魏家寶 林俊卿 鄭憲友

脊髓損傷會(huì)導(dǎo)致患者損傷平面以下的運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)功能障礙，并伴有排尿和排便障礙、呼吸困難、腸道菌群紊亂等并發(fā)癥[1-4]。我國(guó)每年新增約60 000例脊髓損傷患者[5-6]，而針對(duì)脊髓損傷的治療方法效果不佳，亟需探索新的治療模式。

基因編輯是一種有潛力的新模式。細(xì)菌中成簇存在具有規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列（CRISPR）[7]，它們是原核生物抵抗病毒入侵的有效手段。Cas基因編碼的Cas蛋白可與CRISPR序列區(qū)域發(fā)生作用，通 過(guò)CRISPRa、CRISPRi、CRISPRoff等 工 具[8-9]與遺傳修飾調(diào)控因子組合，借助向?qū)NA實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因的調(diào)控。該類技術(shù)具有特異、靈敏、快速、便捷等特點(diǎn)，可廣泛應(yīng)用于基因治療、分子檢測(cè)等領(lǐng)域。近年來(lái)，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas技術(shù)可以調(diào)控脊髓損傷的相關(guān)基因表達(dá)，使其可以作為一種治療方法用于脊髓損傷修復(fù)。同時(shí)諸多研究利用CRISPR/Cas技術(shù)發(fā)現(xiàn)了更多與脊髓損傷相關(guān)的基因，為脊髓損傷修復(fù)帶來(lái)新的突破口。本文回顧相關(guān)文獻(xiàn)，對(duì)CRISPR/Cas技術(shù)調(diào)控脊髓損傷相關(guān)基因促進(jìn)脊髓損傷修復(fù)及作為分子檢測(cè)工具探索脊髓損傷相關(guān)未知基因的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 脊髓損傷與相關(guān)基因表達(dá)水平的變化

CRISPR/Cas技術(shù)通過(guò)靶向上調(diào)或沉默特定基因，從而改變某些細(xì)胞因子、蛋白酶的表達(dá)。在研究某一疾病時(shí)，可以利用CRISPR/Cas技術(shù)針對(duì)其誘發(fā)、進(jìn)展及預(yù)后過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的基因進(jìn)行靶向調(diào)控，從而實(shí)現(xiàn)治療疾病的目的。脊髓損傷的病理生理過(guò)程極其復(fù)雜，損傷發(fā)生后可引起相關(guān)基因表達(dá)水平變化，而這些變化的關(guān)鍵基因被認(rèn)為是治療脊髓損傷的潛在靶點(diǎn)。

脊髓損傷涉及損傷部位組織細(xì)胞凋亡、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、膠質(zhì)瘢痕形成、神經(jīng)血管再生等多個(gè)環(huán)節(jié)，各基因在這一過(guò)程中發(fā)揮各自的作用。在細(xì)胞凋亡方面，脊髓損傷后，與細(xì)胞凋亡相關(guān)的Bax、Fas基因的表達(dá)會(huì)上調(diào)，通過(guò)促進(jìn)線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C釋放，破壞DNA，形成死亡信號(hào)復(fù)合體，降解染色體，從而促使細(xì)胞凋亡[10]。而B(niǎo)cl-2基因的表達(dá)上調(diào)可阻止細(xì)胞色素C釋放，抑制凋亡[11]。在炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)方面，脊髓損傷后，與炎癥反應(yīng)相關(guān)的單核細(xì)胞趨化蛋白（MCP）-1[12]、巨噬細(xì)胞炎癥蛋白（MIP）-1α[13]基因的表達(dá)迅速上調(diào)，激活巨噬細(xì)胞釋放腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細(xì)胞介素（IL）-1、IL-6等因子，使炎癥細(xì)胞在損傷區(qū)域聚集，參與繼發(fā)性脊髓損傷的調(diào)控。在膠質(zhì)瘢痕形成方面，脊髓損傷后，與膠質(zhì)瘢痕相關(guān)的膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白（GFAP）基因表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化增生，封閉損傷區(qū)域形成膠質(zhì)瘢痕，在損傷前期可保護(hù)脊髓組織形態(tài)，在損傷后期則會(huì)抑制軸突生長(zhǎng)[14]。在神經(jīng)血管再生方面，脊髓損傷后，再生基因蛋白（Reg）-2基因的表達(dá)迅速上調(diào)，促進(jìn)施萬(wàn)細(xì)胞分裂和軸突生長(zhǎng)，同時(shí)也能促進(jìn)產(chǎn)生多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞存活[15]。同時(shí)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)基因的表達(dá)增加，促進(jìn)血管再生，為脊髓損傷的修復(fù)提供良好的微環(huán)境[16]。這些在脊髓損傷各環(huán)節(jié)中表達(dá)的基因可以作為CRISPR/Cas技術(shù)編輯的象，通過(guò)調(diào)節(jié)其表達(dá)來(lái)促進(jìn)脊髓損傷的恢復(fù)。

2 CRISPR/Cas技術(shù)應(yīng)用于脊髓損傷治療的探索

2.1 調(diào)控脊髓損傷相關(guān)細(xì)胞因子

神經(jīng)組織在其生長(zhǎng)分化過(guò)程中受到多種細(xì)胞因子的調(diào)控，包括膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（GDNF）、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（CTGF）等。這些細(xì)胞因子在脊髓神經(jīng)生長(zhǎng)分化的各階段都起到不可忽視的調(diào)控作用，利用CRISPR/Cas技術(shù)調(diào)節(jié)這些細(xì)胞因子的表達(dá)有助于促進(jìn)脊髓損傷的修復(fù)。

GDNF參與腦中多巴胺神經(jīng)元的生長(zhǎng)和維持，對(duì)損傷神經(jīng)元進(jìn)行保護(hù)，同時(shí)促進(jìn)損傷后神經(jīng)元的再生[17]。Khazaei等[18]利用CRISPR/Cas技術(shù)敲除DLK1基因后發(fā)現(xiàn)，GDNF能夠通過(guò)介導(dǎo)DLK1基因來(lái)調(diào)節(jié)Notch信號(hào)的表達(dá)，以促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞分化、突觸重建，從而達(dá)到促進(jìn)脊髓損傷小鼠運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的作用。這表明，利用CRISPR/Cas技術(shù)增強(qiáng)GDNF表達(dá)能夠促進(jìn)脊髓損傷的恢復(fù)。

NGF是一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白，其可激活傷害性神經(jīng)元，將疼痛信號(hào)從周圍傳遞至中樞神經(jīng)系統(tǒng)，并通過(guò)酪氨酸激酶受體發(fā)出信號(hào)，從而對(duì)神經(jīng)元產(chǎn)生作用[19]。目前，鼠源NGF（mNGF）已用于治療各種神經(jīng)元和非神經(jīng)元疾病。Gu等[20]利用CRISPR/Cas技術(shù)將NGF基因插入小鼠下頜下腺細(xì)胞，在小鼠下頜下腺中特異性表達(dá)人源NGF（hNGF），發(fā)現(xiàn)hNGF在人體細(xì)胞中的生物學(xué)活性明顯高于mNGF，其促進(jìn)脊髓損傷修復(fù)的效果優(yōu)于mNGF，損傷部位軸突再生水平更高。這表明，可以利用CRISPR/Cas技術(shù)通過(guò)上調(diào)NGF表達(dá)來(lái)達(dá)到治療脊髓損傷的目的。

BDNF通過(guò)與酪氨酸激酶B結(jié)合，激活Ras-絲裂原激活蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路，增加BDNF基因及BCL-2基因的表達(dá)，其可以促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)發(fā)育[21]。Hsu等[22]利用CRISPR/Cas技術(shù)將BDNF基因插入大鼠脂肪干細(xì)胞后，將修飾后的脂肪干細(xì)胞植入脊髓損傷部位，發(fā)現(xiàn)其能夠促進(jìn)施萬(wàn)細(xì)胞遷移，同時(shí)促進(jìn)神經(jīng)元增殖和神經(jīng)軸突生長(zhǎng)。由此可見(jiàn)，利用CRISPR/Cas技術(shù)增強(qiáng)脊髓損傷部位BDNF表達(dá)能夠達(dá)到促進(jìn)脊髓損傷恢復(fù)的目的。

CTGF上調(diào)能夠促進(jìn)受損的神經(jīng)細(xì)胞間形成膠質(zhì)橋接，在細(xì)胞分化、組織遷移、腫瘤進(jìn)展等方面具有重要意義[23]。Klatt等[24]研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)CRISPR/Cas技術(shù)增強(qiáng)CTGF表達(dá)后，斑馬魚(yú)脊髓損傷修復(fù)速度增快，游泳時(shí)間延長(zhǎng)。這提示通過(guò)CRISPR/Cas技術(shù)增強(qiáng)CTGF表達(dá)有助于促進(jìn)脊髓損傷的修復(fù)。

總而言之，在脊髓損傷的進(jìn)展和恢復(fù)過(guò)程中，各環(huán)節(jié)都受到諸多細(xì)胞因子的調(diào)控，通過(guò)CRISPR/Cas技術(shù)來(lái)調(diào)節(jié)這些細(xì)胞因子的表達(dá)，能夠促進(jìn)脊髓損傷的恢復(fù)。

2.2 調(diào)控蛋白酶

脊髓損傷后，受損的局部組織會(huì)出現(xiàn)氧化應(yīng)激障礙、膠質(zhì)瘢痕形成、血管再生等多種病理生理過(guò)程，其間許多蛋白酶也發(fā)揮著不可忽視的作用，如磷酸酶及張力蛋白同源物（PTEN）、吡哆醛激酶（PDXK）、髓磷脂堿性蛋白（MBP）、C3補(bǔ)體等，利用CRISPR/Cas技術(shù)調(diào)節(jié)這些蛋白酶的表達(dá)有助于進(jìn)一步探明脊髓損傷后各環(huán)節(jié)的進(jìn)展過(guò)程。

PTEN蛋白具有磷酸酯酶的活性，可使磷脂酰肌醇三磷酸去磷酸化，從而抑制磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶（AKT）信號(hào)通路，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。Moses等[25]研究發(fā)現(xiàn)，先天性PTEN基因遺傳缺失可導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)軸突再生。該實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，使用CRISPR/Cas技術(shù)沉默神經(jīng)細(xì)胞中的PTNE基因，可起到促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞軸突再生的作用，提示CRISPR/Cas技術(shù)可通過(guò)調(diào)控PTEN基因表達(dá)來(lái)促進(jìn)脊髓損傷修復(fù)。

PDXK是維生素B6的重要組成部分[26]，能夠抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，減少血管內(nèi)皮損傷，維持多種細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育。Xiong等[27]通過(guò)使用CRISPR/Cas技術(shù)敲除PDXK的靶標(biāo)miRNA-339，結(jié)果脊髓橫斷面遠(yuǎn)端皮質(zhì)中神經(jīng)軸突生長(zhǎng)顯著增加，且皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡減少。這提示，除了直接編輯脊髓損傷相關(guān)DNA外，通過(guò)CRISPR/Cas技術(shù)敲除靶標(biāo)RNA也是促進(jìn)脊髓損傷恢復(fù)的一種方法。

MBP是一種髓鞘相關(guān)蛋白，具有絲氨酸蛋白酶活性。MBP通過(guò)切割細(xì)胞外蛋白L1細(xì)胞黏附分子，增強(qiáng)成年哺乳動(dòng)物神經(jīng)元生長(zhǎng)。MBP對(duì)神經(jīng)祖細(xì)胞軸突生長(zhǎng)的刺激作用是通過(guò)抑制過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR）γ基因的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。一些學(xué)者使用CRISPR/Cas技術(shù)敲除MBP基因，發(fā)現(xiàn)MBP通過(guò)MBP/L1cam/PPARγ信號(hào)通路促進(jìn)軸突再生，這也進(jìn)一步提示CRISPR/Cas技術(shù)可通過(guò)增加MBP基因表達(dá)來(lái)促進(jìn)脊髓損傷的恢復(fù)[28-29]。

C3是血清中含量最高的補(bǔ)體成分，主要由巨噬細(xì)胞和肝臟合成，具有酶活性，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。Guo等[30]研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)CRISPR/as技術(shù)敲除C3相關(guān)基因能夠激活星形膠質(zhì)細(xì)胞，上調(diào)TNF-α的表達(dá)，使C3缺陷小鼠的神經(jīng)纖維再生得到改善。這表明，補(bǔ)體抑制也可能是促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)再生的潛在靶向療法。

脊髓損傷進(jìn)展和恢復(fù)過(guò)程中有諸多蛋白酶發(fā)揮著不可或缺的作用，通過(guò)CRISPR/Cas技術(shù)編輯基因來(lái)調(diào)節(jié)這些蛋白酶的水平，有望成為治療脊髓損傷的有效方法。

3 基于CRISPR/Cas技術(shù)的分子檢測(cè)在脊髓損傷領(lǐng)域的探索

隨著脊髓損傷相關(guān)研究不斷深入，研究人員需要篩查參與脊髓損傷病理生理學(xué)改變的大量未知基因，分子檢測(cè)工具是一種可用方法。常規(guī)分子檢測(cè)工具主要包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、分子雜交技術(shù)以及基因芯片技術(shù)，這些技術(shù)操作復(fù)雜、花費(fèi)昂貴，因此需要開(kāi)發(fā)一種更快捷、更廉價(jià)、更靈敏的檢測(cè)技術(shù)。

CRISPR/Cas技術(shù)具有精準(zhǔn)識(shí)別和切割核酸片段的能力，使其可用于分子檢測(cè)。CRISPR/Cas檢測(cè)平臺(tái)靈敏度高、速度快、無(wú)需大型設(shè)備，相較于傳統(tǒng)分子檢測(cè)方式有明顯優(yōu)勢(shì)。除了Cas9，Cas家族還有許多具有切割活性的蛋白。Cas13a能在CRISPR RNA（crRNA）引導(dǎo)下切割靶標(biāo)RNA，之后仍能保持活性，進(jìn)而切割其他RNA[31]；Cas12a也具有類似性質(zhì)，其能夠切割特異的靶標(biāo)單鏈DNA[32]。此外，有學(xué)者開(kāi)發(fā)出基于Cas14a的檢測(cè)平臺(tái)，相較于Cas12a，其與靶標(biāo)結(jié)合的特異性更強(qiáng)，可用于需要單堿基分辨的檢測(cè)[33]。

基于這些檢測(cè)平臺(tái)， CRISPR/Cas技術(shù)可用于脊髓損傷等多個(gè)領(lǐng)域的分子診斷和篩查。Klatt Shaw等[34]以CRISPR雙鏈引導(dǎo)核糖核蛋白（dgRNP）誘變斑馬魚(yú)基因，通過(guò)28個(gè)dgRNP篩選出17個(gè)靶向基因，這些基因的誘變體在脊髓損傷后未能恢復(fù)游泳功能。此外，Keatinge等[35]使用CRISPR/Cas技術(shù)將合成CRISPR RNA（sCrRNA）注射入脊髓損傷部位，通過(guò)約350種sCrRNA靶向30個(gè)潛在的巨噬細(xì)胞相關(guān)基因后，篩查出4個(gè)影響軸突再生的基因（tgfb1a、tgfb3、tnfa、sparc），這4種突變體的軸突再生受到明顯抑制。這提示，可通過(guò)CRISPR/Cas技術(shù)增強(qiáng)這4種基因的表達(dá)來(lái)促進(jìn)脊髓損傷的修復(fù)。Sox2是Sox轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，通過(guò)高遷移率族蛋白介導(dǎo)，在早期胚胎發(fā)育階段對(duì)干細(xì)胞干性維持和神經(jīng)組織細(xì)胞增殖有重要作用，在生長(zhǎng)發(fā)育后期其表達(dá)則會(huì)受到限制[36]。Tazaki等[37]通過(guò)研究蠑螈篩查得到脊髓生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵基因Sox2，蠑螈是唯一能在功能上再生肢體和脊髓所有細(xì)胞類型的四足動(dòng)物，通過(guò)CRISPR/Cas介導(dǎo)的基因編輯，敲除蠑螈細(xì)胞中Sox2基因，蠑螈的脊髓生長(zhǎng)發(fā)育出現(xiàn)異常，且再生功能消失。這表明可以通過(guò)CRISPR/Cas技術(shù)增強(qiáng)Sox2基因的表達(dá)來(lái)促進(jìn)脊髓損傷的修復(fù)。

隨著基于CRISPR/Cas的分子檢測(cè)技術(shù)不斷進(jìn)步，研究人員能夠更便捷、更高效地發(fā)現(xiàn)脊髓損傷某一病理過(guò)程中發(fā)揮作用的關(guān)鍵基因，進(jìn)而開(kāi)發(fā)新治療方案來(lái)促進(jìn)脊髓損傷的恢復(fù)。通過(guò)CRISPR/Cas技術(shù)進(jìn)行分子檢測(cè)能大大加快脊髓損傷領(lǐng)域的科研進(jìn)展。

4 結(jié)語(yǔ)

脊髓損傷具有高發(fā)病率、高致殘率、高耗費(fèi)及低齡化的特點(diǎn)，并產(chǎn)生很多并發(fā)癥，目前臨床上僅能采用常規(guī)的藥物治療和針對(duì)并發(fā)癥的輔助治療。CRISPR/Cas技術(shù)給治療脊髓損傷帶來(lái)新希望。通過(guò)CRISPR/Cas技術(shù)對(duì)在脊髓損傷過(guò)程中發(fā)揮重要作用的細(xì)胞因子、蛋白酶的相關(guān)基因進(jìn)行編輯，達(dá)到了促進(jìn)脊髓損傷恢復(fù)的效果。雖然在使用中也面臨著脫靶和遺傳毒性[38]的問(wèn)題，但是隨著Cas9TX[39]、SuperFi-Cas9[40]等更先進(jìn)的蛋白酶被開(kāi)發(fā)，脫靶率顯著降低，CRISPR/Cas技術(shù)的安全性也大大提高。同時(shí)，基于CRISPR/Cas的分子檢測(cè)技術(shù)不斷發(fā)展，能不斷發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)，加速脊髓損傷領(lǐng)域的研究進(jìn)展。