孟雪蓮，劉松瑤，薛京蘇

(遼寧大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110036)

0 引言

老齡化問題已成為全球共性問題，根據(jù)中國的人口年齡結(jié)構(gòu)特點，中國社會構(gòu)成已經(jīng)符合典型的老齡化社會特點[1].阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是威脅老年人健康和生命的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一.全球老齡化問題的加劇，也導(dǎo)致了AD發(fā)病率的顯著上升.AD的主要臨床表現(xiàn)癥狀為記憶和認(rèn)知功能損傷，其主要的病理特征為Aβ斑塊在大腦皮質(zhì)、海馬等部位的堆積以及神經(jīng)元中神經(jīng)原纖維纏結(jié)(NFTs)的形成，進一步可引起神經(jīng)元的損害和死亡[2-6].AD的發(fā)病機制復(fù)雜多樣，目前應(yīng)用于臨床的藥物均以延緩疾病進程為主，尚無能終止疾病發(fā)展的藥物[7].

中醫(yī)在中國已經(jīng)發(fā)展了兩千余年，因其獨特的魅力，近年來受到了廣泛關(guān)注.與西藥不同，中藥是通過多靶點多途徑復(fù)合干預(yù)，實現(xiàn)對疾病的治療，不同途徑間也可能存在相互影響，以實現(xiàn)對系統(tǒng)和機體的整體調(diào)控[8-9].網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一門新興學(xué)科，它從系統(tǒng)層面揭示藥物對機體的整體調(diào)控作用，通過特定的數(shù)據(jù)分析方法尋找不同藥效成分的作用靶點和通路，闡釋藥物對疾病的干預(yù)的過程，實現(xiàn)了傳統(tǒng)中藥研究與現(xiàn)代藥理學(xué)研究的緊密聯(lián)系.網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的出現(xiàn)使得新藥研發(fā)從“一個基因、一種藥物、一個疾病”為主導(dǎo)的傳統(tǒng)模式轉(zhuǎn)變?yōu)椤熬W(wǎng)絡(luò)靶向、多組分療法”的新模式[10-12].

北豆根是防己科植物蝙蝠葛(Menispermum dauricum DC.)的干燥根莖，原名蝙蝠葛根，性寒涼，具有清熱、解毒、祛風(fēng)、止痛的功效，對多種炎癥具有治療作用[13-14].北豆根中活性成分眾多，其中生物堿類成分含量為1.7%～2.5%，由于其結(jié)構(gòu)的多樣性和生物活性的廣泛性成為研究的重點[15].北豆根常見的藥理作用有抑菌、抗心律失常、降壓、抗腫瘤、抗炎等[16-20]，近年來有文獻報道，北豆根主要成分蝙蝠葛堿具有抗AD作用[21-23].

本研究建立了針對北豆根活性成分抗AD的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析方法，尋找其潛在作用靶點和作用通路，通過相關(guān)方法分析其可能的作用機制，研究結(jié)果具有一定的理論和實際意義.

1 實驗方法

1.1 數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建

1.1.1 構(gòu)建北豆根主要活性成分的相關(guān)靶點數(shù)據(jù)庫

在TCMSP數(shù)據(jù)平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，https：//www.tcmspw.com/tcmsp.php)、BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(http：//bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/)中檢索北豆根的有效化學(xué)成分，以生物利用度(OB)、類藥性(DL)和含量作為條件篩選出研究對象.有效化學(xué)成分的2D結(jié)構(gòu)下載自PubChem數(shù)據(jù)庫(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)，將其導(dǎo)入SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(http：//www.swisstargetprediction.ch/)中，選擇人類(Homo sapiens)作為研究物種(下述研究過程均選擇人類為研究物種)，預(yù)測得到相關(guān)的潛在作用靶點.合并多個化學(xué)結(jié)構(gòu)的搜索結(jié)果，并去除重復(fù)項，輸入到string數(shù)據(jù)庫(https：//string-db.org/)中，篩選0.95置信區(qū)間的靶點，得到北豆根中主要化學(xué)成分的相關(guān)靶點數(shù)據(jù)庫.

1.1.2 構(gòu)建AD疾病靶點相關(guān)數(shù)據(jù)庫

以“Alzheimer′s disease”為檢索詞在GeneCards數(shù)據(jù)庫(https：//www.genecards.org/)、OMIM數(shù)據(jù)庫(https：//omim.org/)中搜索，查找與AD疾病相關(guān)的潛在基因靶點.經(jīng)篩選將疾病靶點輸入到string數(shù)據(jù)庫中，設(shè)置0.95置信區(qū)間，得到AD疾病靶點相關(guān)數(shù)據(jù)庫.

1.1.3 構(gòu)建“藥物成分-疾病”交集靶點數(shù)據(jù)庫

將1.1.1構(gòu)建的北豆根主要化學(xué)成分相關(guān)靶點數(shù)據(jù)庫和1.1.2構(gòu)建的AD疾病靶點相關(guān)數(shù)據(jù)庫導(dǎo)入到BioVenn軟件(http：//www.biovenn.nl/index.php)中交互處理，得到“藥物成分-疾病”交集靶點數(shù)據(jù)庫.

1.2 構(gòu)建蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)

將得到的交集靶點導(dǎo)入string數(shù)據(jù)庫，篩選0.95置信區(qū)間，以確保數(shù)據(jù)的可靠性，得到“藥物成分-疾病”交集靶點之間的相互作用信息.將相互作用信息導(dǎo)入到Cytoscape 3.7.2軟件，進行蛋白靶點間的拓?fù)浞治?

1.3 構(gòu)建“藥物成分-交集靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)

建立藥物成分、交集靶點、AD之間的成分-靶點、靶點-疾病對應(yīng)關(guān)系數(shù)據(jù)文件和相應(yīng)的屬性文件，采用Cytoscape 3.7.2軟件來構(gòu)建“藥物成分-交集靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)模型圖，進一步使用Network Analyzer功能進行拓?fù)鋮?shù)分析計算.

1.4 基因本體(GO)富集和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析

將“藥物成分-疾病”交集靶點導(dǎo)入到DAVID數(shù)據(jù)庫(https：//david.ncifcrf.gov/)中，并設(shè)置Identifier為OFFICIAL GENE SYMBOL、List Type為Gene List，進行GO富集分析和KEGG通路富集分析.篩選P<0.01的通路為可靠通路，利用OmicShare Tools(https：//www.omicshare.com/tools/home/index/index.html)可視化研究結(jié)果.

1.5 構(gòu)建“藥物成分-交集靶點-作用通路”網(wǎng)絡(luò)

篩選KEGG分析中的通路，得到關(guān)鍵靶標(biāo)參與的關(guān)鍵通路.建立藥物成分、交集靶點、作用通路、AD之間的成分-靶點、靶點-通路、靶點-疾病對應(yīng)關(guān)系數(shù)據(jù)文件和相應(yīng)的屬性文件，利用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建“藥物成分-交集靶點-作用通路”網(wǎng)絡(luò)模型圖，并進行分析.

1.6 分子對接驗證

利用Discovery Studio 2016 Client軟件對得到的北豆根主要活性成分與篩選得到的關(guān)鍵靶點蛋白進行分子對接驗證.

2 實驗結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建

根據(jù)篩選標(biāo)準(zhǔn)得到北豆根中7種主要活性成分(見圖1)，包括蝙蝠葛堿、粉防己堿(雙芐基四氫異喹啉類生物堿)、蝙蝠葛啡諾林堿、蝙蝠葛任堿(阿樸啡類生物堿)、蝙蝠葛辛(氧化異阿樸啡類生物堿)、光千金藤堿(原阿樸啡類生物堿)、青藤堿(嗎啡烷類生物堿).經(jīng)SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫預(yù)測和string數(shù)據(jù)庫篩選得到192個北豆根化學(xué)成分相關(guān)潛在作用靶點.數(shù)據(jù)庫檢索AD疾病靶點相關(guān)數(shù)據(jù)庫，經(jīng)篩選最終得到1 106個相關(guān)潛在基因靶點.將兩者導(dǎo)入BioVenn軟件中交互處理，得到92個交集靶點(見圖2).

圖1 北豆根7種主要活性成分

圖2 北豆根7種活性成分相關(guān)靶點與阿爾茨海默病相關(guān)靶點的交集靶點數(shù)

2.2 構(gòu)建蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)

將2.1得到的92個交集靶點輸入到string數(shù)據(jù)庫中，經(jīng)0.95置信區(qū)間篩選，得到85個“藥物成分-疾病”交集靶點之間的相互作用信息(見圖3).結(jié)果表明，src酪氨酸蛋白激酶(sarcomatyrosineprotein kinase，SRC)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活蛋白3(signal transducer and activator of transcription3，STAT3)、熱休克蛋白90AA1(heat shock protein 90AA1，HSP90AA1)、磷脂酰肌醇3-激酶調(diào)節(jié)亞基1(phosphatidylinositol 3-kinase regulatory subunit 1，PIK3R1)、磷脂酰肌醇-3-激酶催化亞基α(phosphatidylinositol 3-kinase catalytic subunitalpha，PIK3CA)、蛋白激酶Bα(protein kinase Bα，AKT1)等為度值(Degree)較大的靶點蛋白，可能是關(guān)鍵靶點.

圖3 “藥物成分-疾病”交集靶點PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 構(gòu)建“藥物成分-交集靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)

利用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建“藥物成分-交集靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)模型圖(見圖4)，并進行分析.結(jié)果涉及93個節(jié)點(包括7個化學(xué)成分、85個交集靶點和1個疾病)和278條邊，其中脾酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase，SYK)、sigmaR1受體(type 1 sigma receptor，SIGMAR1)、PIK3CA、Janus激酶3(Janus kinase 3，JAK3)、多巴胺D2受體(dopamine receptor D2，DRD2)、集落刺激因子1受體(colony stimulating factor 1 receptor，CSF1R)、AKT1等均為度值較大的靶點蛋白，并能與多個成分相互作用，證明了北豆根中的這7種主要活性成分具有多成分-多靶點共同作用的特點.

2.4 GO富集和KEGG通路富集分析

利用OmicShare Tools進行GO富集分析可視化，設(shè)置P<0.01，得到GO功能富集分析圖(見圖5)，涉及53個條目.其中，在生物過程(Biological Process)方面，主要涉及刺激反應(yīng)(response to stimulus)、細(xì)胞過程(cellular process)、代謝過程(metabolic process)、生物過程的調(diào)節(jié)(regulation of biological process)等；在細(xì)胞組分(Cellular Component)中，主要包括細(xì)胞器(organelle)、細(xì)胞膜(membrane)等；在分子功能(Molecular Function)方面，主要包括結(jié)合(binding)、催化活性(catalytic activity)等.

圖5 GO功能富集分析圖

KEGG通路富集分析得到高級氣泡圖(見圖6).在分析得出的108條潛在作用通路中，具有顯著意義的(P<0.01)有90條.結(jié)合相關(guān)文獻，篩選出與AD相關(guān)的通路有31條，如血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、紅細(xì)胞癌基因B(erythroblastic oncogene B，ErbB)、腫瘤壞死因子、Fc段受體Ⅰ(Fc epsilon receptor Ⅰ，F(xiàn)cε RI)、低氧誘導(dǎo)因子-1(Hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)和凋亡等信號通路，取排名前20的通路形成高級氣泡圖.提示北豆根可以通過以上多條通路來發(fā)揮治療AD的作用.

圖6 北豆根化學(xué)成分抗阿爾茨海默病作用靶點的KEGG富集氣泡圖

2.5 構(gòu)建“藥物成分-交集靶點-作用通路”網(wǎng)絡(luò)

通過KEGG分析，最終得到7個活性成分、69個關(guān)鍵核心靶點和31條相關(guān)通路.利用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建“藥物成分-交集靶點-作用通路”網(wǎng)絡(luò)模型圖，分析結(jié)果如表1所示.結(jié)果涉及108個節(jié)點(包括7個化學(xué)成分、69個交集靶點、31條通路和1個疾病)和668條邊.度值越大表示與之相連的節(jié)點越多，即在整個網(wǎng)絡(luò)中的調(diào)控作用越大.結(jié)果表明，度值較大的化學(xué)成分有粉防己堿(Tetrandrine，29)、蝙蝠葛啡諾林堿(Dauriporphinoline，26)、蝙蝠葛堿(Dauricine，24)等.度值較大的靶點蛋白有AKT1、PIK3CA、磷脂酰肌醇3-激酶催化亞基δ(phosphatidylinositol 3-kinase catalytic subunit delta，PIK3CD)、絲裂原活化蛋白激酶1(mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1)、PIK3R1等，可能是北豆根干預(yù)AD疾病發(fā)揮作用的靶點.這些靶點涉及的通路有磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B(PI3K-Akt)、大鼠肉瘤(Ras)、黏著斑、端粒結(jié)合蛋白(Rap1)等信號通路.其中PI3K-Akt通路涉及的靶點數(shù)最多(29個)，該通路可能是北豆根發(fā)揮抗AD作用的關(guān)鍵通路.

2.6 分子對接驗證

利用Discovery Studio 2016 Client軟件將得到的7個主要活性成分與篩選得到的關(guān)鍵靶點蛋白AKT1、PIK3CA、PIK3CD進行分子對接驗證(見表2).LibDockscore代表分子對接的吻合度，分?jǐn)?shù)越高代表配體與受體蛋白結(jié)合性越好.結(jié)果顯示，篩選出來的北豆根的7個主要活性成分都能與AKT1、PIK3CA、PIK3CD蛋白很好地結(jié)合，從而在PI3K-Akt通路上發(fā)揮作用.分子對接結(jié)果與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選結(jié)果一致，驗證了其可靠性.圖7—9為分別與3個蛋白結(jié)合性最好的化合物的分子對接結(jié)果.

表1 “藥物成分-交集靶點-作用通路”網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果

表2 北豆根主要活性成分與關(guān)鍵蛋白的對接結(jié)果

圖7 Dauricine-PIK3CD分子對接結(jié)果

圖8 Dauricine-PIK3CA分子對接結(jié)果

圖9 Dauricine-AKT1分子對接結(jié)果

3 分析與討論

本文聚焦當(dāng)下嚴(yán)重影響老年人身心健康的AD，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，研究了北豆根的主要活性成分對該疾病的潛在作用靶點和作用途徑，進而研究北豆根化學(xué)成分干預(yù)AD疾病的作用機制.經(jīng)篩選得到北豆根7種主要活性成分均為生物堿，揭示北豆根發(fā)揮抗AD的主要成分為生物堿類成分.預(yù)測該7種主要活性成分潛在作用靶點得到192個，其中與AD相關(guān)的靶點有92個，即“藥物成分-疾病”交集靶點.構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)和“藥物成分-交集靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果反映了北豆根主要活性成分與交集靶點在系統(tǒng)水平上的復(fù)雜相互作用，表明北豆根干預(yù)AD可能是由多種成分調(diào)控多個靶點來發(fā)揮療效的.GO富集分析結(jié)果表明，北豆根干預(yù)AD的相關(guān)生物過程涉及刺激反應(yīng)、代謝過程、對生物反應(yīng)的調(diào)控等.通過KEGG通路富集分析和篩選后，顯著作用通路有VEGF、ErbB、TNF、Fc ε RI、HIF-1和凋亡等信號通路，提示北豆根可能通過以上多條通路來發(fā)揮防治AD的作用.構(gòu)建“藥物成分-交集靶點-作用通路”網(wǎng)絡(luò)進一步分析，北豆根7個活性成分與69個AD關(guān)鍵核心靶點相關(guān)，并參與31條AD相關(guān)信號通路.結(jié)果表明，北豆根可能主要通過PI3K-Akt信號通路來發(fā)揮抗AD作用，AKT1、PIK3CA、PIK3CD、PIK3R1、IKBKB、GSK3B等可能為北豆根干預(yù)AD疾病的關(guān)鍵靶點.

PI3K-Akt通路可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化及凋亡等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，可以由多種生物因子激活，引發(fā)下游一系列信號級聯(lián)反應(yīng)，逐步發(fā)揮特定的生理反應(yīng)，調(diào)節(jié)機體狀態(tài)[24].Akt是PI3K的重要靶點，能夠調(diào)控下游相關(guān)蛋白[25-26].核因子κB抑制蛋白激酶β(IKBKB)是核因子κB抑制因子(IκB)激酶，Akt可以將IKBKB磷酸化并使之激活，從而使IκB磷酸化，進而使核轉(zhuǎn)錄因子核因子κB(NF-κB)與IκB解離開來，恢復(fù)其轉(zhuǎn)錄活性[27].NF-κB會介導(dǎo)炎性細(xì)胞因子如一氧化氮合酶(iNOS)、白介素(IL-1β)、白介素6(IL-6)及腫瘤壞死因子(TNF-α)等的釋放，過度的炎性反應(yīng)會促使AD的發(fā)生和發(fā)展[28].GSK3B作為Akt的下游底物，能夠通過NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路增加β-分泌酶(BACE1)介導(dǎo)APP蛋白的剪切，從而增加Aβ的生成和沉積[29]；GSK-3β也可以作用于Tau蛋白，經(jīng)GSK-3β作用后，Tau蛋白可發(fā)生過度磷酸化，進而導(dǎo)致神經(jīng)元中NFTs形成并發(fā)生細(xì)胞凋亡，該生理過程最終將表現(xiàn)出一系列AD的經(jīng)典癥狀[30]；同時也能通過調(diào)節(jié)凋亡蛋白家族Bcl-2等來實現(xiàn)對神經(jīng)細(xì)胞凋亡的調(diào)控[31].因此研究PI3K/Akt/GSK-3β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路具有重要意義，其與AD的高度相關(guān)性成為了深入了解AD的成因及拓展AD治療新方法新思路的關(guān)鍵.

結(jié)合PPI和“藥物成分-交集靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果，SRC、STAT3、HSP90AA1、SIGMAR1、DRD2、JAK3均可能是北豆根中活性成分干預(yù)AD的關(guān)鍵靶點蛋白，Ras、Rap1、叉頭轉(zhuǎn)錄因子(FoxO)、MAPK和TNF等信號通路都可能是其發(fā)揮藥效的關(guān)鍵通路.表明北豆根干預(yù)AD的作用是多成分多靶點綜合調(diào)控，多信號通路聯(lián)合作用的結(jié)果.

本文的研究結(jié)果表明了北豆根干預(yù)AD主要通過7種活性成分(蝙蝠葛堿、青藤堿、蝙蝠葛辛、光千金藤堿、蝙蝠葛任堿、蝙蝠葛啡諾林堿、粉防己堿)作用于AKT1、PIK3CA、PIK3CD、PIK3R1等關(guān)鍵靶點蛋白介導(dǎo)PI3K-Akt等信號通路來發(fā)揮作用，揭示了北豆根多成分-多靶點-多通路抗AD的作用特點.本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法初步預(yù)測了北豆根治療AD潛在的作用機制，其詳細(xì)機制仍需進一步的實驗驗證.本研究可為北豆根及其活性成分抗AD的體內(nèi)外作用機制研究提供思路.