尹華陽，董廣平*

（1.松材線蟲病預(yù)防與控制技術(shù)國家林草局重點實驗室，安徽 合肥 230031；2.安徽省林業(yè)科學(xué)研究院，安徽 合肥 230031）

松材線蟲病又稱松樹萎蔫病，是一種由松材線蟲對易感松樹寄生、取食引起其死亡的病害，由于其發(fā)病快、致死率高，被稱為松樹的“癌癥”[1-2]。我國于1982年在南京中山陵的松林中首次發(fā)現(xiàn)松材線蟲病，短時間內(nèi)快速蔓延至多個省市，引起松林大片枯死，給我國松林資源造成了巨大的損失，并且隨著松材線蟲適應(yīng)力的增強，松材線蟲病逐漸開始向高海拔或低溫地區(qū)松林蔓延，對我國的生態(tài)安全造成了嚴重的威脅[3-4]。目前松材線蟲病防控采用以清理病死松樹為核心，以媒介昆蟲防治、打孔注藥等為輔助的綜合防治策略[5]。其中，打孔注藥具有簡便、高效、持效期長的優(yōu)點，是一種被廣泛使用防治松材線蟲病的手段。

阿維菌素和甲維鹽是兩種被廣泛應(yīng)用于松材線蟲病防控的藥劑。阿維菌素是由土壤鏈霉菌（Streptomyces avermitilis）發(fā)酵產(chǎn)生的十六元大環(huán)內(nèi)酯類化合物，對蟲、螨、線蟲等具有高效低毒廣譜的生物活性[6]；其有多個同系物，其中阿維菌素B1a具高活性、低毒性優(yōu)勢，是主要的產(chǎn)業(yè)化對象[7]。甲維鹽是美國Merck公司以阿維菌素B1a和B1b同系物加工獲得的衍生物，實驗室內(nèi)殺蟲活性數(shù)倍于天然阿維菌素且對哺乳動物有更低的毒性[8-9]。研究表明，阿維菌素和甲維鹽是具有高效、持效期長、環(huán)境友好等優(yōu)點的農(nóng)藥[10]，但關(guān)于兩種藥劑在實踐中的對比研究報道較少。本研究采用阿維菌素和甲維鹽對馬尾松進行注干施藥，測定藥劑在樹體不同部位的殘留量，并通過人工接種松材線蟲進行藥效評價，以期為注干施藥防治松材線蟲病提供相關(guān)依據(jù)和實踐經(jīng)驗。

1 試驗地概況

試驗林分位于安徽省滁州市全椒縣瓦山林場（117°53′58"E，32°10′21"N），為馬尾松純林。該地馬尾松樹齡為30年，平均樹高15 m，長勢相差不大。

2 材料與方法

2.1 試驗材料

2.1.1 藥劑與試劑

阿維菌素標(biāo)準品（純度95%）和甲維鹽標(biāo)準品（純度95%）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲酸、甲醇、乙腈、二氯甲烷和乙酸銨，均為色譜純（購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；3%甲維鹽微乳劑（安徽森科生物科技有限公司）、3.2%阿維菌素乳油（杭州益森鍵生物科技有限公司）。

2.1.2 儀器設(shè)備

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜、ESI電噴霧離子源）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；渦旋儀；電子天平；超聲波脫氣儀；移液器等。

2.1.3 色譜-質(zhì)譜條件[11]

（1）色譜條件

色譜柱型號為：賽默飛Hypersil GOLD HPLC C18（100 mm×2.1 mm，5 μm)；流動相：A相甲醇為0.1%甲酸，B相為0.2%乙酸銨；柱溫：30℃；進樣量：10 μL；流速：150 μL/min；運行時間：10 min。

（2）質(zhì)譜條件

電噴霧離子源、正離子采集、傳輸管溫度為270℃、噴霧電壓3 000 V。甲維鹽的質(zhì)譜參數(shù)為母離子質(zhì)荷比886.2，子離子質(zhì)荷比為82、157；碰撞能量分別為45、33 eV；阿維菌素的質(zhì)譜參數(shù)為母離子質(zhì)荷比890.7，子離子質(zhì)荷比為307、567；碰撞能量分別為22、13 eV。

2.1.4 試驗蟲源

試驗用松材線蟲來自松材線蟲病預(yù)防與控制技術(shù)國家林草局重點實驗室鑒定保存的蟲株HN。松材線蟲在長滿灰葡萄孢（Botrytis cinerea)的PDA培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，待將菌絲消耗完畢后，采用Berman漏斗法分離松材線蟲[12]，用離心機低速離心濃縮制備10 000條/mL的線蟲液備用。

2.2 試驗方法

2.2.1 注干施藥

2020年3月，在試驗地選取樹高、胸徑相近的馬尾松，按照廠家說明，在距樹基部1 m處用手電鉆斜向下45°打孔，插入開孔的藥瓶，在尾部扎透氣孔，并于10 min后確認無藥劑漏出。每種藥劑各注干10株馬尾松，每株馬尾松施用1瓶（50 mL）藥劑。設(shè)置對照組，以相同方法注入50 mL無菌水。懸掛標(biāo)識牌并記錄。

2.2.2 藥劑含量標(biāo)準曲線的建立

稱取10.0 mg阿維菌素或者甲維鹽標(biāo)準品于100 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容，配制成100 mg/L母液，再逐級稀釋成0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、5.0 mg/L標(biāo)準溶液后進樣分析。以濃度為橫坐標(biāo)，質(zhì)譜峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準曲線。

2.2.3 加樣回收率測定

分別以馬尾松木屑和松針為基質(zhì)檢測加樣回收率。取馬尾松木段粉碎過篩后，向木屑中加入阿維菌素或者甲維鹽標(biāo)準品，加入量分別為0.1、0.5、5.0、10.0 mg/kg。稱取10 g樣品，加入20 mL乙腈，震蕩混勻2 min，5 000 r/min離心10 min，取10 mL上層有機相70℃水浴下氮氣吹干，加入3 mL甲醇復(fù)溶，再加入2 mL去離子水混勻，過0.2 μm有機濾膜，Carb/NH2小柱過濾，LC-MS/MS檢測。另外，取馬尾松松針，液氮冷凍后粉碎加入標(biāo)準品，余下操作同上。

2.2.4 樹體內(nèi)藥劑殘留量測定

注干施藥6個月和18個月后，取打孔位置上方1 m處木質(zhì)部樣品，并剪取樹冠處枝條收集松針樣品。按照“2.2.3”方法進行提取純化，在“2.1.3色譜-質(zhì)譜條件”下對藥劑殘留量進行檢測。

2.2.5 效果評價試驗

2020年8月，對試驗組和對照組的馬尾松全部接種松材線蟲，每株馬尾松接種10 000條松材線蟲，定期觀察發(fā)病情況，按照以下公式計算發(fā)病率，評價防治效果。

式中，D為防治效果，Dc為對照組松樹發(fā)病率，Dt為注干施藥區(qū)松樹發(fā)病率。

3 結(jié)果與分析

3.1 標(biāo)準曲線與定量下限

對配制的標(biāo)準溶液（0.01～5.0 mg/L）進樣檢測，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)x、峰面積為縱坐標(biāo)y繪制標(biāo)準曲線。阿維菌素的線性回歸方程為y=7.599x+13.214，相關(guān)系數(shù)為0.995 6；甲維鹽的線性回歸方程為y=9.654x-1.359，相關(guān)系數(shù)為0.998 9。相關(guān)系數(shù)均大于0.995，說明該方法下阿維菌素和甲維鹽在0.01～5.0 mg/L范圍內(nèi)，具有良好的線性關(guān)系。以樣品檢測質(zhì)譜圖空白平穩(wěn)處信噪比（s/n）的10倍作為定量下限，測得阿維菌素和甲維鹽的定量下限為0.002 mg/L。

3.2 加樣回收率

按照試驗方法分別檢測藥劑樣品馬尾松木屑和松針中的加樣回收率，4個濃度水平各重復(fù)測定5次。測得阿維菌素在木屑中的回收率范圍為79.61%～86.44%，相對標(biāo)準偏差（RSD）范圍為1.55%～3.98%；在松針中的回收率范圍為82.40%～86.64%，相對標(biāo)準偏差（RSD）范圍為1.01%～3.29%。測得甲維鹽在木屑中的回收率范圍為82.05%～86.36%，相對標(biāo)準偏差（RSD）范圍為2.03%～3.34%；在松針中的回收率范圍為84.81%～87.64%，相對標(biāo)準偏差（RSD）范圍為1.20%～4.22%（見表1）。兩種藥劑各加樣濃度在馬尾松木屑和松針中的回收效果較好，總體標(biāo)準偏差較小，說明本檢測方法可以檢測阿維菌素和甲維鹽殘留量。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果（n=5）

3.3 注干后藥劑殘留情況

注干施藥6個月后，施用3%甲維鹽微乳劑處理，在馬尾松木質(zhì)部和松針中均能檢測到甲維鹽殘留；在木質(zhì)部中的平均濃度為28.743±9.855 mg/kg，在松針中的平均濃度為9.997±3.125 mg/kg。施用3.2%阿維菌素乳油處理，在馬尾松的木質(zhì)部能檢測到阿維菌素殘留，平均濃度為19.861±3.770 mg/kg，但有7株松樹松針質(zhì)譜峰低于檢測限值，無法測量。18個月后，施用3%甲維鹽微乳劑處理，在木質(zhì)部和松針中還能檢測到甲維鹽殘留，但濃度已明顯降低；在木質(zhì)部的平均濃度為10.233±4.217 mg/kg，在松針中的平均濃度為2.189±0.965 mg/kg。施用3.2%阿維菌素乳油處理，在馬尾松的木質(zhì)部中殘留量為3.920±2.987 mg/kg，松針中殘留量已無法測量（見表2）。

表2 注干施藥后甲維鹽和阿維菌素殘留濃度

3.4 兩種藥劑的防治效果評價

在接種松材線蟲3個月后，無菌水注干的對照處理馬尾松林部分出現(xiàn)針葉萎蔫枯黃的發(fā)病癥狀，發(fā)病率為60%，并且隨著時間增長不斷升高，至接種6個月后全部發(fā)病。兩個施藥處理在接種松材線蟲13個月（即注干施藥后18個月）內(nèi)的防效為100%，但在15個月時（即注干施藥后20個月）均開始發(fā)病，至接種19個月（即注干施藥后24個月）后，3.2%阿維菌素乳油的防效為60%，3%甲維鹽微乳劑的防效為80%（見表3）。

表3 兩種藥劑注干施藥的防治效果

4 結(jié)論與討論

目前，松材線蟲病防治注干藥劑產(chǎn)品基本以甲維鹽和阿維菌素為有效成分，劑型以乳油和微乳劑居多。黃俊等[13]對馬尾松注干施用1%阿維菌素微囊劑，結(jié)果證明藥劑效果顯著，施藥區(qū)病死率低于2%。李橋等[14]研究證實，以甲維鹽、阿維菌素、啶蟲脒為主要成分的藥劑注干馬尾松防治效果在80%以上，甲維鹽施藥1年后樹體內(nèi)仍有殘留。李長強等[15]對黑松注干施用甲維鹽微乳劑，注藥2年后，在注干點以上不同部位仍能檢測出甲維鹽殘留；接種松材線蟲1.5年后，按松樹地徑2 mL/cm注入甲維鹽處理的防效為91.7%。這些研究均證明了注干藥劑對松材線蟲病防治的顯著效果，但未見針對藥劑主要成分和劑型進行對比評價研究。本研究以阿維菌素和甲維鹽為有效成分的兩種不同劑型注干藥劑對馬尾松進行注干施藥，利用LC-MS/MS檢測方法探究了兩者在樹體內(nèi)的動態(tài)殘留量。結(jié)果表明，施用3%甲維鹽微乳劑18個月后，在馬尾松木質(zhì)部和松針中還能檢測到甲維鹽殘留，也間接證實了李長強等的研究結(jié)果，甲維鹽對松材線蟲有長效的毒力[16]；3.2%阿維菌素乳油注干6個月后在松針中已不能檢測到藥劑殘留，在注干18個月后的木質(zhì)部殘留量明顯降低，這可能與阿維菌素乳油粒徑較大、面張力低、樹體內(nèi)傳導(dǎo)效果較差等因素相關(guān)[17]。另外，對處理組和對照組馬尾松人工接種松材線蟲進行藥效評價。結(jié)果表明，兩種藥劑注干施藥后18個月內(nèi)可有效防止松材線蟲病的發(fā)生，其中3.2%阿維菌素乳油防效在注干施藥24個月時降低明顯。分析認為造成這種情況的原因：一方面甲維鹽的理論毒性更高；另一方面，微乳劑相較于傳統(tǒng)乳油有更長的持效期，在樹體內(nèi)可能有更好的傳導(dǎo)效果。

本試驗還對甲維鹽和阿維菌素的LC-MS/MS檢測方法進行了探索，在該方法下阿維菌素和甲維鹽在0.01～5.0 mg/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，在松針和木屑中的加樣回收率大于79.61%，相對標(biāo)準偏差小。說明該方法適用于松樹中阿維菌素和甲維鹽殘留量的檢測。