張文武，邱峰芳，許繼國

（1.東華理工大學化學生物與材料科學學院，江西 南昌 330013；2.南昌師范學院生物技術研究所/江西地方雞種遺傳改良重點實驗室，江西 南昌 330029）

【研究意義】了解物種內和物種間表型多樣性的遺傳基礎是現(xiàn)代生物學研究的重大挑戰(zhàn)之一。家雞經(jīng)過數(shù)千年的選擇性繁殖聚集了豐富的表型變異，是研究和理解表型多樣性遺傳基礎的重要研究材料?！厩叭搜芯窟M展】雞冠作為易見的裝飾性狀，無論在為人類提供肉蛋的商業(yè)化品種還是作為觀賞用品種上，均受到強烈的人工選擇［1］。作為雞的第二性征，雞冠與性成熟之間的關系已經(jīng)得到很好的研究?？茖W家還發(fā)現(xiàn)雞冠與交配決策、社會等級、體溫調節(jié)、生殖能力和骨量有重要關系［2-7］。研究表明，多因子調控雞冠不同形態(tài)。通過轉錄組測序技術已鑒定到與雞冠發(fā)育相關的候選基因有BMP2基因和CHADL基因［8-9］。三叉冠是單冠后端兩側分裂出肉質隆起，形態(tài)像叉狀（圖1）。Pearl 等［10］最早提出三叉冠性狀，認為三叉冠是純單冠和純豆冠的中間態(tài)。有學者通過白來航雞的雜交試驗發(fā)現(xiàn)兩個常染色體上有兩對等位基因控制單冠和分叉，但試驗群體不大，其結論仍有待進一步驗證［11］。有學者通過雜交試驗發(fā)現(xiàn)三叉冠基因型為Sss1s1、SSs1s1、ssS1S1、ssS1s1和sss1s1，非三叉基因型為SSS1S1、SsS1S1、SSS1s1和SsS1s1最符合交配試驗后代的分布比例，但該假設未能很好解析左叉和右叉等冠型的遺傳規(guī)律，推測三叉冠是多基因遺傳控制的性狀［12］。目前對其他冠型方面的研究成果很多，有研究者發(fā)現(xiàn)細齒冠寧都黃公雞的AR與VIPR1 蛋白免疫組織化學陽性細胞比率顯著低于其他冠型個體，倒冠個體的AR 與VIPR1 蛋白的免疫組織化學陽性細胞比率均顯著高于其他冠型個體，并且在雞冠竇狀血管網(wǎng)內皮細胞及生發(fā)層細胞中具有較高免疫組織化學陽性反應［13］。研究人員發(fā)現(xiàn)玫瑰冠純合子的公雞個體生育能力較低［14］。攜帶豆冠等位基因的個體其肉垂也比較小且龍骨皮膚變厚［15］。由于進化保守區(qū)的重復導致SOX5基因的異位表達，而異位表達的SOX5基因又改變了SSH基因的表達，從而導致雞冠異常發(fā)育［16］。Somes［17］認為該基因座位還存在一種控制蝴蝶冠的等位基因，其顯隱性位于V 形冠等位基因（DV）和雙冠等位基因（DC）之間。基因組重復與雞胚雞冠和兩種雙雞冠表型的異位異胚層表達有關［18］。

圖1 白耳黃雞三叉冠性狀Fig.1 Trigeminal comb traits of white-ear yellow chickens

【本研究切入點】隨著近幾年分子生物學技術手段的進步，玫瑰冠、豆冠和雙冠等主要冠型的致因突變已經(jīng)鑒定且性狀形成機制也已被初步闡明，但目前尚無有關三叉冠性狀的分子遺傳學研究。【擬解決的關鍵問題】生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)，白耳黃雞群體有約5%的個體為三叉冠。本研究以白耳黃雞為研究材料，采用雜交實驗、受精率實驗和全基因組關聯(lián)分析（Genome-wide Association Analysis,GWAS）對白耳黃雞三叉冠性狀進行分析，以期為三叉冠的進一步研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試白耳黃雞來自江西省上饒市廣豐區(qū)白耳黃雞原種場。供試白耳黃雞的飼養(yǎng)管理流程按原種場管理；飼料營養(yǎng)方面，育雛階段（1～30 日齡）飼喂正大慢速品種小雞料，育成階段（30～170 日齡）飼喂正大育成料。

1.2 試驗方法

1.2.1 正反交試驗和受精率試驗 以60 只120 日齡的白耳黃雞進行正反交試驗，15 只三叉冠公雞與15 只單冠母雞交配，以及15 只單冠公雞與15只三叉冠母雞交配。以120 只120 日齡的白耳黃雞進行受精率試驗，30 只單冠公雞和30 只三叉冠公雞分別與30 只單冠母雞交配。

1.2.2 GWAS 分析 對82 只150 日齡的白耳黃公雞（23 只三叉冠、23 只單冠）于翅靜脈采血各5 mL，用EDTA 抗凝處理，提取基因組DNA 用于GWAS 分析。基因分型采用Illumina 平臺的雞京芯一號60 k 芯片。數(shù)據(jù)質控使用PLINK 1.90 軟件。基因型質控過程將刪除達到以下標準的個體或位點：分型缺失數(shù)＞10%的位點、最小等位基因頻率＜ 0.01 的位點和哈代-溫伯格檢驗P值＜1×10-4的位點。

在GWAS 分析中，試驗結果的假陽性部分來自群體分層［19］。主成分分析（PCA）方法能用于遺傳學的聚類分析，根據(jù)遺傳差異可將個體分為不同亞組。本研究采用PCA 方法進行群體分層分析，使用GCTA 軟件對有效SNP 進行PCA，獲得基因組數(shù)據(jù)特征值和特征向量，并用R 程序作PCA 圖。GWAS 分析采用混合線性模型GEMMA。采用Bonferroni 多重檢驗方法確定關聯(lián)顯性閾值，閾值為1/有效SNP 位點數(shù)量。

在NCBI 網(wǎng)站上下載對應物種的參考基因組信息（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/111?genome_assembly_id=1543395），使用ANNOVAR 軟件將顯著SNP 注釋到其對應的基因上，并結合文獻注釋候選基因的功能。

2 結果與分析

2.1 白耳黃雞三叉冠表型遺傳方式

用三叉冠白耳黃雞個體與單冠白耳黃雞個體進行正反交試驗，結果（表1）顯示后代全為單冠。在遺傳雜交試驗中通常采用正交和反交來判斷某性狀的基因是位于常染色體上還是性染色體上。根據(jù)后代全為單冠初步推測，白耳黃雞三叉冠為常染色體遺傳。

表1 白耳黃雞正反交試驗Table 1 Orthogonal and reverse cross tests of white-ear yellow chickens

2.2 單冠和三叉冠白耳黃雞的種蛋受精率比較

比較30 只單冠公雞和30 只三叉冠公雞與配單冠母雞的受精能力，結果顯示，與配單冠群體的種蛋受精率為94.9%（258/272），與配三叉冠群體的種蛋受精率為92.7%（241/260），差異不顯著。

2.3 白耳黃雞群體有效SNP 數(shù)和群體結構分析

GWAS 分析首先要對基因型及表型進行一定標準的質控，以排除異?；蛐秃彤惓１硇蛯Ψ治鼋Y果產(chǎn)生的影響。經(jīng)質控白耳黃雞群體得到55 023 個有效SNP。通過對標記矩陣進行PCA 分析，提取解釋方差最大的前幾位PCA，繪制對應散點圖可反映群體結構。從圖2 可以看出，白耳黃雞群體的點相對集中，表明白耳黃雞群體內不存在明顯的群體分層，可以進行后續(xù)分析。

圖2 白耳黃雞群體結構分析Fig.2 Population structure analysis of white-ear yellow chickens

2.4 白耳黃雞三叉冠顯著關聯(lián)SNP 位點分析

圖3 和圖4 分別是對白耳黃雞三叉冠GWAS分析所得結果的QQ 圖和曼哈頓圖。QQ 圖中X軸和Y 軸分別為期望的P值和實際的P值，兩者一致時，由隨機漂變導致；兩者不一致時，存在真實變異，對應的點與表型相關。在曼哈頓圖中每個基因組SNP 位點沿染色體序列排列，Y 軸的P值可理解為每個SNP 與表型的關聯(lián)程度。結果（表2）顯示，與白耳黃雞三叉冠顯著關聯(lián)SNP位點共有10 個，其中有1 個SNP 位于第1 號染色體，2 個SNP 位于第2 號染色體，2 個SNP 位于第3 號染色體，1 個SNP 位于第4 號染色體，1 個SNP 位于第5 號染色體，1 個SNP 位于第12 號染色體，2 個SNP 位于第14 號染色體。這10 個SNP 分別鄰近或座落于SPRY2、NDFIP2、ITGA9、EMC2、TMEM17、EHBP1、SCAF8、TIAM2、HTT、STON2、PRKCD、RBBP6、TNRC6A、MAPK8IP3基因上。

圖3 白耳黃雞三叉冠關聯(lián)分析QQ 圖Fig.3 QQ plot of association analysis of white-ear yellow chicken with trigeminal comb

圖4 白耳黃雞三叉冠關聯(lián)分析曼哈頓圖Fig.4 Manhattan diagram of association analysis of white-ear yellow chicken with trigeminal comb

表2 白耳黃雞三叉冠顯著關聯(lián)SNP 位點Table 2 SNP loci significantly associated with trigeminal comb of white-ear yellow chicken

3 討論

3.1 白耳黃雞三叉冠遺傳方式

在遺傳雜交試驗中通常采用正交和反交來判斷某性狀的基因位于常染色體上還是性染色體上。有學者通過白色來航雞的雜交試驗發(fā)現(xiàn)兩個常染色體上有兩對等位基因控制單冠和分叉冠［11］。有學者通過雜交試驗發(fā)現(xiàn)三叉冠基因型是常染色體多基因遺傳控制的性狀［12］。本研究發(fā)現(xiàn)白耳黃雞三叉冠呈現(xiàn)常染色體遺傳，這與前人研究結果相一致。

3.2 白耳黃雞三叉冠與受精率的關系

有研究報道，玫瑰冠與豆冠、單冠的精子活率和受精率差異不顯著，但玫瑰冠與單冠在精子密度和受精蛋孵化率上顯著高于豆冠［20］。有學者研究玫瑰冠個體的精液質量與不同基因型個體的生育能力和生育持續(xù)時間，發(fā)現(xiàn)精子活力缺陷是導致低生育能力以及生育時間短的原因［21］。但還未有研究三叉冠與受精率關系的報道，我們發(fā)現(xiàn)與配三叉冠公雞的母雞群體的種蛋受精率低于與配單冠公雞個體，但差異不顯著，具體原因還需要進一步研究。

3.3 白耳黃雞三叉冠的GWAS 分析

在雞生產(chǎn)中，GWAS 被用來鑒定與生產(chǎn)相關性狀的候選基因。本研究對白耳黃雞三叉冠進行GWAS 分析，檢測到10 個顯著SNP，分別鄰近或座落于SPRY2、NDFIP2、ITGA9、EMC2、TMEM17、EHBP1、SCAF8、TIAM2、HTT、STON2、PRKCD、RBBP6、TNRC6A和MAPK8IP3基因上。但根據(jù)前人研究結果［22-36］，這些基因并非與白耳黃雞三叉冠形成直接相關的候選基因。

4 結論

本研究對白耳黃雞三叉冠性狀進行分析，結果顯示，白耳黃雞三叉冠呈現(xiàn)常染色體遺傳；GWAS 分析發(fā)現(xiàn)10 個與白耳黃雞三叉冠顯著關聯(lián)的SNP，分別鄰近或座落于SPRY2、NDFIP2、ITGA9、EMC2、TMEM17、EHBP1、SCAF8、TIAM2、HTT、STON2、PRKCD、RBBP6、TNRC6A、MAPK8IP3基因上，但這些基因并非與白耳黃雞三叉冠形成直接相關的候選基因，這些基因是否參與三叉冠的形成需要進一步證實。