賽珊 趙楠 王偉偉 羅世菊 李曉捷

(山東東方海洋科技股份有限公司，國家海藻與海參工程技術研究中心，山東省海藻與海參技術創(chuàng)新中心，山東省海藻遺傳育種與栽培技術重點實驗室，山東煙臺 264003)

海帶(Saccharinajaponica)是重要的大型海水經(jīng)濟藻類之一。海帶的生活史具有明顯的異形世代交替，即孢子體與配子體世代交替[1-6]。目前，海帶的人工繁育方式主要有兩種：一種是選取具有明顯優(yōu)勢的成熟孢子體作為親本進行選擇育種；另一種是利用海帶配子體克隆進行育苗。后一種方法具有操作簡單、品種純度高、繁育效率高等優(yōu)點[7-12]。海帶配子體克隆培養(yǎng)方式主要是液體保存，其中影響配子體克隆生長發(fā)育的主要因素是溫度、光照強度和營養(yǎng)鹽等，無機氮與磷的比例以及一些植物生長促進劑和微量元素也對配子體的生長和發(fā)育具有非常重要的作用[13-27]，其中鐵元素對海藻的光合作用、呼吸作用以及一些代謝行為有重要的影響[28-29]。

在海帶配子體的日常保種過程中，培養(yǎng)液中需要加氮和磷這兩種營養(yǎng)鹽。缺少氮鹽會導致生長緩慢，缺少磷鹽會導致生長發(fā)育不良，而添加鐵鹽能促進海帶配子體對氮和磷兩種營養(yǎng)鹽的吸收[30]。劉德厚等[31]的研究表明，鐵鹽對海帶配子體的生長發(fā)育有較大的影響。

為探究鐵鹽對不同品種(系)海帶雌配子體的影響，本研究通過添加不同質(zhì)量濃度Fe3+，對在低溫弱光和高溫強光條件下培養(yǎng)的“901”、韓國海帶和“連雜1號”3個品種(系)海帶雌配子體的生長發(fā)育情況進行了觀察。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

選取實驗室種質(zhì)庫分別保存在低溫弱光[(10.0±1.0)℃、2 μmol/(m2·s)，L]和高溫強光[(15.0±1.0)℃、80 μmol/(m2·s)，H]條件下狀態(tài)良好的“901”(經(jīng)國家審定的海帶品種)、韓國海帶(采自韓國的海帶地理種群)和“連雜1號”雌配子體克隆系。培養(yǎng)液為加熱煮沸的消毒海水，添加質(zhì)量濃度分別為10、1 mg/L的NaNO3-N、KH2PO4-P。

1.2 試驗藥品

檸檬酸鐵為分析純，上海埃彼化學試劑有限公司生產(chǎn)。

1.3 試驗方法

1.3.1 試驗材料預處理

將海帶雌配子體克隆用循環(huán)泵氣動打散，其濾液經(jīng)400目(孔徑38 μm)篩絹過濾后，取適量濾液于直徑為9 cm的培養(yǎng)皿中。在顯微鏡(10×16倍)下鏡檢打散的配子體，以平均每段3～4個細胞、每個視野有4～5個配子體段為宜。將培養(yǎng)皿放置在低溫弱光[10 ℃，≤2 μmol/(m2·s)]條件下靜置1周，使配子體段附著，便于計數(shù)。

1.3.2 正式試驗

試驗設置0、0.5、1.0、1.5 mg/L等4種Fe3+質(zhì)量濃度，光照周期為10 L∶14 D。分別選取保存在低溫弱光[(10.0±1.0)℃、2 μmol/(m2·s)，L]和高溫強光[(15.0±1.0)℃、80 μmol/(m2·s)，H]條件下的試驗材料，放在(10.0±1.0)℃、20 μmol/(m2·s)的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每個試驗組設3個平行。試驗持續(xù)1個月，前10 d每2 d鏡檢1次，統(tǒng)計配子體段的細胞數(shù)，之后每4 d鏡檢1次，拍照觀測配子體的生長狀態(tài)。按照以下公式計算相對生長率(RGR，%/d)和配子體排卵比率(%)。

(1)

配子體排卵比率=100×排卵細胞數(shù)/(排卵細胞數(shù)+未排卵細胞數(shù))

(2)

式(1)中，n0為初始配子體段細胞數(shù)，n1為試驗結束時配子體段細胞數(shù)，t為試驗天數(shù)(d)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用EXCEL 2013整理試驗數(shù)據(jù)，利用SPSS 25.0進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，用Tukey HSD方法進行均值多重比較，結果均以“平均值±標準差”表示，設顯著性水平為0.05。

2 結果

2.1 鐵鹽對海帶雌配子體相對生長率和排卵比率的影響

從圖1-a可以看出，“901”(L)在Fe3+質(zhì)量濃度為0時，培養(yǎng)時間越長，配子體段細胞數(shù)越多。當Fe3+質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、1.5 mg/L時，試驗前8 d，配子體段的細胞數(shù)隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加而增多。在第8天，F(xiàn)e3+質(zhì)量濃度為1.5 mg/L組的配子體段細胞數(shù)最多，由4個增加到18個，相對生長率為22.72 %/d。第10天，由于部分細胞開始排卵，造成配子體段細胞數(shù)呈現(xiàn)負增長。從圖1-b可以看出，“901”(H)在試驗開始后的前6 d，4個Fe3+質(zhì)量濃度組的配子體段細胞數(shù)均增多了。第6天，F(xiàn)e3+質(zhì)量濃度為1.5 mg/L組的配子體段的細胞數(shù)最多，由4個增加到16個，相對生長率為20.26%/d。在第10天，配子體段細胞數(shù)出現(xiàn)負增長?！?01”(L)在試驗開始后的第4天，F(xiàn)e3+質(zhì)量濃度為0、0.5 mg/L的試驗組，其配子體段的細胞數(shù)顯著低于1.0、1.5 mg/L組(P<0.05)，第8天，F(xiàn)e3+質(zhì)量濃度為0 mg/L的組顯著低于其他組(P<0.05)?！?01”(H)在試驗開始后的第6天，0 mg/L組配子體段的細胞數(shù)顯著低于1.0、1.5 mg/L組(P<0.05)，第10天，各組間沒有顯著性差異(P>0.05)。

注：柱狀圖上方不同字母表示同一時間不同F(xiàn)e3+質(zhì)量濃度組間有顯著性差異(P<0.05)，相同字母表示無顯著性差異(P>0.05)。

從圖2和圖3可以看出，在試驗過程中，韓國海帶(L)、(H)和“連雜1號”(L)、(H)均呈現(xiàn)培養(yǎng)時間越長，F(xiàn)e3+質(zhì)量濃度越高，配子體段細胞數(shù)增加越多的趨勢，且均在第10天，當Fe3+質(zhì)量濃度為1.5 mg/L時，配子體段的細胞數(shù)最多。韓國海帶(L)配子體段細胞數(shù)由3個增加到20個，相對生長率為18.26%/d；韓國海帶(H)由3個增加到24個，相對生長率為20.64%/d?！斑B雜1號”(L)由3個增加到18個，相對生長率為16.18%/d；“連雜1號”(H)由3個增加到19個，相對生長率為16.68%/d。韓國海帶(L)、(H)在試驗開始后的前2 d，各試驗組間沒有顯著性差異(P>0.05)。6 d后，當Fe3+質(zhì)量濃度為0 mg/L時，韓國海帶(L)配子體段的細胞增長顯著低于其他3個質(zhì)量濃度組(P<0.05)。第10天，當Fe3+質(zhì)量濃度為0 mg/L時，韓國海帶(H)配子體段的細胞增長顯著低于其他3個質(zhì)量濃度組(P<0.05)?！斑B雜1號”(L)、(H)在試驗的前4 d，各Fe3+質(zhì)量濃度組間配子體段的細胞增長沒有顯著性差異(P>0.05)。但隨著試驗的進行，在第10天，F(xiàn)e3+質(zhì)量濃度為0、0.5 mg/L組的細胞增長數(shù)顯著低于1.0、1.5 mg/L組(P<0.05)。

注：柱狀圖上方不同字母表示同一時間不同F(xiàn)e3+質(zhì)量濃度組間有顯著性差異(P<0.05)，相同字母表示無顯著性差異(P>0.05)。

從圖1～圖3可以看出，“901”(L)在試驗的前8 d、“901”(H)在試驗的前6 d，F(xiàn)e3+質(zhì)量濃度越高，其配子體段細胞數(shù)增長速度越快。韓國海帶和“連雜1號”在試驗的前10 d，其配子體段細胞數(shù)的增長速度基本上隨著Fe3+質(zhì)量濃度的增高而加快，并且與高溫強光條件下的雌配子體相比，低溫弱光條件下雌配子體的相對生長率較低。

注：柱狀圖上方不同字母表示同一時間不同F(xiàn)e3+質(zhì)量濃度組間有顯著性差異(P<0.05)，相同字母表示無顯著性差異(P>0.05)。

從圖4可以看出，“901”(L)在Fe3+質(zhì)量濃度為0 mg/L時沒有排卵現(xiàn)象，而“901”(H)的排卵比率達73.8%?！?01”(L)和“901”(H)均在Fe3+質(zhì)量濃度為1.5 mg/L時，其配子體的排卵比率最高，分別達91.06%和100%?！?01”(L)配子體的排卵比率在4個Fe3+質(zhì)量濃度組間有顯著性差異(P<0.05)；“901”(H)配子體的排卵比率在Fe3+質(zhì)量濃度1.0、1.5 mg/L組間沒有顯著性差異(P>0.05)，3個添加Fe3+的組顯著高于不添加Fe3+組(P<0.05)。

從圖5可以看出，韓國海帶(L)只有在Fe3+質(zhì)量濃度為0.5 mg/L時有排卵現(xiàn)象，其配子體排卵比率為1.83%。韓國海帶(H)在Fe3+質(zhì)量濃度為0 mg/L時沒有排卵現(xiàn)象，在Fe3+質(zhì)量濃度為0.5 mg/L時，其配子體排卵比率為4.33%，顯著高于Fe3+質(zhì)量濃度為1.5 mg/L的組(P<0.05)。

從圖6可以看出，“連雜1號”(L)、(H)在Fe3+質(zhì)量濃度為0 mg/L時均沒有排卵現(xiàn)象，在Fe3+質(zhì)量濃度為1.0 mg/L時，其配子體排卵比率最高，分別為6.23%和5.70%?！斑B雜1號”(L)配子體排卵比率在Fe3+質(zhì)量濃度0.5、1.0 mg/L兩個組間沒有顯著性差異(P>0.05)，但這兩組均顯著高于1.5 mg/L組(P<0.05)?！斑B雜1號”(H)配子體排卵比率在Fe3+質(zhì)量濃度為1.0、1.5 mg/L的兩個組間差異不顯著(P>0.05)，但顯著高于0.5 mg/L組(P<0.05)。從圖4～圖6可以看出，鐵鹽對“901”雌配子體孤雌生殖的影響最為明顯，F(xiàn)e3+質(zhì)量濃度越高，配子體的排卵比率越高，而韓國海帶和“連雜1號”雌配子體的排卵比率均很低。

注：柱狀圖上方小寫字母不同表示低溫弱光條件下不同F(xiàn)e3+質(zhì)量濃度組間差異顯著(P<0.05)，大寫字母不同表示高溫強光條件下不同F(xiàn)e3+質(zhì)量濃度組間差異顯著(P<0.05)。

注：柱狀圖上方小寫字母不同表示低溫弱光條件下不同F(xiàn)e3+質(zhì)量濃度組間差異顯著(P<0.05)，大寫字母不同表示高溫強光條件下不同F(xiàn)e3+質(zhì)量濃度組間差異顯著(P<0.05)。

注：柱狀圖上方小寫字母不同表示低溫弱光條件下不同F(xiàn)e3+質(zhì)量濃度組間差異顯著(P<0.05)，大寫字母不同表示高溫強光條件下不同F(xiàn)e3+質(zhì)量濃度組間差異顯著(P<0.05)。

2.2 鐵鹽對海帶雌配子體生長發(fā)育狀態(tài)的影響

試驗第2天，“901”(L)配子體(見圖7，a)的狀態(tài)沒有明顯變化。試驗第4～6天，F(xiàn)e3+質(zhì)量濃度為0 mg/L組的配子體生長較慢，F(xiàn)e3+質(zhì)量濃度越高，配子體營養(yǎng)生長越快。試驗第8天，F(xiàn)e3+質(zhì)量濃度為1.5 mg/L的組中有少部分配子體細胞頂端出現(xiàn)卵囊，個別細胞排卵(見圖7，b)。試驗第10天，0.5、1.5 mg/L的組配子體均出現(xiàn)排卵現(xiàn)象；第14～22天，進入排卵高峰期(見圖7，c)。第22天后，卵細胞開始大量轉成孢子體(見圖7，d)?！?01”(H)在試驗第8天，F(xiàn)e3+質(zhì)量濃度為0.5、1.5 mg/L的組均開始排卵；試驗第10天，F(xiàn)e3+質(zhì)量濃度為0 mg/L的組也出現(xiàn)了排卵現(xiàn)象；第10～18天，配子體大量排卵，第18天，卵細胞開始大量轉成孢子體。Fe3+質(zhì)量濃度越高，韓國海帶配子體營養(yǎng)生長的速度越快，在試驗第16天，已形成復雜的分枝體和簇狀體(見圖8，a)，只有個別細胞排卵進行孤雌生殖(見圖8，b)?！斑B雜1號”在Fe3+質(zhì)量濃度為0.5、1.5 mg/L時，F(xiàn)e3+質(zhì)量濃度越高，其營養(yǎng)生長越快，且色素越深(見圖9，a)，少量卵細胞則轉成小孢子體(見圖9，b)。

a.配子體;b.正在排卵;c.大量排卵;d.形成孢子體

a.簇狀體;b.排卵

a.簇狀體;b.畸形孢子體

試驗過程中發(fā)現(xiàn)，“901”雌配子體孤雌生殖形成了大量的孢子體，其形態(tài)各樣，有橢圓形、扇形、帶形、波浪形等(見圖10)。但這些孢子體全部是畸形的，培養(yǎng)幾天后就會出現(xiàn)細胞膨大、色素降解等現(xiàn)象，最終全部死亡(見圖11)。

圖10 各種形態(tài)的畸形孢子體

a.正常形態(tài)的孢子體; b，c，d.即將死亡的孢子體

3 討論

本試驗通過添加鐵鹽，對在低溫弱光(L)和高溫強光(H)兩種條件下培養(yǎng)的“901”、韓國海帶和“連雜1號”3個品種(系)海帶雌配子體的生長發(fā)育情況進行了觀察比較，結果發(fā)現(xiàn)：鐵鹽對海帶雌配子體的生長發(fā)育具有顯著的促進作用，但不同品種(系)間海帶雌配子體的表現(xiàn)并不相同。在不添加鐵鹽的情況下，除“901”(H)出現(xiàn)排卵現(xiàn)象外，其他2個品系均進行營養(yǎng)生長；在添加鐵鹽的情況下，“901”、韓國海帶和“連雜1號”均出現(xiàn)排卵現(xiàn)象，說明鐵離子能夠促進海帶雌配子體的孤雌生殖[32-33]。試驗過程中發(fā)現(xiàn)，“901”海帶雌配子體易進行孤雌生殖，且Fe3+質(zhì)量濃度越高，其孤雌生殖比率越高。當Fe3+質(zhì)量濃度為1.5 mg/L時，在低溫弱光和高溫強光條件下培養(yǎng)的“901”海帶雌配子體，其排卵比率分別高達91.06%和100%。韓國海帶和“連雜1號”的排卵比率相對較低，均不超過7%，其主要進行營養(yǎng)生長。由試驗結果可以看出，鐵離子對“901”生長發(fā)育的促進效果比對韓國海帶和“連雜1號”更為顯著。其中，“901”(H)在不加鐵鹽的情況下排卵比率為73.8%。分析認為，該品系比較容易受環(huán)境因素的影響，在高溫強光條件下，其生長被抑制，恢復到適宜條件后，配子體為了生存，對繁育有迫切的需求，因而快速排卵進行孤雌生殖產(chǎn)生孢子體。相反，韓國海帶(L)、(H)在Fe3+質(zhì)量濃度為0.5 mg/L時排卵比率最高，但也僅為1.83%和4.33%，其他Fe3+質(zhì)量濃度組的韓國海帶(L)無排卵現(xiàn)象?！斑B雜1號”(L)、(H)在Fe3+質(zhì)量濃度為1.0 mg/L時排卵比率最高，但僅為6.23%和5.70%。這兩個品系均是鐵離子質(zhì)量濃度越高，配子體營養(yǎng)生長越快，這與王瀟等[34]的研究結果一致，說明適宜的鐵離子質(zhì)量濃度能夠促進配子體的生長。本試驗結果還表明，鐵和氮、磷營養(yǎng)鹽在促進海帶配子體發(fā)育時具有協(xié)同作用，鐵是海帶配子體由營養(yǎng)生長到發(fā)育成熟再到有性生殖過程中的關鍵因素，但鐵質(zhì)量濃度過高會抑制海帶配子體的發(fā)育[34]。

本試驗發(fā)現(xiàn)，同一配子體上排卵細胞越多，越容易刺激周圍細胞成熟進行排卵，配子體營養(yǎng)生長越受到抑制；反之，配子體營養(yǎng)生長越旺盛，排卵現(xiàn)象越少。試驗中，孤雌生殖產(chǎn)生的卵細胞和孢子體均不易存活，在海帶和裙帶菜[35-36]中均存在這種情況。本試驗中，海帶雌配子體孤雌生殖所形成的孢子體均為畸形，且最后都死亡了，而在戴繼勛等[35]和方宗熙等[32]的報道中有少量自然成熟的孢子體。分析其可能性，一是孤雌生殖產(chǎn)生的孢子體存在基因缺陷[37]，二是本試驗中采用培養(yǎng)皿培養(yǎng)，其生存空間較小，不適宜生長，三是所選用的海帶品系不同。鐵鹽對海帶配子體的生長發(fā)育具有重要影響，其適宜添加濃度以及與氮、磷等其他營養(yǎng)因子的協(xié)同機理等研究對海帶苗種生產(chǎn)有著重要意義。