張 艷， 劉成元， 吳旭東， 陳 進(jìn)

(江蘇省鹽城市第一人民醫(yī)院， 江蘇 鹽城 224000)

肝細(xì)胞性肝癌(HCC)在全世界范圍內(nèi)被列為新發(fā)癌癥病例的第五大原因，也是導(dǎo)致男性癌癥死亡的第二大原因 ，慢性肝病如病毒性肝炎、酒精及非酒精性脂肪性肝病是其主要病因。外科手術(shù)、介入、靶向及免疫治療是目前HCC治療的主要手段，但HCC治療后復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移率仍高，患者總體預(yù)后仍差。因此，更好地了解HCC發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，挖掘潛在的治療靶點(diǎn)，對于HCC的診治具有重要意義。雙特異性磷酸酶(DUSPs)屬于一個(gè)家族，成員包括DUSP1-28，其編碼的蛋白質(zhì)主要負(fù)責(zé)通過選擇性去磷酸化絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)參與多種生物學(xué)功能的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)包括蛋白泛素化、蛋白酶體降解、氧化、磷酸化、甲基化等[1]。研究表明DUSPs與腫瘤的進(jìn)展有關(guān)：如DUSP1、6高表達(dá)于乳腺癌組織，并與乳腺癌患者的術(shù)后復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)；在功能上，差異化表達(dá)的DUSPs可能通過誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞干性促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生發(fā)展[2]。但DUSPs在HCC中是否存在差異性表達(dá)及其臨床意義仍未得到研究。本研究通過HCC公共數(shù)據(jù)與本院臨床病理數(shù)據(jù)分析，明確在mRNA和蛋白水平上癌與癌旁組織差異性表達(dá)的DUSPs，分析其與臨床病理特征、預(yù)后、免疫細(xì)胞浸潤的相關(guān)性，并進(jìn)一步探討差異性表達(dá)的DUSPs在HCC發(fā)生發(fā)展中的生物學(xué)功能。以期為HCC的診斷與治療提供新的靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1公共數(shù)據(jù)來源與分析:本研究中，HCC癌與癌旁組織中差異化表達(dá)的DUSPs首先通過Oncomine數(shù)據(jù)庫(https://www.oncomine.org/)進(jìn)行初步篩選，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的DUSPs進(jìn)一步通過GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn/)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行驗(yàn)證[3]。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用T檢驗(yàn)，P<0.05代表差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過GEPIA初步明確差異化表達(dá)的DUSPs與HCC患者總生存率(OS)的關(guān)系，再進(jìn)一步通過Kaplan-Meier plotter (http://kmplot.com/analysis/) 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行驗(yàn)證與亞組分析[4,5]。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用Log rank檢驗(yàn)，P< 0.05代表差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。從TCGA(https://portal.gdc.cancer.gov/)數(shù)據(jù)庫下載HCC患者臨床特征與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，通過二分類回歸檢驗(yàn)差異化表達(dá)的DUSPs與HCC患者年齡、性別、病理分級、腫瘤分期的關(guān)系[6]；并通過COX比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析DUSPs與HCC患者OS的獨(dú)立相關(guān)性，P<0.05代表差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?；蚋患治?GSEA)軟件(https://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp)用于預(yù)測DUSPs在HCC發(fā)生發(fā)展中的生物學(xué)功能。TIMER(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)數(shù)據(jù)庫用于進(jìn)一步分析差異化表達(dá)的DUSPs與肝癌組織中不同免疫細(xì)胞浸潤程度及免疫檢查點(diǎn)相關(guān)分子表達(dá)的相關(guān)性，相關(guān)性系數(shù)r表示相關(guān)性大小，P<0.05代表結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[7]。

1.2臨床資料:收集本院2016年1月至2018年12月經(jīng)手術(shù)切除HCC的癌與癌旁配對組織，記錄HCC患者的性別、年齡、AFP定量值、腫瘤分級、分期。腫瘤的病理分級采用Edmondson分級法，根據(jù)腫瘤細(xì)胞的分化程度分為I～I(xiàn)V。腫瘤的TMN分期采用第八版AJCC分期標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)腫瘤大小、侵犯程度分為I～I(xiàn)V期。

1.3免疫組化分析:配對的癌與癌旁組織中的DUSP12表達(dá)采用免疫組化(IHC)的方法進(jìn)行染色。DUSP12一抗購自Sigma-Aldrich，貨號為HPA008840，二抗購自中杉金橋，貨名為免疫組化通用型試劑盒，貨號為PV-6000；一抗稀釋比例1∶50，免疫組化步驟按照商品試劑盒說明書進(jìn)行。染色完成后，每張切片在顯微鏡下5個(gè)高倍視野下(200x)進(jìn)行DUSP12陽性細(xì)胞的觀察計(jì)數(shù)。

1.4統(tǒng)計(jì)分析:GraphPad7.0用來處理本院收集病歷的臨床、病理及DUSP12基因蛋白表達(dá)的數(shù)據(jù)，兩組間DUSP12基因蛋白表達(dá)差異采用T檢驗(yàn)進(jìn)行分析，P<0.05代表差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1DUSP基因家族在HCC患者癌與癌旁組織中的mRNA表達(dá)差異:Oncomine檢索DUSP基因家族在不同癌癥中癌與癌旁組織中的表達(dá)差異如圖1所示：在HCC中，DUSP1、DUSP2、DUSP5、DUSP6、DUSP10、DUSP12 mRNA在癌與癌旁組織中表達(dá)存在差異；進(jìn)一步通過GEPIA對上述差異表達(dá)的DUSPs進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果如圖2所示，與正常組織相比，DUSP1、5、6 mRNA仍在HCC的腫瘤組織中低表達(dá) (P<0.05)，而DUSP12則仍高表達(dá)于HCC腫瘤組織(P<0.05)。

圖1 基于Oncomine數(shù)據(jù)庫的DUSP基因家族在泛癌癌與癌旁組織中的mRNA表達(dá)差異。

圖2 基于GEPIA數(shù)據(jù)庫的HCC差異DUSP基因家族mRNA表達(dá)驗(yàn)證

2.2DUSP基因家族的mRNA差異化表達(dá)與HCC患者預(yù)后及臨床特征的關(guān)系:GEPIA批量分析了DUSP基因家族與HCC患者OS的關(guān)系，結(jié)果顯示DUSP10、DUSP11、DUSP12、DUSP13、DUSP14、DUSP23的mRNA表達(dá)與患者OS生存率有關(guān)(圖3A)。結(jié)合mRNA差異化表達(dá)結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)在DUSP基因家族中，DUSP12不僅在HCC的癌組織中高表達(dá)，同時(shí)高表達(dá)該基因的患者OS下降(HR：2，Log rank P：0.00017)。Kaplan-Meier plotter繪制的OS生存曲線也驗(yàn)證出高表達(dá)DUSP12的HCC患者OS下降(HR：1.82，logrank P：0.00091)，亞組分析結(jié)果顯示高表達(dá)DUSP12對HCC患者OS的影響?yīng)毩⒂诜N族(白種人或亞洲人)、腫瘤分期(Ⅰ+Ⅱ期或Ⅲ+Ⅳ期)、飲酒(不飲酒或飲酒)、病毒性肝炎(無病毒性肝炎或病毒性肝炎)(圖3B-G)。進(jìn)一步，我們從TCGA數(shù)據(jù)庫中下載HCC患者臨床與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，采用多因素COX風(fēng)險(xiǎn)比例回歸模型分析DUSP12 mRNA表達(dá)對患者OS的影響，結(jié)果如表1所示，多元COX分析結(jié)果提示DUSP12 mRNA基因表達(dá)水平與患者OS下降獨(dú)立相關(guān)(HR：1.123，95%CI：1.049～1.203)。在臨床特征的比較中，表2顯示DUSP12 mRNA表達(dá)水平與腫瘤的病理分級正相關(guān)(OR：2.904，95%CI：1.871～4.554)。

表1 基于TCGA數(shù)據(jù)庫的DUSP12與HCC患者OS的uniCox與mutiCox分析

表2 基于TCGA數(shù)據(jù)庫的DUSP12與HCC患者臨床病理特征的相關(guān)性分析

圖3 DUSP基因家族的mRNA表達(dá)與HCC患者OS的關(guān)系

2.3DUSP12在HCC發(fā)生發(fā)展中的功能富集分析:從TCGA數(shù)據(jù)庫中獲取的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)一步通過GSEA軟件進(jìn)行針對DUSP12的基因功能富集分析(KEGG)，結(jié)果如下圖4所示，共篩選得到5條顯著上調(diào)的通路：包括嘌呤代謝、SNARE相關(guān)囊泡運(yùn)動(dòng)、剪接體、細(xì)胞周期、卵母細(xì)胞減數(shù)分裂，及5條顯著下調(diào)的通路：包括初級膽汁酸合成、視黃醇代謝、CYP450代謝、補(bǔ)體與凝血級聯(lián)反應(yīng)、纈氨酸/亮氨酸/異亮氨酸降解。

圖4 DUSP12在HCC發(fā)生發(fā)展中的功能富集分析

2.4DUSP12 mRNA與HCC患者的腫瘤組織免疫細(xì)胞浸潤程度及免疫檢查點(diǎn)相關(guān)分子mRNA表達(dá)的相關(guān)性:在線工具網(wǎng)站TIMER分析結(jié)果如表3所示，通過純度矯正后，DUSP mRNA表達(dá)量與腫瘤組織內(nèi)B細(xì)胞(r= 0.422)、CD8+T細(xì)胞(r= 0.285)、CD4+T細(xì)胞(r= 0.359)、巨噬細(xì)胞(r= 0.396)、中性粒細(xì)胞(r= 0.337)、樹突狀細(xì)胞(r= 0.406)的浸潤程度正相關(guān)，并且DUSP mRNA表達(dá)量也與免疫檢查點(diǎn)分子：CTLA4、HAVCR2、LAG3、CD274、CD276、TIGIT、C10ORF54的表達(dá)升高有關(guān)。

表3 基于TIMER的DUSP12與HCC患者腫瘤組織免疫細(xì)胞浸潤程度及免疫檢查點(diǎn)相關(guān)分子mRNA表達(dá)的相關(guān)性

2.5DUSP12蛋白在HCC患者中的差異化表達(dá)及其與臨床特征的相關(guān)性:本院入組19例HCC患者，一般臨床病理資料如表4所示。分析結(jié)果如圖5所示，DUSP12蛋白在HCC癌組織中明顯高表達(dá)(P<0.001)，并且與病理分級1與2級的患者相比，分級為3與4級的患者癌組織中DUSP12蛋白表達(dá)更高；與臨床分期1期的患者相比，分期為2-4期的癌組織DUSP12蛋白表達(dá)更高(圖5A-B)。

表4 驗(yàn)證隊(duì)列中HCC患者的一般臨床病理資料

圖5 DUSP12蛋白在HCC癌與癌旁組織的差異化表達(dá)

3 討 論

本研究通過結(jié)合公共數(shù)據(jù)挖掘與臨床病理驗(yàn)證的方法明確了DUSP基因家族中的DUSP12在mRNA與蛋白水平上高表達(dá)于HCC癌組織。高表達(dá)DUSP12的HCC患者總生存率下降，并且DUSP12 mRNA表達(dá)水平與患者的病理學(xué)分級呈正相關(guān)關(guān)系?；蚬δ芨患治鲲@示DUSP12參與HCC的發(fā)生發(fā)展過程的機(jī)制可能涉及嘌呤代謝、囊泡運(yùn)動(dòng)、剪接體、細(xì)胞周期信號調(diào)控通路的上調(diào)，及膽汁酸、視黃醇代謝、纈氨酸/亮氨酸/異亮氨酸降解信號調(diào)控通路的下調(diào)。在腫瘤免疫微環(huán)境中，DUSP12 mRNA表達(dá)水平與腫瘤內(nèi)B細(xì)胞、T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞的浸潤程度及免疫檢查點(diǎn)相關(guān)分子：CTLA4、HAVCR2、LAG3、CD274、CD276、TIGIT、C10ORF54的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系。

此前有研究通過轉(zhuǎn)錄組分析慢性粒細(xì)胞白血病患者的差異化表達(dá)基因，結(jié)果顯示DUSP12 mRNA高表達(dá)于腫瘤細(xì)胞 ，但該基因在HCC中的表達(dá)趨勢目前并不清楚[8]。在本項(xiàng)研究中，我們在DUSP基因家族中僅發(fā)現(xiàn)DUSP12 mRNA在HCC癌組織中高表達(dá)并與患者總生存率下降有關(guān)，這提示DUSP12的基因表達(dá)可能在HCC的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。DUSP基因家族是哺乳動(dòng)物中調(diào)節(jié)MARKs活性最重要的磷酸酶類，通過去磷酸化MARKs激酶激活環(huán)內(nèi)蘇氨酸和/或酪氨酸殘基的T-X-Y基序以調(diào)節(jié)MARKs的功能。通過調(diào)節(jié)MARKs的功能，DUSPs廣泛參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，包括誘導(dǎo)DNA的甲基化及抑癌基因蛋白的泛素化，促進(jìn)抑癌基因的失活及原癌基因的激活。DUSP12屬于DUSPs家族的一員，研究顯示DUSP12具有調(diào)控細(xì)胞周期從G0/G1期向G2/M期的轉(zhuǎn)化，及抑制肝細(xì)胞凋亡的作用[9]。本研究中GSEA預(yù)測的DUSP12在HCC進(jìn)展中的功能也與上述文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致：DUSP12可能通過調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)分子的表達(dá)從而參與HCC的進(jìn)展。

MAPKs包括c-Jun-NH2末端激酶(JNK)、p38 MAPK和細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)。這些酶屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在體內(nèi)廣泛參與調(diào)節(jié)各種細(xì)胞活動(dòng)，包括增殖、分化、凋亡、存活、炎癥和免疫[10]。已有大量研究顯示DUSPs通過調(diào)節(jié)MAPKs的功能參與調(diào)控先天性及適應(yīng)性免疫應(yīng)答：如DUSP1已被發(fā)現(xiàn)是先天性免疫的主要調(diào)節(jié)因子，并參與適應(yīng)性免疫中T細(xì)胞的激活；DUSP2和DUSP5參與炎癥反應(yīng)的活化，并被發(fā)現(xiàn)其是正常T細(xì)胞發(fā)育和功能所必需的調(diào)節(jié)因子[11]。基于DUSPs對于免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用，我們也進(jìn)一步推測DUSPs可能在HCC的免疫微環(huán)境形成中發(fā)揮作用。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)肝癌組織中高表達(dá)的DUSP12與浸潤的B細(xì)胞、T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞的浸潤程度正相關(guān)，并與免疫檢查點(diǎn)相關(guān)分子的表達(dá)也呈正相關(guān)關(guān)系。這提示在HCC的發(fā)生發(fā)展中，DUSP12可能通過促進(jìn)免疫細(xì)胞的浸潤及誘導(dǎo)免疫細(xì)胞高表達(dá)免疫檢查點(diǎn)分子介導(dǎo)腫瘤免疫抑制微環(huán)境的形成。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)：在DUSP基因家族中，DUSP12顯著高表達(dá)于HCC患者的癌組織，并與HCC患者的生存率下降、病理分級增加、免疫抑制微環(huán)境的產(chǎn)生有關(guān)。通過闡述DUSP12與HCC患者的臨床關(guān)系，將為下一步進(jìn)行DUSP12在HCC進(jìn)展中的功能實(shí)驗(yàn)提供理論基礎(chǔ)，并為未來HCC的治療提供更多的靶點(diǎn)選擇。