楊歡利， 陳輝波， 李真法， 陸文昊， 蔡嬌嬌

（浙江省臺(tái)州醫(yī)院生殖中心，浙江 臺(tái)州 317000）

Y染色體微缺失（azoospermia factor，AZF）是導(dǎo)致男性不育的第2位遺傳因素，AZF包含a、b、c區(qū)，其中AZFb區(qū)缺失率為1%～5%[1]。AZFb區(qū)相關(guān)基因參與精子減數(shù)分裂，其缺失常導(dǎo)致精子發(fā)生阻滯，無(wú)法獲得成熟精子。但國(guó)內(nèi)外幾項(xiàng)研究[2-5]在AZFb區(qū)部分缺失和完全缺失患者中獲得了精子，其中部分患者通過(guò)胞質(zhì)內(nèi)單精子注射獲得了生育機(jī)會(huì)，這給AZFb區(qū)缺失患者帶來(lái)了希望。本研究報(bào)道2例AZFb區(qū)缺失患者的臨床特征和生殖遺傳檢測(cè)結(jié)果，為臨床診治相關(guān)疾病提供參考。

1 病例資料

患者1，23歲，因婚后2年不育就診，自述性生活正常；體格檢查示男性第二性征明顯，外生殖器發(fā)育正常，雙側(cè)睪丸大小正常，血清卵泡刺激素5.5 mIU/mL（參考區(qū)間1.3～19.3 mIU/ml），睪酮2.10 ng/mL（參考區(qū)間1.75～7.81 ng/mL）。

患者2，31歲，因婚后4年不育就診，自述性生活正常；體格檢查示男性第二性征明顯，外生殖器及雙側(cè)睪丸B超檢查正常，血清卵泡刺激素6.7 mIU/mL，睪酮4.96 ng/mL。

2 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果

2.1 生育能力檢測(cè)結(jié)果

留取患者禁欲2～7 d后手淫法采集的精液，液化后采用北京偉力新世紀(jì)科技發(fā)展有限公司W(wǎng)LJY-9000精子分析儀進(jìn)行精液分析。收集患者排精后第1次尿液，3 000×g離心15 min，取沉淀于顯微鏡下排除逆向射精。2例患者精液和射精后第1次尿液各檢測(cè)3次，均未檢測(cè)到精子，判定為無(wú)精子癥。

2.2 附屬性腺功能檢測(cè)結(jié)果

將液化后的精液3 000×g離心15 min，分離結(jié)果示患者1中性α-葡萄糖苷酶略低于參考區(qū)間。見(jiàn)表1。

表1 2例患者精液和附屬性腺生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

2.3 遺傳學(xué)檢測(cè)結(jié)果

采用G顯帶方法進(jìn)行細(xì)胞染色體核型分析，每份樣本至少分析20個(gè)分裂相；采用基本分析加拓展分析方法進(jìn)行Y染色體微缺失檢測(cè)，基本分析位點(diǎn)為AZFa區(qū)（SY84、SY86）、AZFb區(qū)（SY127，SY134）、AZFc區(qū)（SY254、SY255）。拓展分析位點(diǎn)為AZFa區(qū)（SY152、SY1064、SY1065、SY88）、AZFb區(qū)（SY105、SY121、SY1192、SY153）、AZFc區(qū)（SY160）。如基本分析中某個(gè)區(qū)域只有1個(gè)位點(diǎn)缺失，則再次進(jìn)行單管聚合酶鏈反應(yīng)驗(yàn)證，若仍為單個(gè)位點(diǎn)缺失，則判定此區(qū)域部分位點(diǎn)缺失；如基本分析中某個(gè)區(qū)域有2個(gè)位點(diǎn)同時(shí)缺失，則進(jìn)行拓展分析，參考文獻(xiàn)[1]進(jìn)行操作。

2例患者外周血細(xì)胞染色體核型均為46，XY。Y染色體微缺失檢測(cè)基本分析發(fā)現(xiàn)2例患者AZFb區(qū)2個(gè)基本位點(diǎn)SY127、SY134缺失，拓展分析發(fā)現(xiàn)患者1 SY105存在，SY121缺失，SY1192缺失，SY153存在；患者2 SY105存在，SY121缺失，SY1192存在，SY153存在。推斷患者1 AZFb缺失類(lèi)型為回文序列P5與近端P1之間同源重組導(dǎo)致P5/近端P1缺失，即為AZFb區(qū)完全缺失，患者2為AZFb區(qū)部分缺失。2例患者Y染色體微缺失位點(diǎn)及分析結(jié)果見(jiàn)表2；Y染色體微缺失電泳圖見(jiàn)圖1。

表2 2例患者Y染色體微缺失分析結(jié)果

圖1 Y染色體AZFb區(qū)缺失電泳圖

2.4 睪丸活檢結(jié)果

對(duì)2例患者行睪丸切開(kāi)活檢。將手術(shù)獲取的睪丸生精小管組織置于含精子洗滌液的35 mm培養(yǎng)皿中，用眼科鑷和彎曲針頭的1 mL注射器對(duì)生精小管進(jìn)行擠壓和撕碎以分離內(nèi)含物。處理完所有生精小管后，制備細(xì)胞懸液，置于霍夫曼系統(tǒng)倒置顯微鏡下觀察，以判斷睪丸生精功能和狀態(tài)?；颊?外院活檢結(jié)果為睪丸中未發(fā)現(xiàn)精子，采用供精進(jìn)行輔助生育?；颊?本院活檢未發(fā)現(xiàn)精子，僅在活檢生精小管中發(fā)現(xiàn)支持細(xì)胞及少量生精細(xì)胞。見(jiàn)圖2。

圖2 睪丸活檢組織研磨后霍夫曼系統(tǒng)觀察圖片

3 討論

Y染色體微缺失3個(gè)區(qū)域中AZFb區(qū)位于Yq11中心區(qū)域，跨距3.2 Mb，并有1.5 Mb與AZFc區(qū)重疊。AZFb區(qū)包含回文序列P2～P5和P1近端部分，AZFb區(qū)完全缺失類(lèi)型對(duì)應(yīng)回文序列P5/近端P1，是由末端同源片段之間重組導(dǎo)致的[2]。AZFb區(qū)基因支持精子發(fā)生和成熟，是生精細(xì)胞通過(guò)減數(shù)分裂進(jìn)入精子形成過(guò)程的關(guān)鍵，因此AZFb區(qū)缺失患者精子發(fā)生常停滯于精母細(xì)胞期，大多數(shù)生精小管中沒(méi)有減數(shù)分裂后的生殖細(xì)胞[3]。本研究2例患者中有1例AZFb區(qū)缺失類(lèi)型為P5/近端P1缺失，屬于AZFb區(qū)完全缺失；另1例為AZFb區(qū)部分缺失；2例患者睪丸活檢均未發(fā)現(xiàn)精子，只有支持細(xì)胞和少量生精細(xì)胞。

有研究發(fā)現(xiàn)，在AZFb區(qū)部分缺失患者中有50%可獲得精子，而在AZFb區(qū)完全缺失患者中發(fā)現(xiàn)成熟精子的概率幾乎為零[4]。STOUFFS等[5]對(duì)目前報(bào)道的可生成精子的AZFb缺失的1個(gè)家系和5個(gè)個(gè)體文獻(xiàn)進(jìn)行了總結(jié)，發(fā)現(xiàn)這些患者中只有3個(gè)使用了推薦的引物位點(diǎn)（SY127、SY134），并將這2個(gè)位點(diǎn)發(fā)生的缺失歸類(lèi)為完全缺失，1個(gè)發(fā)生了AZFb+c區(qū)聯(lián)合缺失，另外1個(gè)為AZFb區(qū)部分缺失。而歐洲男科協(xié)會(huì)推薦AZFb區(qū)在基本位點(diǎn)SY127和SY134缺失的基礎(chǔ)上進(jìn)一步行拓展分析，才能判斷AZFb區(qū)是否完全缺失。因此，可能由于選用引物類(lèi)型不同導(dǎo)致對(duì)AZFb區(qū)缺失判斷不同，相同基因型在不同研究中可能出現(xiàn)不同表型；他們認(rèn)為通過(guò)拓展分析可檢出僅使用SY127、SY134位點(diǎn)基本分析時(shí)所漏掉的異常類(lèi)型。本研究依據(jù)歐洲男科協(xié)會(huì)推薦的方法，進(jìn)行SY127和SY134位點(diǎn)的基本分析，發(fā)現(xiàn)2個(gè)位點(diǎn)缺失，隨后進(jìn)行SY105、SY121、SY1192、SY153共4個(gè)位點(diǎn)的拓展分析，最終確定1例患者為AZFb區(qū)完全缺失，另1例為AZFb區(qū)部分缺失。STOUFFS等[5]認(rèn)為SY1192可作為一個(gè)決策標(biāo)記，如SY1192仍存在，則可考慮睪丸切開(kāi)取精。因此，在AZFb區(qū)拓展分析是否存在SY1192位點(diǎn)對(duì)指導(dǎo)生育治療有重要意義。

有研究在AZFb區(qū)部分缺失男性中獲得了成熟精子細(xì)胞，并使這些男性獲得了生育機(jī)會(huì)[4]。有研究使用AZFb區(qū)缺失患者射出的精子通過(guò)胞質(zhì)內(nèi)單精子注射生育1個(gè)孩子[6]。但更多研究發(fā)現(xiàn)，在AZFb區(qū)缺失的情況下，從射精或通過(guò)睪丸獲得成熟精子細(xì)胞的機(jī)會(huì)較小；盡管可從含AZFb區(qū)缺失男性睪丸中獲得精子，但這些差異反映了不同患者缺失程度的異質(zhì)性[7]。AZFb區(qū)缺失片段大小與睪丸生精功能有明顯相關(guān)性，在AZFb/b+c區(qū)部分缺失的標(biāo)本中經(jīng)常會(huì)觀察到生精功能低下的組織類(lèi)型，而在AZFb和AZFb+c區(qū)完全缺失的標(biāo)本中觀察到生精細(xì)胞嚴(yán)重阻滯和唯支持細(xì)胞綜合征，從射精或睪丸組織中提取成熟精子的機(jī)會(huì)為零[3]。本研究2例患者中，1例屬于AZFb區(qū)完全缺失，另1例為AZFb區(qū)部分缺失，睪丸活檢均未發(fā)現(xiàn)精子，患者2只有支持細(xì)胞和少量生精細(xì)胞，存在生精細(xì)胞為精原細(xì)胞的注射提供了可能。因此，無(wú)精子癥患者以睪丸切開(kāi)取精或胞質(zhì)內(nèi)單精子注射作為候選治療方法時(shí)，在治療前應(yīng)進(jìn)行AZF篩查，AZFa區(qū)、AZFb區(qū)完全缺失時(shí)不推薦睪丸活檢，但在AZFb區(qū)部分缺失時(shí)可嘗試進(jìn)行睪丸切開(kāi)取精，同時(shí)應(yīng)告知患者獲得精子的概率非常低。因此，AZF缺失對(duì)無(wú)精子癥患者預(yù)后判斷有積極意義，并會(huì)影響治療效果。

綜上所述，非阻塞性無(wú)精子癥患者治療前應(yīng)進(jìn)行AZF篩查，并進(jìn)行拓展分析判斷AZFb區(qū)缺失類(lèi)型，對(duì)AZFb區(qū)部分缺失患者可進(jìn)行睪丸切開(kāi)取精，但對(duì)AZFb區(qū)完全缺失患者不推薦采用此種取精方法。