宋 波，張廷富，楊昌鑫，文國琴

(西華師范大學生命科學學院，四川 南充 637000)

【研究意義】柑橘是全世界種植面積最廣的水果，也是我國重要的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟產(chǎn)業(yè)[1-2]。柑橘味道鮮美、營養(yǎng)豐富，含有豐富的黃酮類化合物，在醫(yī)藥、食品、保健等領域具有較好的利用前景[3-5]。柑橘在生產(chǎn)、儲運和加工過程中往往會受到多種因素影響，導致柑橘發(fā)病腐爛。我國柑橘的病害有100種左右，其中采后病害有20多種。因此，加強對柑橘采后病害的防治研究，對降低柑橘病害和促進農(nóng)業(yè)經(jīng)濟產(chǎn)業(yè)具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】根據(jù)發(fā)病特征可將柑橘病害分為侵染性病害和生理性病害[6]。侵染性病害由病原微生物侵染引起。青霉菌是最主要的柑橘真菌病原，真菌引起的柑橘采后侵染病害中，由指狀青霉(Penicillumdigitatum)和意大利青霉(P.italicum)等引起的綠霉病、青霉病最嚴重，酸腐、蒂腐病、炭疽病、黑腐病、黑斑病、褐腐病等病害次之[7]。柑橘生理病害主要有褐斑病、枯水病、水腫病、油斑病等[8]。這些病害嚴重危害了柑橘采后保鮮，對柑橘產(chǎn)業(yè)造成巨大損失。目前，普遍認為引起柑橘采后病變腐爛的青霉菌主要是意大利青霉(P.italicum)和指狀青霉(P.digitatum)，但也有研究顯示擴展青霉(P.expansum)、波蘭青霉(P.polonicum)、產(chǎn)黃青霉(P.chrysogenus)等也是引起柑橘采后病害的病原青霉[9]。有效的防控方法非常重要，物理防控和化學防控是目前使用的最廣泛的病害防控手段。物理防控對柑橘病害有較好的防控效果，但也有成本高、耗能大的缺陷?；瘜W防控是利用化學藥物抑制病原菌生長而達到病害防控的目的，比如咪鮮胺、抑霉唑、雙弧鹽、笨菌靈等。研究表明，咪酰胺和抑霉唑?qū)Ω涕偾嗝共　⒕G霉病、蒂腐病等采后病害具有較好的防控效果[10-11]，但是大量使用化學藥物會導致病原菌出現(xiàn)耐藥性，從而影響防治效果。近年來，生物防控越來越多被利用于動植物病害防治，比如利用拮抗微生物、抗菌素類物質(zhì)或者茶多酚、橘皮提取物、植酸等天然生物保鮮劑對病害進行防控。相較于物理和化學防控，生物防控具有綠色環(huán)保、經(jīng)濟等優(yōu)勢。芽孢桿菌屬由于具有較好的抑制植物病原菌的能力被廣泛用作農(nóng)業(yè)領域的生物控制劑[12]。其中貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)是一種新興的拮抗微生物，可產(chǎn)生多種次級代謝產(chǎn)物，如脂肽類抗生素、聚酮類化合物和抗菌蛋白等，具有廣譜的抑菌作用，被廣泛應用于動植物病害的生物防控[13]。如B.velezensis被制成殺菌劑，不僅有效防治真菌性病害還可以用于刺激植物生長，從萵苣變種皺葉根分離出的B.velezensis制成懸浮劑直接應用于萵苣幼苗，可以控制根腐病。從番茄組織中分離出來的菌株B.velezensisC2作為番茄黃萎病的生物制劑和生物防治劑具有較大的商業(yè)化潛力，可有效防治番茄黃萎病。C2的GC-MS分析顯示其具有抗真菌活性的揮發(fā)性代謝物[14]。因此，B.velezensis在植物病害生物防治上作為新的微生物資源具較大研究前景?！颈狙芯壳腥朦c】從采后霉爛的柚子表皮樣品上分離得到1株青霉，通過形態(tài)學鑒定和分子鑒定相結(jié)合的方法將其鑒定為皮落青霉(P.crustosum)，并利用貝萊斯芽孢桿菌發(fā)酵液對其進行抑菌試驗，檢測其對皮落青霉的抑制效果?！緮M解決的關鍵問題】當前國內(nèi)的微生物制劑較少，且多數(shù)制劑的活性較低，本研究為柑橘采后真菌病害的綠色防控提供理論與技術依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌源

采后明顯病變霉爛的沃柑采集于四川省德陽市中江縣，在實驗室進行分離純化致病后，將其編號為DYC1-1。生防菌株貝萊斯芽孢桿菌SB023由六盤水師范學院張曉勇老師提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌株的分離純化與鑒定 病原菌的分離。病原菌分離純化的方法參照方達中[15]的植病研究方法，從病變霉爛的柚子表面上挑取孢子，在PDA培養(yǎng)基上連續(xù)“Z”形劃線，28 ℃恒溫培養(yǎng)；菌落長出后，從單個分散的菌落上挑取孢子，再在PDA培養(yǎng)基上連續(xù)劃線進行純化，重復操作3次，直到分離純化出菌落形態(tài)特征一致的菌株。

形態(tài)鑒定。利用接種環(huán)將純化后的病原菌接種到PDA平板中央，28 ℃恒溫培養(yǎng)，觀察并記錄菌落的形態(tài)特征及動態(tài)變化。待菌落長出后，利用顯微鏡觀察菌絲和孢子的形態(tài)。在載玻片中央滴一滴棉藍染色液，用接種針在菌落邊緣挑取少量帶孢子的菌絲，將其分散在染液中，蓋上蓋玻片，用濾紙吸去多余染液，將載玻片放于顯微鏡下觀察。根據(jù)病原菌菌絲和孢子的特征并參考孔華忠[16]的方法，對病原菌進行初步的形態(tài)學鑒定。

分子鑒定。參照Bios pin真菌基因組DNA提取試劑盒提取病原菌株DYC1-1的基因組DNA，并以此DNA為模板，以通用引物ITS1和ITS4為引物，擴增核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS和細胞色素氧化酶1(CO1)基因片段，擴增產(chǎn)物測序后通過數(shù)據(jù)庫比對和系統(tǒng)發(fā)育樹的構建進行分子鑒定。PCR檢測病原菌株反應條件：94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min,30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，16 ℃保存。PCR擴增完成后，取5 μL 擴增產(chǎn)物點樣用1%瓊脂凝膠電泳檢測，通過凝膠成像系統(tǒng)進行觀察并拍照，然后將PCR擴增產(chǎn)物送昆泰銳(武漢)生物技術有限公司進行測序。

BLAST序列比對和系統(tǒng)發(fā)育進化樹構建。將測序序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行比對和同源性分析，同源性95%～99%鑒定為同一屬，99%以上可鑒定為同種，從而確定菌株種類[14]。分別選取與病原菌ITS和CO1序列同源性較高的菌株序列，將序列導入MEGA-X軟件進行clustalw多序列比對并對序列兩端剪齊，利用鄰接法(Neighbor-Joining)重復1000次構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

1.2.2 病原菌致病性實驗 將純培養(yǎng)的病原菌菌株接種至PDA培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)。待菌落長出后，用接種環(huán)刮取分生孢子放入裝有無菌水的EP管中充分洗脫，重復多次操作，然后用塞有棉花的注射器過濾，制備孢子懸液。取健康、無損傷的柚子和沃柑用無菌水清洗，表皮經(jīng)75%酒精擦洗后，用移液槍槍頭輕刺果實表皮并旋轉(zhuǎn)，以刺破表皮為宜，然后在刺破傷口接種20 μL孢子懸液，以接種等體積無菌水作為對照。將接種后的柑橘果實裝入保鮮袋內(nèi)并封口，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中貯藏，觀察并記錄發(fā)病癥狀的動態(tài)變化[15]，并利用十字交叉法測量病變部位的病斑大小。

1.2.3 貝萊斯芽孢桿菌發(fā)酵液的抑菌試驗 貝萊斯芽孢桿菌SB023經(jīng)PDB發(fā)酵5 d后，離心收集上清液并用0.22 μm濾器過濾制備發(fā)酵液，按照發(fā)酵液終濃度分別為0、1%、2%、3%、10%的比例添加到PDA培養(yǎng)基中倒?jié)舛忍荻绕桨?。取DYC1-1孢子懸液(1×107個/mL)50 μL均勻涂布在較薄的PDA培養(yǎng)基平板表面，28 ℃恒溫培養(yǎng)12 h后獲得種子平板；用打孔器從PDA平板上打取菌餅，用無菌牙簽挑取菌餅接種在不同濃度發(fā)酵液的PDA培養(yǎng)基平板中央，以0的平板為對照組，各濃度設置3個重復。28 ℃恒溫培養(yǎng)7 d后使用十字交叉法測量各個平板上菌落的直徑并計算抑菌率。

抑菌率(%)=(對照組菌落直徑-實驗組菌落直徑)/(對照組菌落直徑-接種菌餅直徑)[17]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2016、SPSS 24等軟件進行數(shù)據(jù)處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌鑒定

2.1.1 形態(tài)學特征 病原菌DYC1-1在PDA上28 ℃生長7 d的菌落直徑約為35 mm。菌落上有放射狀輪紋，質(zhì)地絨狀兼有粉末狀，分生孢子生長較快，能形成明顯的青綠色霉層；菌落的邊緣初始為白色，培養(yǎng)一段時間后變?yōu)楹稚?，培養(yǎng)基背面為淡黃色(圖1-A,1-B)。通過鏡檢觀察，菌株菌絲粗壯，有隔膜和分枝，分生孢子梗先端有1～2個分枝，分生孢子呈現(xiàn)球形或近球形，分生孢子鏈較稀疏，近圓柱狀(圖 1-C,1-D)。參照真菌鑒定手冊和中國真菌志的青霉屬及其相關有性型屬文獻資料描述[18-19]，將 DYC1-1初步鑒定為半知菌亞門青霉屬皮落青霉或擴展青霉。

A.菌落正面; B.菌落背面; C.菌絲(40×); D.孢子梗(40×)A.Positive side of colony; B.Colony back; C.Mycelium (40 ×); D.Spore peduncle (40 ×)圖1 病原菌株DYC1-1在PDA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of DYC1-1 strains on PDA medium

2.1.2 分子生物學 DYC1-1菌株分生孢子接種在PDB中培養(yǎng)3 d后收集菌絲體，改良CTAB法提取基因組DNA并進行PCR擴增。從圖2-A可知，PCR擴增條帶明顯，基因組DNA提取成功。以基因組DNA為模板，通用引物 ITS1和ITS4 PCR擴增引物(ITS1：5′-TCCGTAGGAACCTGCGG，ITS4：5′-TCCTCCGCTATTGATATGC，PenF1：5′-GACAAGAAGGTGAT TTTTATCTTC，AspR1：5′-TCCTCCGCTATTGATATGC)擴增出約550 bp的ITS片段(圖2-B)；以及青霉/曲霉鑒定引物PenF1和AspR1從DYC1-1基因組中擴增出約550 bp的CO1片段(圖2-C)。

將DYC1-1菌株ITS和CO1基因擴增產(chǎn)物測序分別獲得522和523 bp的DNA序列，BLAST比對顯示，DYC1-1的rDNA-ITS和CO1序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中皮落青霉(Penicilliumcrustosem)的序列一致性均為100%。利用MEGA 6將其與一致性最高的同源序列進行clustalw比對，基于ITS和CO1序列使用N-J法構建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)，DYC1-1與已鑒定的P.crustosum(MZ447552.1、EF180217.1)聚在同一進化枝，可信度為95%，將DYC1-1菌株鑒定為皮落青霉(P.crustosum)。

A.基因組DNA, M: 1 kb Ladder, 2: DYC1-1; B. ITS擴增產(chǎn)物, M.1 kb Ladder, 2.DYC1-1; C. CO1擴增產(chǎn)物, M.DS5000, 1.DYC1-1A. Genomic DNA, M: 1 kb Ladder, 2: DYC1-1;B. ITS amplification product, M.1 kb Ladder, 2.DYC1-1;C. CO1 amplification product, M.DS5000, 1.DYC1-1 圖2 DYC1-1基因組及PCR擴增產(chǎn)物電泳檢測Fig.2 The electrophoresis detection of DYC1-1 strains genomic DNA and PCR amplification product

圖3 菌株DYC1-1基于rDNA-ITS序列的系統(tǒng)進化發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree constructed by strain DYC1-1 based on rDNA-ITS

2.2 致病性實驗

將DYC1-1孢子懸液分別接種到柚子和沃柑表皮上，柚子和沃柑均發(fā)生病變，但是病原菌對沃柑的毒力強于柚子。接種2 dpi時，2種果實的接種處均出現(xiàn)了褐色斑漬，之后沃柑上的褐色斑漬迅速擴大，并長出藍綠色霉層(圖4-A)，10 dpi病斑直徑為40.5 mm；接種無菌水的對照組均未發(fā)生明顯腐爛和擴散，接種DYC1-1與用無菌水間的病斑直徑差異極顯著(P<0.01，圖4-B)。而DYC1-1接種在柚子表皮上的病變緩慢，10 dpi時病斑未形成明顯霉層，只在柚子皮層中有褐色侵染斑痕，但沒有大面積的腐爛(圖4-C，4-D)。所以，DYC1-1對不同種類柑橘的致病性有一定差異。同時，從DYC1-1回接發(fā)病的果實上可以分離出與接種菌株形態(tài)相同的菌株，根據(jù)科赫假設驗證說明所分離純化的DYC1-1是引起柑橘采后霉腐的病原菌。

2.3 貝萊斯芽孢桿菌發(fā)酵液對病原菌的影響

貝萊斯芽孢桿菌發(fā)酵液對菌株DYC1-1的生長具有一定抑制作用，發(fā)酵液濃度為1%、2%和3%的抑菌率分別為8.41%、8.73%和13.7%，發(fā)酵液濃度為10%的抑制率可達到37.8%，抑制率隨發(fā)酵液濃度的升高而升高(圖5-A,5-B)；而回歸分析估計貝萊斯芽孢桿菌SB023發(fā)酵液的半有效最大濃度EC50為8.2%。顯微鏡觀察顯示，與正常對照組菌絲相比，SB023發(fā)酵液添加組的DYC1-1菌絲有明顯的膨大形變和扭曲(圖5-C)，說明貝萊斯芽孢桿菌發(fā)酵液中存在誘導真菌菌絲畸變的活性物質(zhì)。

3 討 論

引起柑橘采后病害的病原青霉種類較多，主要有Penicilliumitalicum、P.digitatum、P.expansum、P.polonicum、P.chrysogenus等病原菌。準確的病原菌分類鑒定是研究各類病害的基礎，然而青霉菌屬的病原真菌在菌落形態(tài)特征上相似度較高，僅憑肉眼難以區(qū)分。此外，根據(jù)菌落形態(tài)，以分生孢子和孢子梗的特點進行鑒定的傳統(tǒng)形態(tài)鑒定法，存在難以準確到種、不可靠以及耗時長等問題。基于ITS基因的分子鑒定法被廣泛運用于病原菌的鑒定，該方法具有鑒定快速、準確度高的優(yōu)點。然而，有些青霉僅通過ITS序列無法將其鑒定到種，Seifert等[20]對青霉屬真菌的研究表明，CO1基因的種內(nèi)平均變異率小于 ITS基因的變異率,僅為0.06%，種間平均變異率為5.6%，CO1基因?qū)η嗝箤僬婢姆直媛蕛?yōu)于ITS。本研究分離的DYC1-1通過ITS序列比對和系統(tǒng)發(fā)育樹構建不能鑒定到具體的種，而通過形態(tài)鑒定與CO1分子鑒定相結(jié)合的方法將1株柑橘采后病原菌成功鑒定為皮落青霉(P.crustosum)，這為柑橘采后病原菌的準確鑒定及其多樣性研究提供一定參考。

A.DYC1-1在沃柑上的致病癥狀; B.DYC1-1接種沃柑與無菌水對照間的病斑直徑比較; C. DYC1-1在柚子上的致病癥狀；D. 柚子表皮內(nèi)側(cè)的發(fā)病癥狀。A、C、D上面是無菌水做對照，下面是接種DYC1-1 A. Pathogenic symptoms of DYC1-1 on citrus;B.Comparison of spot diameter between DYC1-1 inoculated fertile citrus and sterile water control; C.Pathogenic symptoms of DYC1-1 on grapefruit. D. Symptoms of the medial epidermis of grapefruit.A, C, D showed sterile water as control on the top, and DYC1-1 inoculation on the bottom圖4 病原菌DYC1-1的致病性實驗Fig.4 Pathogenicity experiment of DYC1-1

A.不同濃度的發(fā)酵液對菌株生長的影響; B. 不同濃度發(fā)酵液對DYC1-1的抑制率; C. 發(fā)酵液膨誘導DYC1-1菌絲的膨大與畸形化(40×)A. The effect of different concentrations of fermentation broth on the growth of strain; B. The inhibition rate of different concentrations of fermentation broth on DYC1-1; C. Expansion and deformity of DYC1-1 hyphae induced by fermentation broth expansion (40 ×)圖5 貝萊斯芽孢桿菌發(fā)酵液對病原菌的影響Fig.5 Effects of fermentation broth of B.velezensis on pathogenic bacteria

本研究從腐爛柚子上分離的DYC1-1能夠引起沃柑腐爛，而對柚子的致病性較弱，在不同種類的果實間致病性存在較大差異。在相同實驗條件下， DYC1-1對沃柑的毒力遠高于柚子，這可能是因為不同果實在結(jié)構和生理上存在差異。柚子常溫下可貯藏 2～4個月，有 “天然水果罐頭”之稱。在結(jié)構方面，柚子果皮厚，外果皮油胞大，含有的芳香油具有抗真菌入侵能力，中果皮有較厚的海綿層(白皮層)，內(nèi)果皮的囊瓣壁厚且硬，保護著汁胞[21]。實驗中的柚子不易被侵染，而分離病原菌的柚子樣品卻腐爛嚴重，可能是因為實驗中的柚子屬于不易感病型品種，它對病原菌具有更強的抗性，而分離菌株的樣品中江柚可能屬于易感病品種。此外，柑橘的病變腐爛往往是由多種致病菌共同作用引起，除果實的種類和品種外，影響柑橘果實霉爛的因素還包括果實的成熟度、果實的傷害、果實的儲存條件等[22]。因此，后期還需進一步研究更多的柑橘種類并進行同種類柑橘的橫向比較。

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilits)是較早應用于生物防治的拮抗微生物。Jiang等[23]研究表明，枯草芽孢桿菌可以通過產(chǎn)生iturin A等物質(zhì)干擾真菌的運輸、能量代謝和滲透壓，從而抑制病原真菌生長。貝萊斯芽孢桿菌是一種新型的拮抗微生物，其抑菌機制是通過產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)而具有廣譜抑菌作用。Chowdhury等[24]研究表明，貝萊斯芽孢桿菌產(chǎn)生的桿菌毒素等抗菌物質(zhì)會使真菌的菌絲體、細胞質(zhì)膜的形態(tài)發(fā)生改變，從而抑制真菌生長。此外，貝萊斯芽孢桿菌產(chǎn)生的伊枯草菌素等抗菌物質(zhì)會使細胞膜發(fā)生穿孔，導致內(nèi)容物流失[25]。目前皮落青霉是柑橘采后青霉病害的病原之一，但是關于皮落青霉對不同種類柑橘果實的致病性研究鮮有報道，關于貝萊斯芽孢桿菌在柑橘采后病害防控方面的研究和應用較少。本研究顯示，貝萊斯芽孢桿菌發(fā)酵液能引起DYC1-1菌絲發(fā)生膨大形變，說明貝萊斯芽孢桿菌能產(chǎn)生改變青霉細胞質(zhì)膜形態(tài)的抑菌活性物質(zhì)，10%的發(fā)酵液抑制率可達到37.8%，貝萊斯芽孢桿菌發(fā)酵液對皮落青霉具有一定的防效，利用貝萊斯芽孢桿菌等拮抗微生物來防治柑橘采后病害，在柑橘產(chǎn)業(yè)的綠色化發(fā)展上具有巨大的潛力。

4 結(jié) 論

通過病原菌形態(tài)特征觀察、擴增ITS和CO1基因片段進行分子鑒定，將從發(fā)病腐爛的柚子表皮上分離到的青霉DYC1-1鑒定為皮落青霉(Penicillium.crustosum)。通過回接驗證皮落青霉DYC1-1能夠不同程度地引起不同柑橘果實病變腐爛，是柑橘采后青霉病害的病原，但是對不同種類柑橘的致病能力存在差異，對沃柑的侵染能力較強，而對柚子雖有侵染性，但不造成大面積腐爛。貝萊芽孢桿菌發(fā)酵液對皮落青霉的生長具有一定的抑制效果，其半有效最大濃度約為8.7%，貝萊芽孢桿菌在柑橘病害綠色防控上有巨大的應用潛力。