董 娜，楊作豐，許 丹，齊六衛(wèi)，趙寶凱，謝書(shū)宇

1.沈陽(yáng)市農(nóng)業(yè)綜合行政執(zhí)法隊(duì)，遼寧沈陽(yáng) 110031；2.遼寧省農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，遼寧沈陽(yáng) 110032；3.沈陽(yáng)偉嘉牧業(yè)技術(shù)有限公司，遼寧沈陽(yáng) 110027；4.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖北武漢 430070

1 前言

冬季低溫環(huán)境不僅有利于環(huán)境中病毒、細(xì)菌的長(zhǎng)期存活，也顯著降低了消毒劑的消毒效果[1]，消毒液在室外-6 ℃下會(huì)發(fā)生凍結(jié)無(wú)法發(fā)揮其消毒作用。此外，在冷凍溫度下對(duì)畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)道路等表面噴灑消毒劑會(huì)變得濕滑，易導(dǎo)致養(yǎng)殖場(chǎng)人員的安全事故。

為了有效解決北方冬季消毒劑在低溫下因?yàn)閮鼋Y(jié)而不能呈現(xiàn)無(wú)消殺作用的問(wèn)題，項(xiàng)目組通過(guò)采用能降低水冰點(diǎn)和增加消毒劑分子擴(kuò)散能力的無(wú)機(jī)鹽、陽(yáng)離子活性劑和消毒劑的合理組方，利用多組分間的協(xié)同作用開(kāi)發(fā)出在-35 ℃的超低溫條件下仍然具有高效消殺作用的防凍消毒劑，為解決我國(guó)北方地區(qū)畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)冬季消毒面臨的低溫和消毒效果效率差的難題提供新的解決方案。本研究通過(guò)抗凍試驗(yàn)測(cè)定其防凍能力，并通過(guò)瓊脂擴(kuò)散法以及殺菌時(shí)間曲線評(píng)價(jià)其在畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)常溫和超低溫的殺菌活性。

2 材料與方法

2.1 試驗(yàn)材料

防凍消毒劑、戊二醛溶液、碘伏市場(chǎng)采購(gòu)。

LB肉湯，青島海博生物科技有限公司。

LB瓊脂，青島海博生物科技有限公司。

金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門(mén)氏菌保存于國(guó)家獸藥殘留基準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室(華中農(nóng)業(yè)大學(xué))。

2.2 防凍測(cè)試

準(zhǔn)確稱量防凍消毒劑，并將其配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%、10%、15%、20%、25%的10 mL溶液，將其放入-70 ℃冰箱，每間隔10 min利用低溫溫度計(jì)測(cè)量防凍液的溫度，測(cè)量每個(gè)濃度梯度開(kāi)始凍結(jié)的臨界溫度，每個(gè)濃度3個(gè)重復(fù)。

2.3 抗菌活性測(cè)試

2.3.1 瓊脂擴(kuò)散法

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門(mén)氏菌懸液分別稀釋至107CFU/mL的濃度，然后將100 μL的稀釋細(xì)菌懸液均勻地涂布在瓊脂培養(yǎng)基的表面。均勻涂布后，在每個(gè)瓊脂培養(yǎng)皿制作3個(gè)孔，分別將200 μL不同稀釋濃度的防凍消毒液、碘伏以及戊二醛稀釋液加入瓊脂培養(yǎng)皿的小孔中。隨后，將瓊脂培養(yǎng)皿置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～18 h，觀察各孔周?chē)囊志Υ笮　?/p>

2.3.2 低溫殺菌試驗(yàn)

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門(mén)氏菌懸液加入2 mL LB肉湯中，使其菌液濃度為107CFU/mL。隨后將防凍消毒劑、碘伏以及戊二醛稀釋液加入上述 LB肉湯中，使防凍消毒劑的最終濃度為5%、10%、20%以及對(duì)應(yīng)濃度的戊二醛和碘液。將含有菌液和消毒劑的試管置于-20 ℃的冷室中，靜止孵育12 h將菌液按10倍比稀釋后，取100 μL稀釋液均勻涂布到瓊脂培養(yǎng)皿，在37 ℃下孵育24 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。每個(gè)濃度重復(fù)3次。

3 結(jié)果

3.1 防凍作用

防凍試驗(yàn)研究表明，防凍消毒劑具有良好的抗凍和耐低溫作用，其在5%、10%、15%、20%和25%濃度下分別抵抗-5、-11、-14、-22、-35 ℃的超低溫。上述結(jié)果表明，該防凍消毒劑抗凍性能良好，可以有效抵抗-35 ℃的超低溫。本品抗凍作用呈現(xiàn)濃度依賴性，隨著濃度增加效果顯著增強(qiáng)。

3.2 抗菌活性

3.2.1 對(duì)金黃色葡萄球菌的殺菌活性

瓊脂擴(kuò)散法研究表明，在加入不同濃度的防凍消毒劑溶液的小孔周?chē)囊志γ黠@伴隨著濃度的升高而增大，表明防凍消毒劑對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果呈濃度依賴性。

在-20 ℃的低溫殺菌曲線試驗(yàn)結(jié)果表明，防凍消毒劑殺菌效果極為顯著，尤其20%的防凍消毒劑溶液使金黃色葡萄球菌減少了8.59 log，而市售消毒劑戊二醛和碘伏在高濃度下僅使其減少5.7 log和4.34 log。在-20 ℃下5%的防凍消毒劑溶液使金黃色葡萄球菌減少了6.52 log，而戊二醛稀釋液僅能降低4.9 log，碘伏幾乎對(duì)金黃色葡萄球菌無(wú)殺滅效果。因此，相比于市售戊二醛和碘液，該防凍消毒劑在不同濃度下對(duì)金黃色葡萄球菌的殺滅效果都更為顯著。

3.2.2 對(duì)大腸桿菌的殺菌活性

殺菌活性試驗(yàn)表明，在高、低濃度下，3種不同消毒劑的微生物抑菌圈依次為：防凍消毒劑＞戊二醛＞碘伏。在不同濃度下，防凍消毒劑抑菌圈均顯著大于戊二醛和碘伏。因此，防凍消毒劑在高低濃度下對(duì)大腸桿菌抑菌活性均顯著強(qiáng)于市售消毒劑戊二醛和碘液在推薦劑量對(duì)大腸桿菌的抑菌活性。

在-20 ℃的低溫殺菌曲線試驗(yàn)結(jié)果表明，防凍消毒劑、戊二醛以及碘伏對(duì)大腸桿菌均表現(xiàn)出良好的殺菌活性。在推薦的不同劑量下，防凍消毒劑在殺菌活性均顯著大于市售的戊二醛和碘伏。因此，在3種不同消毒劑中，防凍消毒劑對(duì)大腸桿菌殺滅作用更加顯著。

3.2.3 對(duì)沙門(mén)氏菌的殺菌活性

瓊脂擴(kuò)散法結(jié)果所示，在不同濃度下，3種消毒劑中僅該防凍消毒液有明顯的抑菌圈。該防凍消毒液的抑菌圈隨著濃度的增大而增加，而戊二醛和碘液不管是在高濃度還是在低濃度的情況下，其抑菌圈均不明顯。由此可見(jiàn)，該防凍消毒液在高、低濃度下對(duì)沙門(mén)氏菌抑菌活性均顯著強(qiáng)于市售消毒劑戊二醛和碘液在推薦劑量對(duì)沙門(mén)氏菌的抑菌活性。

在-20 ℃的低溫殺菌曲線試驗(yàn)結(jié)果表明，防凍消毒液和戊二醛對(duì)沙門(mén)氏菌均表現(xiàn)出良好的殺菌效果，而碘伏不管是在高濃度還是低濃度條件下對(duì)沙門(mén)氏菌幾乎沒(méi)有殺滅效果。盡管戊二醛和防凍消毒液都對(duì)沙門(mén)氏菌表現(xiàn)出良好的殺菌效果，在推薦使用劑量下的菌落計(jì)數(shù)計(jì)數(shù)來(lái)看，防凍消毒液更具有優(yōu)勢(shì)，尤其是20%的防凍消毒溶液對(duì)沙門(mén)氏菌的殺滅效果達(dá)到10.12 log。因此，防凍消毒液在低溫呈現(xiàn)比戊二醛和碘附更強(qiáng)的殺滅作用。

4 討論

由試驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，該防凍消毒液具有高效的防凍消毒效果，可用于解決低溫下消毒的難題，為解決我國(guó)北方地區(qū)畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)在冬季消毒面臨的低溫凍結(jié)和消毒效果差的難題提供新的解決方案，對(duì)北方冬季非洲豬瘟等動(dòng)物疫病的防控提供了技術(shù)和產(chǎn)品保障。該防凍消毒劑具有良好的抗凍消毒作用，其在-35 ℃的超低溫條件下仍然具備消毒作用。這是因?yàn)楸酒凡捎脽o(wú)機(jī)鹽的復(fù)配和表面活性的協(xié)同作用，在有效降低水的冰點(diǎn)的同時(shí)，提升了消毒效果，好于單品的抗凍效果。無(wú)機(jī)鹽溶解于水后，能夠降低水的冰點(diǎn)溫度，通過(guò)陽(yáng)離子表面活性劑的復(fù)配增強(qiáng)了鹽離子降低水冰點(diǎn)的能力，在超低溫下具有防凍功能。本品抗凍作用呈現(xiàn)濃度依賴性，隨著濃度增加效果顯著增強(qiáng)。建議在北方冬季使用過(guò)程中，根據(jù)外界溫度合理配制消毒劑濃度。

常規(guī)和低溫抗菌活性試驗(yàn)研究表明，防凍消毒液在5%～20%的濃度下均呈現(xiàn)強(qiáng)大的殺菌效力，并呈現(xiàn)濃度依賴性。高濃度金屬離子、OH-和陽(yáng)離子表面活性劑復(fù)配可使病毒、細(xì)菌蛋白變性沉淀，增強(qiáng)其細(xì)胞通透性，使微生物體破裂死亡，呈現(xiàn)高效的消殺作用，并且對(duì)芽孢具有消殺活性。另外，防凍消毒液溶解后，液體的高流動(dòng)性和放熱作用可加快消毒劑分子的擴(kuò)散速率，增強(qiáng)消毒劑分子進(jìn)入微生物體的效率，從而呈現(xiàn)強(qiáng)大的消毒消殺作用。

從防凍和消殺試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，該防凍消毒液可以為我國(guó)北方地區(qū)畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)在冬季消毒面臨的的低溫凍結(jié)和消毒效果差的難題提供新的解決方案，并為北方冬季非洲豬瘟等動(dòng)物疫病消毒提供技術(shù)和產(chǎn)品支持。