劉峰 余鈞劍 顧楠

(上海市水產(chǎn)研究所，上海市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，上海 200433)

羅非魚(yú)(tilapia)是原產(chǎn)非洲、中東的部分麗魚(yú)科魚(yú)類的通稱，是世界重要的養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚(yú)類，2018年全球羅非魚(yú)養(yǎng)殖總產(chǎn)量達(dá)到603萬(wàn)t[1]。羅非魚(yú)是廣鹽性魚(yú)類，但耐鹽性狀的種間差異較大。其中，尼羅羅非魚(yú)為主養(yǎng)種，其生長(zhǎng)速度快，但耐鹽性能較差[2-3]，只能在淡水或低鹽度水體中養(yǎng)殖[4]。莫桑比克羅非魚(yú)的耐鹽性較好[5]，可耐受120的鹽度[6]，在49鹽度下可正常繁殖[7]，并能適應(yīng)淡水、半咸水、海水、高鹽水體等各種滲透壓環(huán)境[4]。由于淡水資源日趨緊張，且咸水中養(yǎng)殖的羅非魚(yú)品質(zhì)優(yōu)于淡水羅非魚(yú)，售價(jià)更高，因此，采用莫桑比克羅非魚(yú)等高耐鹽品種與尼羅羅非魚(yú)、紅羅非魚(yú)等生長(zhǎng)速度快的品系進(jìn)行雜交，再?gòu)碾s交子代中進(jìn)行耐鹽羅非魚(yú)的選育，已成為羅非魚(yú)育種重要的研究方向。

數(shù)量性狀位點(diǎn)(quantitative trait locus，QTL)是控制數(shù)量性狀的基因或DNA片段所在的基因組區(qū)域。通過(guò)在參考群體中進(jìn)行基因型鑒定及QTL定位分析，可獲得重要性狀的QTL，解析性狀差異的成因，QTL區(qū)域內(nèi)與性狀相關(guān)的分子標(biāo)記可用于分子標(biāo)記輔助選育[8]。在QTL定位分析中，常用的分子標(biāo)記主要有微衛(wèi)星及單核苷酸多態(tài)性(SNP)標(biāo)記[9]。采用傳統(tǒng)選育方法進(jìn)行耐鹽羅非魚(yú)的選育，選育周期長(zhǎng)、成本高，耐鹽性狀相關(guān)位點(diǎn)難以純合。若能篩選得到與耐鹽性狀相關(guān)的分子標(biāo)記，再采用分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)進(jìn)行選育，可加速選育進(jìn)程，并有利于在維持較高遺傳多樣性的基礎(chǔ)上對(duì)耐鹽性狀進(jìn)行純化。本研究以耐鹽性好的莫桑比克羅非魚(yú)與生長(zhǎng)快的紅羅非魚(yú)雜交建立參考家系，進(jìn)行耐鹽QTL定位分析，所獲得的耐鹽相關(guān)QTL及耐鹽相關(guān)分子標(biāo)記將有利于耐鹽羅非魚(yú)分子標(biāo)記輔助育種。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)對(duì)象

以莫桑比克羅非魚(yú)為父本、紅羅非魚(yú)為母本，繁育獲得用于QTL定位分析的全同胞參考家系。從該家系中隨機(jī)選取300尾水花魚(yú)苗，放養(yǎng)于容量5 m3的循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中。養(yǎng)殖期間水溫25～28 ℃，每日投餌2次，采用淡水飼養(yǎng)至140日齡，存活的282尾個(gè)體均用于試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 耐鹽性狀測(cè)定和采樣

將所有試驗(yàn)魚(yú)從淡水循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)同時(shí)轉(zhuǎn)入容量5 m3的海水循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)。海水養(yǎng)殖系統(tǒng)中提前加注鹽度為33的海水，足量充氧。觀察各個(gè)體的狀態(tài)，直至試驗(yàn)魚(yú)死亡時(shí)將其撈出，記錄每尾魚(yú)的存活時(shí)間，作為耐鹽性狀表型值。根據(jù)生殖孔外觀及性腺形態(tài)鑒定各個(gè)體性別，剪取每一個(gè)體的部分尾鰭，保存于95%乙醇中用于DNA提取。

1.2.2 基因型測(cè)定與遺傳連鎖圖譜重建

采用Yue[10]的方法進(jìn)行DNA提取。

篩選均勻分布于22個(gè)連鎖群、在至少一方親本中具有多態(tài)性的158個(gè)已發(fā)表的耐鹽羅非魚(yú)遺傳連鎖圖譜分子標(biāo)記[11]及13個(gè)后續(xù)開(kāi)發(fā)的微衛(wèi)星分子標(biāo)記(見(jiàn)表1)，對(duì)282尾參考家系個(gè)體進(jìn)行第1輪基因型檢測(cè)。在前期的研究中，該參考家系的性別決定系統(tǒng)已被確認(rèn)為XY型[12]，所有雌性的基因型均為XX型，所有雄性的基因型均為XY型，“性別”也被作為1個(gè)分子標(biāo)記用于分析。首輪QTL定位分析后，為對(duì)第1連鎖群中鑒定得到的兩個(gè)QTL進(jìn)行精細(xì)定位，從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)下載羅非魚(yú)全基因組序列，采用SiRoKo軟件在第1連鎖群中進(jìn)行微衛(wèi)星序列搜索，開(kāi)發(fā)出19個(gè)微衛(wèi)星分子標(biāo)記(見(jiàn)表2)，再對(duì)各參考家系個(gè)體進(jìn)行第2輪基因型檢測(cè)。

表1 首輪QTL定位用分子標(biāo)記

表2 QTL精細(xì)定位用分子標(biāo)記

在進(jìn)行基因型檢測(cè)時(shí)，先采用熒光標(biāo)記引物對(duì)各個(gè)體DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再采用ABI 3730測(cè)序儀對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)定，內(nèi)參采用GeneScan-500 ROX，基因分型軟件采用GeneMaper 4.0。微衛(wèi)星分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)方法與已發(fā)表的文獻(xiàn)[11]相同。

為排除不同家系重組率差異的影響，QTL定位分析前，先在參考家系中進(jìn)行遺傳連鎖圖譜的重建。基于參考家系282個(gè)全同胞個(gè)體及親本的基因型，采用JoinMap 4.0軟件進(jìn)行遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建，采用Kosambi作圖，標(biāo)記分群閾值設(shè)置為L(zhǎng)OD 4.0。作圖時(shí)，先根據(jù)母本、父本的基因型分別構(gòu)建雌性、雄性圖譜，再對(duì)雌、雄圖譜進(jìn)行合并，構(gòu)建整合圖譜。遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建參照J(rèn)oinMap 4.0使用說(shuō)明進(jìn)行。

1.2.3 QTL定位分析

QTL定位分析采用MapQTL 5.0軟件進(jìn)行，相關(guān)方法參照軟件的使用說(shuō)明。先將基因型數(shù)據(jù)及重建的遺傳連鎖圖譜從JoinMap軟件中導(dǎo)出，再與表型數(shù)據(jù)一起導(dǎo)入MapQTL軟件，然后進(jìn)行后續(xù)分析。采用IM、MQM分析方法進(jìn)行QTL定位，采用P-test分析確定基因組的顯著水平閾值。首輪QTL分析完成后，在選定QTL所在連鎖群中開(kāi)發(fā)新的分子標(biāo)記進(jìn)行第2輪基因型檢測(cè)，基于兩輪基因型測(cè)定結(jié)果，對(duì)選定QTL進(jìn)行精細(xì)定位分析，方法與首輪分析相同。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。均值結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，均值比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，設(shè)顯著性水平為0.05。

平均存活時(shí)長(zhǎng)=個(gè)體存活時(shí)間總和/個(gè)體總數(shù)

(1)

2 結(jié)果

2.1 參考家系耐鹽性狀

將參考家系轉(zhuǎn)入鹽度為33的海水后，經(jīng)260 min出現(xiàn)第1尾死亡個(gè)體，之后死亡個(gè)體數(shù)逐漸增多，在410～434 min達(dá)到峰值。有小部分個(gè)體耐鹽能力較強(qiáng)，直至711 min，最后1尾個(gè)體死亡。所有個(gè)體的平均存活時(shí)長(zhǎng)為417.4 min。各個(gè)體在海水中的存活時(shí)長(zhǎng)分布如圖1。

圖1 各個(gè)體在海水中存活時(shí)長(zhǎng)分布(死亡個(gè)體數(shù)量)

2.2 基因型檢測(cè)與連鎖圖重建

采用171個(gè)標(biāo)記對(duì)282個(gè)參考家系個(gè)體進(jìn)行第1輪基因型檢測(cè)，均在95%以上個(gè)體中獲得基因型。這些標(biāo)記連同“性別”標(biāo)記，共172個(gè)標(biāo)記用于連鎖作圖。采用JoinMap軟件重建遺傳連鎖圖，獲得整合圖譜，該圖譜由22個(gè)連鎖群組成，包含172個(gè)標(biāo)記。進(jìn)行第一輪QTL分析后，采用第1連鎖群中新開(kāi)發(fā)的19個(gè)分子標(biāo)記，對(duì)282個(gè)參考家系個(gè)體進(jìn)行了第2輪基因型檢測(cè)，并基于所有標(biāo)記的基因型，再次進(jìn)行了遺傳連鎖圖譜的重建。重建后的第1連鎖群包含29個(gè)分子標(biāo)記(見(jiàn)圖2)，相關(guān)圖譜文件被用于后續(xù)的QTL精細(xì)定位分析。

圖2 重建的第1連鎖群圖譜

2.3 QTL定位分析

以各個(gè)體在海水中的存活時(shí)長(zhǎng)作為耐鹽性狀，對(duì)檢測(cè)的所有參考家系個(gè)體進(jìn)行QTL分析，獲得6個(gè)QTL，分別位于第1、12、21、22等4個(gè)連鎖群。其中，位于第1連鎖群的st-c的LOD值達(dá)到8.82，可解釋19.2%的表型差異(見(jiàn)表3)。

在本研究中發(fā)現(xiàn)，雌、雄魚(yú)的平均存活時(shí)長(zhǎng)存在顯著差異(P<0.05)。為排除兩性差異對(duì)分析的干擾，獲得更多的QTL，對(duì)雌、雄魚(yú)分別進(jìn)行了QTL定位分析。對(duì)雌性個(gè)體進(jìn)行分析后獲得6個(gè)QTL，分別分布在第10、11、12、14、22等5個(gè)連鎖群；對(duì)雄性個(gè)體進(jìn)行分析后獲得3個(gè)QTL，分別分布在第1、12、22等3個(gè)連鎖群，其中mst-a的LOD值達(dá)到6.29，可解釋19.1%的表型差異(見(jiàn)表3)。

表3 耐鹽QTL明細(xì)表

兩性耐鹽QTL st-c與雄性耐鹽QTL mst-a的LOD值較高，解釋的表型差異比例均大于19%，為主效QTL，因此選定這2個(gè)QTL進(jìn)行進(jìn)一步的精細(xì)定位。采用新開(kāi)發(fā)分子標(biāo)記進(jìn)行第2輪基因型檢測(cè)后，基于所有分子標(biāo)記基因型、重建的遺傳連鎖圖譜及各個(gè)體的表型值，采用MapQTL軟件的MQM方法進(jìn)行定位分析，將st-c定位于第1連鎖群的32.11～33.12 cM，峰值位于32.13 cM，將mst-a定位于第1連鎖群的6.83 cM處(見(jiàn)表3)。在st-c中，位于峰值處的標(biāo)記為“性別”標(biāo)記；在mst-a中，位于峰值處的標(biāo)記為鈉鉀氯協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2(NKCC2)基因內(nèi)含子中的1個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記(見(jiàn)圖3)。

注：圖中小寫字母為存活時(shí)間(ST)、雌性存活時(shí)間(F-ST)、雄性存活時(shí)間(M-ST)等三個(gè)性狀的QTL編號(hào)。

2.4 性別及NKCC2基因型對(duì)耐鹽性狀的影響

在282個(gè)參考家系個(gè)體中，雌性共156尾，雄性共126尾。對(duì)雌、雄魚(yú)的存活時(shí)長(zhǎng)分別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果表明，雌、雄魚(yú)在海水中的平均存活時(shí)長(zhǎng)分別為394.0 min和446.7 min，二者差異極顯著(P<0.001)。

NKCC2基因內(nèi)標(biāo)記的檢測(cè)結(jié)果表明，在參考家系中存在A、B兩種NKCC2基因型。對(duì)所有個(gè)體進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，A型的平均存活時(shí)長(zhǎng)為420.4 min，B型的平均存活時(shí)長(zhǎng)為414.9 min，差異不顯著(P>0.05)；對(duì)雌性個(gè)體進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，A型的平均存活時(shí)長(zhǎng)為395.6 min，B型的平均存活時(shí)長(zhǎng)為385.3 min，差異不顯著(P>0.05)；對(duì)雄性個(gè)體進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，A型的平均存活時(shí)長(zhǎng)為508.8 min，B型的平均存活時(shí)為431.0 min，差異極顯著(P<0.001)(見(jiàn)圖4)。

注：A、B為NKCC2的兩種基因型；***表示基因型間差異極顯著(P<0.001)。

3 討論

3.1 耐鹽羅非魚(yú)的選育與耐鹽QTL定位

羅非魚(yú)是典型的廣鹽性魚(yú)類，種類眾多，但僅有莫桑比克羅非魚(yú)等少數(shù)種類及佛羅里達(dá)紅羅非魚(yú)等雜交種適合在海水等高鹽度水體中養(yǎng)殖[13]。然而，莫桑比克羅非魚(yú)等耐鹽羅非魚(yú)生長(zhǎng)較慢，在生產(chǎn)中應(yīng)用的羅非魚(yú)養(yǎng)殖品系主要來(lái)自于耐鹽性較差的尼羅羅非魚(yú)及部分雜交種[14]。此外，采用海水或半咸水養(yǎng)殖的羅非魚(yú)沒(méi)有淡水養(yǎng)殖羅非魚(yú)常有的泥腥味，肉質(zhì)更好[15]，售價(jià)高于淡水羅非魚(yú)。由于全球淡水資源缺乏，進(jìn)行耐鹽羅非魚(yú)的選育與養(yǎng)殖已成為羅非魚(yú)產(chǎn)業(yè)的一個(gè)重要方向[5]。采用傳統(tǒng)方法進(jìn)行羅非魚(yú)選育周期較長(zhǎng)，如能開(kāi)發(fā)耐鹽相關(guān)分子標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇，則可加速選育進(jìn)程。Jiang等[16]、Gu等[17]對(duì)耐鹽性較差的尼羅羅非魚(yú)及星洲紅羅非魚(yú)進(jìn)行了耐鹽QTL定位研究，在尼羅羅非魚(yú)的LG14及LG18中定位了2個(gè)QTL，在星洲紅羅非魚(yú)LG18中定位了1個(gè)QTL。本研究以高耐鹽的莫桑比克羅非魚(yú)與低耐鹽的紅羅非魚(yú)雜交建立參考家系，并進(jìn)行耐鹽QTL的定位分析，從中篩選得到15個(gè)耐鹽QTL，分布于LG1、LG10、LG11、LG12、LG14、LG21、LG22等7個(gè)連鎖群，這些QTL中的分子標(biāo)記將可用于耐鹽羅非魚(yú)分子標(biāo)記輔助選育，促進(jìn)羅非魚(yú)耐鹽機(jī)理的研究以及耐鹽羅非魚(yú)新品系的快速選育。

3.2 NKCC2與羅非魚(yú)耐鹽性狀

鈉鉀氯協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(NKCC)是一類進(jìn)行鈉、鉀、氯離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白，在脊椎動(dòng)物的體液平衡中起到極為關(guān)鍵的作用，主要包括NKCC1、NKCC2兩種[18]。NKCC1主要在魚(yú)類的鰓部表達(dá)，與鰓的氯離子分泌有關(guān)[19]。NKCC2主要在腸、腎中表達(dá)，通過(guò)氯離子的轉(zhuǎn)運(yùn)促進(jìn)水的吸收[20]。海水中生活的歐鰻，在黃鰻、銀鰻兩個(gè)時(shí)期，其腸NKCC2的表達(dá)量均顯著高于淡水中生活的個(gè)體[20]；海鯛(SparusaurataL.)在鹽度55條件下腸NKCC2的表達(dá)量為鹽度12條件下的3倍[21]。這些研究均表明，NKCC2在魚(yú)類的滲透壓調(diào)節(jié)及海水適應(yīng)中起到非常重要的作用。本研究中發(fā)現(xiàn)，NKCC2基因位于第1連鎖群的主效QTL mst-a峰值處，該QTL可解釋雄性耐鹽性狀19.1%的表型差異；NKCC2的A、B兩種基因型在雄性中的耐鹽性狀差異極顯著，但在雌性中的差異不顯著。這些結(jié)果表明，NKCC2的基因差異很可能決定羅非魚(yú)耐鹽性狀的部分個(gè)體差異，且性狀差異的大小與性別存在一定關(guān)系。本研究開(kāi)發(fā)的NKCC2基因內(nèi)標(biāo)記可作為重要候選分子標(biāo)記用于羅非魚(yú)耐鹽性狀的分子育種。

3.3 羅非魚(yú)耐鹽性狀的兩性差異

本研究在第1連鎖群定位了1個(gè)主效耐鹽QTL st-c，可解釋兩性耐鹽性狀的19.2%，QTL的峰值處為“性別”標(biāo)記，該標(biāo)記代表著1個(gè)XY性別決定位點(diǎn)。對(duì)雌、雄羅非魚(yú)耐鹽性狀的統(tǒng)計(jì)表明，羅非魚(yú)具有顯著的兩性耐鹽差異，從淡水直接轉(zhuǎn)入海水后，雌性和雄性羅非魚(yú)的存活時(shí)長(zhǎng)分別為394.0 min和446.7 min，二者差異極顯著。這些結(jié)果表明，雄性羅非魚(yú)的耐鹽性狀顯著優(yōu)于雌性。已有研究表明，柳、青楊等植物具有顯著的兩性耐鹽差異[22-23]，但至今為止，鮮有魚(yú)類兩性耐鹽差異的研究。本研究中發(fā)現(xiàn)的羅非魚(yú)兩性耐鹽差異的形成機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

本研究結(jié)果表明，在半咸水或海水中進(jìn)行羅非魚(yú)的養(yǎng)殖，選擇全雄群體具有一定的耐鹽優(yōu)勢(shì)。