學(xué)資料，分析影響PCV2 的流行因素，對(duì)PCV2 云南株序列進(jìn)行同源性分析，對(duì)ORF2 蛋白進(jìn)行氨基酸突變位點(diǎn)分析，并構(gòu)建PCV2 遺傳進(jìn)化樹，為后續(xù)PCV2的防控和疫苗免疫奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2019 年9 月至2020 年12 月調(diào)查PCV2 在云南省豬群、牛群中的流行情況，從云南省普洱、昆明、曲靖、楚雄、紅河、玉溪、大理、臨滄、怒江、德宏、文山采集了511 份疑似感染PCV2的豬組織、血液等樣品，從大理、怒江、曲靖、普洱采集了272 份荷斯坦奶牛的糞便、血液樣品，共計(jì)783 份樣品（表1），-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 本調(diào)查研究所采集豬、牛的樣品信息Table1 Information of samples from pigs and cattle collected for this survey

試驗(yàn)主 要試劑包括2×EasyTaq?PCR SuperMix (+dye)、EasyPure?Plasmid MiniPrep Kit、EasyPure?Quick Gel Extraction Kit，均購(gòu)自北京全式金生物科技有限公司；TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0、pMD? 19-T Vector Cloning Kit、E.coliDH5α Competent Cells、DL2000 DNA marker，均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank 已有的PCV2 序列，設(shè)計(jì)合成PCV2-549 檢測(cè)引物1 對(duì)（F：5′CGCTGCCACATCGAGAAAGC3′，R：5′ATCAGACCCCGTTGGAATGG3′），PCV2-1767 全基因 反向擴(kuò) 增引物1 對(duì)（F：5′C T C T C T A T C G G A G G A T T A C T 3′，R：5′ATTACTTCCTTGGTATTTTG3′）。引物由北京擎科生物科技有限公司昆明分公司合成。

1.2.2 DNA 提取 將樣品迅速轉(zhuǎn)移至液氮預(yù)冷的研缽中，用研杵研磨組織，其間不斷加入液氮，直至樣品研磨成粉末狀。抗凝血直接取200 μL 于1.5 mL 離心管中，提取DNA。樣品DNA 提取按照TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0試劑盒使用說(shuō)明書進(jìn)行提取。

1.2.3 PCR 擴(kuò)增及測(cè)序 PCR 反應(yīng)液配制：12.5 μL 2×Easy Taq SuperMix，PCV2-549 上 下游引物各1 μL，1 μL DNA 模板，9.5 μL ddH2O。PCR 反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s、58 ℃退火30 s、72 ℃延伸50 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸8 min，4 ℃保存。取PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，凝膠成像系統(tǒng)拍照分析。

按照EasyPure Quick Gel Extraction Kit 說(shuō)明書純化回收目的片段，將目的片段與pMD19-T 載體連接，轉(zhuǎn)化到DH5α 感受態(tài)細(xì)胞中，在含氨芐西林的LB 固體培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，挑取單一白色菌落，在LB 液體培養(yǎng)基中進(jìn)行增菌培養(yǎng)，按照EasyPure HiPure Plasmid MiniPrep Kit 說(shuō)明書提取質(zhì)粒，并由昆明擎科生物科技有限公司測(cè)序。

1.2.4 PCV2 序列分析 使用DNA Star 7.0 軟件MegAlign 程序，采用ClustalW 算法將本研究得到的6 條云南PCV2 流行毒株與GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中選取的20 條PCV2（a/b/d）參考毒株（表2）進(jìn)行PCV2 全基因同源性分析，并以PCV1 序列（AY184287）為遺傳進(jìn)化樹樹根，利用MEGA 軟件（7.0 版）ClustalW 算法，采用鄰近連接法（NJ）參數(shù)模型構(gòu)建PCV2 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

表2 供試的PCV2 參考毒株信息Table2 Information of PCV2 reference sequences used in this study

1.2.5 ORF2 氨基酸序列分析 利用MegAlign 軟件Clustal W 法對(duì)本研究得到的PCV2 毒株與2 株疫苗株SH（HMO38027）、LG（HMO38034）和10 株GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中選取的PCV2（a/b/d）參考毒株進(jìn)行PCV2衣殼蛋白氨基酸突變位點(diǎn)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 云南省PCV2 的PCR 檢測(cè)結(jié)果

通過(guò)PCR 檢測(cè)（圖1）發(fā)現(xiàn)，511 份豬樣品PCV2 陽(yáng)性率為48.73%（249/511），272 份荷斯坦奶牛樣品PCV2 核酸檢測(cè)結(jié)果均為陰性。豬的組織樣品PCV2 陽(yáng)性率為57.89%（44/76），血液樣品PCV2 陽(yáng)性率為51.42%（199/387），糞便樣品PCV2 陽(yáng)性率為12.5%（6/48）；滇中樣品的PCV2 陽(yáng)性率為48.28%（56/116），滇東樣品的PCV2 陽(yáng)性率為50.61%（83/164），滇南樣品的PCV2 陽(yáng)性率為52.00%（52/100），滇西樣品的PCV2 陽(yáng)性率為44.83%（26/58），滇北樣品的PCV2 陽(yáng)性率為43.84%（32/73）。

圖1 PCV2 的PCR 檢測(cè)電泳結(jié)果Fig.1 PCR electrophoresis result of PCV2

從陽(yáng)性樣品中成功擴(kuò)增出6 條PCV2 全基因序列，其中5 株全基因序列為1 767bp（圖2），1 株全基因序列為1 768 bp，將其序列上傳至GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)，得到如下登錄號(hào)：LinCang-202006（MW217511）、JinNing-202006（MW653451）、LuQuan-202004（MW653452）、WenShan-202004（MW653453）、DeHong-202005（MW653450）、WenShan-202009（MW653449）。

圖2 PCV2 全基因擴(kuò)增電泳結(jié)果Fig.2 Whole gene amplification electrophoresis result of PCV2

2.2 PCV2 全基因組序列比對(duì)分析

本研究得到的6 條PCV2 全基因組序列同源性 在94.6%～99.9% 之 間（圖3），其 中DeHong-202005 毒株與WenShan-202009 毒 株同源性最高（99.9%），DeHong-202005 毒株與WenShan-202004 毒株、WenShan-202004 毒株與WenShan-202009 毒株同源性最低（94.6%）；與疫苗株LG（HM038034）和SH（HM038027）同源性在95.0%～97.9%之間，與GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中20 條來(lái)自國(guó)內(nèi)外不同地區(qū)的PCV2（a/b/c/d/e）參考株同源性在91.4%～99.8%之間。

圖3 云南PCV2 流行毒株同源性分析Fig.3 Homology analysis of PCV2 epidemic strains in Yunnan

以PCV1 序列（AY184287）為系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹樹根，構(gòu)建Neighbor-Joining Tree 系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4）。本研究得到的6 條PCV2 毒株經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果顯示為有2 株P(guān)CV2a（WenShan-202004、LuQuan-202004）、2 株P(guān)CV2b（JinNing-202006、LinCang-202006）、2 株P(guān)CV2d（DeHong-202005、WenShan-202009）。據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹可知，2 株P(guān)CV2a 毒株與PCV2a 參考株分離形成一個(gè)獨(dú)立進(jìn)化分支，與疫苗株LG（HM038034）親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；2 株P(guān)CV2b 毒株與參考毒株MK405700 形成獨(dú)立進(jìn)化支，與疫苗株SH（HM038027）親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；2 株P(guān)CV2d 毒株與KunMing（MK405696）親緣關(guān)系較近，形成獨(dú)立進(jìn)化分支，云南PCV2d 流行毒株自2019 年開始與之前鑒定的PCV2d 流行毒株分離形成一個(gè)獨(dú)立進(jìn)化分支。

圖4 云南PCV2 流行毒株全基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree based on the whole gene sequence of PCV2 epidemic strain in Yunnan

2.3 PCV2 ORF2 氨基酸序列分析

WenShan-202004、LuQuan-202004、JinNing-202006、LinCang-202006 毒株ORF2 均含233 個(gè)氨基酸序列，DeHong-202005、WenShan-202009 毒 株ORF2 均 含234個(gè)氨基酸序列，DeHong-202005 毒株和WenShan-202009 毒株與PCV2（a/b）參考毒株比較，在第234 位多1 個(gè)賴氨酸（K）殘基（圖5）。WenShan-202004、LuQuan-202004 具有PCV2a 的典型氨基酸序列，位于第86～91 位氨基酸的TNKISI 序列，WenShan-202004、LuQuan-202004 與 LG（HM038034）疫苗株相比、在21（L21S）、47（T41A）、80（V80L）、130（V130F）、133（V133S）、185（L185M）、187（L187I）等氨基酸位點(diǎn)發(fā)生突變，WenShan-202004 還在3（Y3H）、219（V219I）等氨基酸位點(diǎn)發(fā)生突變。JinNing-202006、LinCang-202006 兩株具有PCV2b 的典型氨基酸序列，分別是位于86～91 的SNPRSV 與位于191、206、210 位點(diǎn)的GIE 氨基酸序列；JinNing-202006、LinCang-202006 與SH（HM038027）疫苗株相比，在59（R59K）、63（K63R）、190（A190T）、228（A228D）、230（T230P）等氨基酸位點(diǎn)發(fā)生突變，JinNing-202006 在219氨基酸位點(diǎn)（V219A）發(fā)生突變，LinCang-202006在203 氨基酸位點(diǎn)（E203G）發(fā)生突變。DeHong-202005、WenShan-202009 兩株具有位于86～91 位點(diǎn) 的SNPLTV 和190、191、206、210、234 位點(diǎn)的TGIDK 典型氨基酸序列，這些位點(diǎn)均屬于PCV2d 的典型氨基酸序列。

圖5 云南PCV2 流行毒株ORF2 突變位點(diǎn)分析Fig.5 Analysis of mutation sites of ORF2 from PCV2 epidemic strains in Yunnan

3 討論

近年來(lái)，我國(guó)多個(gè)省份相繼檢測(cè)到豬群感染PCV2 的高陽(yáng)性率［14-15］，PCV2 感染引發(fā)的相關(guān)疾病造成生豬生產(chǎn)性能下降甚至死亡，給生豬養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。據(jù)Lyu 等［16］報(bào)道，云南省2016—2019 年P(guān)CV2 陽(yáng)性率為60.93%，高于本次調(diào)查結(jié)果，說(shuō)明PCV2 在云南省的流行程度有減弱趨勢(shì)，近年的PCV2 防控措施取得了一定成果。據(jù)宋春蓮等［17］調(diào)查發(fā)現(xiàn)，PCV2在滇中的陽(yáng)性率為48.62%，在滇南的陽(yáng)性率為29.03%，在滇西的陽(yáng)性率為47.37%，在滇東的陽(yáng)性率為27.27%，而本次云南省PCV2 豬群流行情況調(diào)查結(jié)果顯示，PCV2在滇南地區(qū)的陽(yáng)性率最高、為52.00%，這可能是滇南地區(qū)靠近越南、緬甸、泰國(guó)等國(guó)家，邊境線防疫難度大，生物安全風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)較高所致。

Zhai 等［12-13］在2014 年采集50 份水牛組織樣品，其中有8 份呈PCV2 陽(yáng)性，而來(lái)自奶牛的180 份血液樣品和來(lái)自黃牛的50 份組織樣品均呈PCV2 陰性，且PCV2 毒株在水牛中具有遺傳多樣性，可分為3 種不同的基因型（PCV2b、PCV2d和PCV2e）。本研究的272 份荷斯坦奶牛樣品呈PCV2 陰性，與Zhai 等的調(diào)查研究報(bào)告一致，但Zhai 等確定PCV2 在水牛群體中流行，這可能與水牛的生活習(xí)慣有關(guān)。一般來(lái)說(shuō)，我國(guó)大多數(shù)奶牛和黃牛都是在牧場(chǎng)圈養(yǎng)，而水牛主要在我國(guó)南方的農(nóng)村地區(qū)放牧，周邊的水系經(jīng)常被豬的糞便污染，這可能是導(dǎo)致水牛感染PCV2 的原因。

1996—2000 年初，PCV2a 是臨床感染豬中最普遍的基因型，之后PCV2b 占主導(dǎo)地位（“基因型轉(zhuǎn)變”）［18-19］，PCV2d 最早在我國(guó)報(bào)道［20］，第二次“基因型轉(zhuǎn)變”（從PCV2b 到PCV-2d）似乎正在全球發(fā)生［21］，這可能是由全球使用PCV2 疫苗推動(dòng)的。Lyu 等［16］在2020 年公開的15 株P(guān)CV2 云南毒株，其中有2 株P(guān)CV2a 亞型、1 株P(guān)CV2b 亞 型、12 株P(guān)CV2d 亞 型，PCV2d 成為主要流行基因型。本研究獲得的6 株P(guān)CV2 分別屬于PCV2a、PCV2b 和PCV2d 這3 個(gè)基因亞型，每種基因亞型各2 株，表明PCV2 感染在云南豬群中的遺傳多樣性不斷增加，3 種基因型在豬群中共同存在，可見近年來(lái)云南PCV2 的流行情況較為復(fù)雜。

不同PCV2 基因型的ORF2 編碼衣殼蛋白可以根據(jù)Cap 蛋白中的典型序列來(lái)區(qū)分，PCV2a 存在典型的氨基酸序列TNKISI，PCV2b 存在典型的氨基酸序列TNKISI、PNPRSV 和A/TGIE，PCV2d存在典型的氨基酸序列SNPLTV 和TGID［22］。本研究的6 株P(guān)CV2 毒株，Cap 蛋白具有其基因亞型的典型氨基酸序列，其中2 株（MW653449、MW653450，PCV2d 亞型）ORF2 長(zhǎng)度為705 bp，編碼234 個(gè)氨基酸，其余4 個(gè)PCV2 毒株的ORF2長(zhǎng)度均為702 bp，編碼233 個(gè)氨基酸。本研究的PCV2d 毒株均在Cap 蛋白的C 末端終止密碼子之前增加了一個(gè)賴氨酸（K），DeHong-202005/WenShan-202009 毒株與參考毒株相比在第169 位氨基酸位點(diǎn)（S169R/T）發(fā)生特有突變，該演化可能會(huì)對(duì)毒株的毒力和免疫逃避產(chǎn)生影響。

4 結(jié)論

本研究獲得6 株P(guān)CV2 毒株，PCV2a、PCV2b和PCV2d 基因亞型各2 株，這說(shuō)明PCV2 感染在云南地區(qū)豬群中呈多樣性，防控難度加大；PCR 檢測(cè)結(jié)果證明PCV2 在云南地區(qū)豬群中普遍存在，荷斯坦牛奶尚未感染PCV2；PCV2 云南株遺傳進(jìn)化分析結(jié)果證明，PCV2（a/b）衣殼蛋白氨基酸序列朝著PCV2d 基因亞型不斷進(jìn)化，DeHong-202005/WenShan-202009 毒株與參考毒株相比在第169 位氨基酸位點(diǎn)（S169R/T）發(fā)生特有突變，PCV2 在親緣關(guān)系上受地域影響較小，受時(shí)間因素影響較大。本研究結(jié)果明確了云南省PCV2感染現(xiàn)狀及流行毒株的分子流行病學(xué)特點(diǎn)、遺傳演化情況，可為云南地區(qū)今后更有效地預(yù)防控制PCV2 感染及疫苗選擇提供參考。