喬 羽 ， 陳華彬 ， 王興吉 ， 王克芬 ， 肖 靜

（1.山東隆科特酶制劑有限公司，山東臨沂 276400；2.齊魯工業(yè)大學（山東省科學院），山東濟南 250000）

羽毛素有“天然蛋白質(zhì)之冠”之稱，蛋白質(zhì)含量高達85%以上，但羽毛中的蛋白質(zhì)是一種不溶性的角蛋白， 其是一種以ɑ-螺旋和β-折疊構(gòu)成的超螺旋多肽鏈， 內(nèi)部的半胱氨酸二硫鍵作為連接橋形成復雜的交聯(lián)網(wǎng)， 此外羽毛外層被一層脂質(zhì)覆蓋使角蛋白親水性降低， 這進一步增加了角蛋白對蛋白酶水解的抗性， 所以羽毛不易被動物直接消化利用吸收（李爽等，2017；陳忱等，2015；劉玉芬等，2010）。 近些年養(yǎng)殖業(yè)的迅猛發(fā)展加大了對蛋白質(zhì)飼料的需求， 羽毛粉的開發(fā)利用不僅能緩解生產(chǎn)蛋白質(zhì)種類飼料原料的緊缺， 也使廢棄羽毛變廢為寶。

目前國內(nèi)大多采用導熱油高溫高壓水解法生產(chǎn)羽毛粉， 即采用導熱油水解罐將羽毛水解烘干一次完成。 這種生產(chǎn)工藝簡單，投資少，但羽毛粉的品質(zhì)難以保證，胃蛋白酶消化率普遍偏低。為了提高羽毛粉營養(yǎng)價值， 促進羽毛粉在動物體內(nèi)的消化利用， 近些年不少專家學者以羽毛為原料進行試驗探究。 楊波等（2007）采用高溫過氧乙酸法處理雞毛發(fā)現(xiàn)，在溫度 128 ℃，料液比1:5，加入25%過氧乙酸濃度， 反應20 min， 羽毛溶解率達90%，體外胃蛋白消化率可提高至82.87%。 郝魯江等（2016）在羽毛粉中加入角蛋白酶0.03 g，35 ℃酶解36 h，羽毛分解率達到50.5% ，酶解液可溶性蛋白含量為225.7 mg/L， 而酶解羽毛蛋白粉的胃蛋白酶體外消化率為23%；單春喬等（2016）使用 0.7%的氫氧化鈉溶液90 ℃預處理150 min，再使用 0.8%的角蛋白酶55 ℃酶解8 h，最終產(chǎn)品中的肽含量達73.0%；陳明等（2020）選取 4 種不同加工方式（普通、水解、酶解、酵解）的羽毛粉發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過酵解加工方式處理的羽毛粉品質(zhì)最好。 通過這些研究發(fā)現(xiàn)， 提高羽毛粉的分解消化率一般需要較高濃度的化學試劑或較長的酶解時間， 這在一定程度上造成了資源浪費并提高了生產(chǎn)成本。

通過前期的研究發(fā)現(xiàn)單純使用蛋白酶酶解羽毛存在酶解時間長、效率低的缺點，但通過使用低濃度的羽毛預處理劑浸泡后，酶解效率大大提高。本試驗以白雞毛為試驗材料， 采用均勻設計法優(yōu)化羽毛粉的加工工藝， 旨在提高羽毛粉成品的胃蛋白酶消化率，提升羽毛粉的營養(yǎng)吸收價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 白雞毛、羽毛粉，取自羽毛粉加工廠。羽毛預處理劑、堿性蛋白酶、脂肪酶，山東隆科特酶制劑有限公司；1:10000 胃蛋白酶， 生工生物工程（上海）股份有限公司；相對分子質(zhì)量標準物質(zhì)： 細胞色素 C （Mr 12355）、 抑肽酶（Mr 6515）、桿菌肽（Mr 1450）、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸（Mr 451）、乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸（Mr 189），美國 sigma 公司。

1.2 儀器與設備 恒溫鼓風干燥箱 （ZXRDA5210，上海智城分析儀器制造有限公司）；全自動定氮儀（KDN-1000，上海昕銳儀器儀表有限公司）；恒溫鼓風干燥箱（ZXRD-A5210，上海智城分析儀器制造有限公司）；顯微鏡（BM-1000，南京江南永新光學有限公司）； 高效液相色譜儀（Agilent1260，安捷倫科技（中國）有限公司）；液相色譜分析柱（TSKgel G2000SWXL，日本島津株式會社）。

1.3 試驗方法

1.3.1 羽毛前處理準備 將羽毛在加入0.8%濃度的羽毛預處理劑中常溫浸泡30 min，撈出羽毛擠壓瀝水后置于130 ℃下處理30 min，粉碎得到羽毛漿。

1.3.2 酶解工藝的研究 單因素試驗： 探究堿性蛋白酶與脂肪酶配比（1:1、2:1、3:1、1:2、1:3），反應pH （6、7、8、9、10）， 反 應 溫度（30、40、50、60、70℃），酶添加量（0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%，以堿性蛋白酶基準記），酶解時間（0、2、4、6、8 h），對胃蛋白酶消化率和可溶性蛋白質(zhì)含量的影響，確定各單因素的范圍值。 初始試驗設定值為堿性蛋白酶添加量0.3%，反應pH 7.0，反應溫度50 ℃，酶解2 h。

1.3.3 均勻設計優(yōu)化酶解工藝 在單因素試驗的基礎上， 以羽毛粉中的可溶性蛋白質(zhì)含量和胃蛋白酶消化率為評價指標，選取反應pH（X1）、反應溫度（X2）、酶添加量（X3）及酶解時間（X4）為考察因素，每個因素設計5 個水平，每個水平重復一次，采用 DPS 7.05 進行 U10（104）均勻試驗設計優(yōu)化酶解工藝條件， 均勻試驗設計方案見表1。

表1 均勻試驗設計方案

1.3.4 測定的指標 可溶性蛋白質(zhì)含量的測定：采用考馬斯亮藍法（喬羽等，2019）測定羽毛粉中的可溶性蛋白質(zhì)含量。

胃蛋白酶消化率的測定（GB/T 6432-1994）：取1 g 羽毛粉置于250 mL 的錐形瓶中， 加入150 mL的20 UI/mL 胃蛋白酶溶液，蓋塞，45 ℃恒溫恒速保溫酶解消化16 h，過濾，烘干至恒重，測定羽毛粉消化前后剩余的粗蛋白質(zhì)含量， 并計算其消化率， 其他具體試驗步驟參考 《動物性蛋白質(zhì)飼料胃蛋白酶消化率的測定過濾法 （GB/T 17811-2008）》（中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗疫總局，2008），粗蛋白質(zhì)含量的測定參考《GB/T 6432飼料中粗蛋白測定方法》。

1.3.5 凝膠過濾色譜測定酶解羽毛粉的相對分子質(zhì)量分布 （中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗疫總局，2008）。

相對分子質(zhì)量標準物質(zhì)溶液的配制： 分別用流動相配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL 的不同相對分子質(zhì)量肽標準溶液，按1:1:1:1:1 等體積比混合，用孔徑為0.22 μm 濾膜過濾后備用。

色譜條件： 色譜柱 TSK-GEL G2000SWXL（300 mm×7.8 mm，5 μm）， 流動相為乙腈-水-三氟乙酸（45:55:0.1，V/V）；流速 0.5 mL/min；柱溫 30 ℃；進樣體積20 μL；檢測波長220 nm；檢測時間30 min。

樣品處理： 取0.1 g 羽毛粉加入5 mL 流動相，超聲10 min，使樣品充分溶解混勻，取1 mL上清液用孔徑為0.22 μm 聚四氟乙烯過濾膜過濾后，上機進樣。其他步驟參考《GB/T22729-2008 海洋魚低聚肽粉》。

1.3.6 羽毛粉鏡檢 采用四分法取羽毛粉樣品，選取少量羽毛粉代表性樣品置于載玻片中間，用取樣針將羽毛粉攤平分散開。 使用生物顯微鏡在合適的放大倍數(shù)下觀察羽毛粉的顆粒狀態(tài)。

2 結(jié)果與分析

2.1 堿性蛋白酶與脂肪酶配比對酶解效果的影響 由圖1 可知， 不同堿性蛋白酶與脂肪酶的配比對酶解羽毛粉中的可溶性蛋白質(zhì)含量及胃蛋白酶消化率存在一定的影響， 脂肪酶占比越高，羽毛粉中的可溶性蛋白質(zhì)含量和胃蛋白酶消化率越低， 當堿性蛋白酶與脂肪酶配比為3:1 時，酶解羽毛粉的可溶性蛋白質(zhì)含量和胃蛋白酶消化率相對都達到最高。這可能與羽毛表層的蠟脂有關(guān)，由于羽毛外層被一層脂質(zhì)覆蓋，降低了角蛋白的親水性，并在一定程度上阻礙堿性蛋白酶與角蛋白的直接接觸（王德山等，2016）。 加入脂肪酶可以通過酶解羽毛表面的脂質(zhì)層，提高堿性蛋白酶的酶解效率。綜上選擇堿性蛋白酶與脂肪酶配比為3:1。

圖1 堿性蛋白酶與脂肪酶配比對可溶性蛋白質(zhì)含量及胃蛋白酶消化率的影響

2.2 反應pH 對酶解效果的影響 酶解過程中的pH 會影響最終羽毛粉的可溶性蛋白質(zhì)含量和胃蛋白酶消化率。由于使用堿性蛋白酶與脂肪酶復合酶解羽毛粉，當酶解pH 過高，會影響脂肪酶的酶活力， 導致酶解效率降低， 當酶解pH過低， 脂肪酶和堿性蛋白酶酶解能力受到影響。由圖2 可知，隨著pH 的增大，羽毛粉的胃蛋白酶消化率逐步趨于穩(wěn)定，可溶性蛋白質(zhì)的含量呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，當酶解過程中的pH 為8.0 時， 酶解羽毛粉的可溶性蛋白質(zhì)含量和胃蛋白酶消化率都達到最高，綜上選擇復合酶解過程中的 pH 為 8.0。

圖2 反應pH 對可溶性蛋白質(zhì)含量及胃蛋白酶消化率的影響

2.3 反應溫度對酶解效果的影響 脂肪酶和堿性蛋白酶的最適反應溫度不同， 復合酶解時的溫度也會影響羽毛最終的酶解效果。如圖3 所示，在30 ~ 70 ℃，隨著酶解溫度的升高，羽毛粉中的可溶性蛋白質(zhì)含量和胃蛋白酶消化率呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢。 當酶解溫度為50 ℃時，羽毛酶解效果最好，初步定50 ℃為最適酶解溫度。

圖3 反應溫度對可溶性蛋白質(zhì)含量及胃蛋白酶消化率的影響

2.4 酶添加量對酶解效果的影響 酶處理過程中加酶量并不是添加越多效果越好，如圖4 所示，在0.3% ~ 0.9%，隨著加酶量的增大，羽毛粉中的可溶性蛋白質(zhì)含量也越大，但當加酶量超過0.9%時，羽毛粉中的可溶性蛋白質(zhì)含量開始下降，可能是酶解過程中產(chǎn)生了競爭性抑制作用 （梁玥等，2016）， 導致羽毛粉中的可溶性蛋白質(zhì)含量下降。綜合羽毛粉中的可溶性蛋白質(zhì)含量和胃蛋白酶消化率，酶添加量初步定為0.9%。

圖4 酶添加量對可溶性蛋白質(zhì)含量及胃蛋白酶消化率的影響

2.5 反應時間對酶解效果的影響 酶解時間關(guān)系著最終羽毛粉的產(chǎn)品質(zhì)量和生產(chǎn)周期， 如圖5所示， 羽毛粉中的可溶性蛋白質(zhì)含量呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢， 而胃蛋白酶消化率升高到一定高度后，在此值范圍內(nèi)上下浮動。 當酶解4 h 時，羽毛粉的胃蛋白酶消化率和可溶性蛋白質(zhì)含量達到最大，因此酶解時間初步定為4 h。

圖5 酶解時間對可溶性蛋白質(zhì)含量及胃蛋白酶消化率的影響

2.6 均勻設計優(yōu)化酶解工藝

2.6.1 工藝優(yōu)化 在單因素試驗的基礎上，確定均勻設計因素水平（表2）。根據(jù)均勻設計方案進行試驗，試驗結(jié)果見表3。 以羽毛粉中的可溶性蛋白質(zhì)含量（Y1）和胃蛋白酶消化率（Y2）為響應值，利用 DPS7.0 軟件對試驗數(shù)據(jù)進行二次多項式逐步回歸分析， 得到4 個因素的多元回歸方程。

表2 均勻試驗設計因素水平

表3 均勻試驗設計方案及結(jié)果

以可溶性蛋白質(zhì)含量為響應值，對試驗數(shù)據(jù)進行二次多項式逐步回歸分析， 得回歸方程為Y1=2214.549401-80.65020661X2-12.268269481X1X1+0.4420199222X2X2-1.3107131072X4X4+4.064112090X1X2-2.5480299694X1X4+0.6275776043X2X4-1.7147225711X3X4，對模型進行顯著性檢驗，其中相關(guān)系數(shù)R=0.9999，F(xiàn) 值=1081.09，顯著水平 P=0.0235（<0.05），方程顯著，說明該模型擬合程度較好，模型預測最佳工藝參數(shù)即反應pH 7.39， 反應溫度46 ℃， 酶添加量0.92%，酶解時間3.49 h，預測可溶性蛋白質(zhì)含量最優(yōu)結(jié)果165.05 mg/g。

以胃蛋白酶消化率為響應值， 對數(shù)據(jù)進行二次多項式回歸分析，得到回歸方程為Y2=168.7741174+0.08892878258X2-176.94330551X3+117.57496705X3X3-0.19109925296X4X4-0.6254987871X2X3+2.4554021423X3X4， 對模型進行顯著性檢驗，其中相關(guān)系數(shù) R=0.9999，F(xiàn) 值=3274.05， 顯著水平P=0.0001（<0.01），方程顯著，說明該模型擬合程度好，模型預測最佳工藝參數(shù)即反應pH 7.50，反應溫度46 ℃，酶添加量0.7%，酶解時間 4.3 h，預測胃蛋白酶消化率90.33%。

通過試驗結(jié)果可知， 兩個評價指標下對應的最佳工藝參數(shù)并不完全一致， 其中酶添加量和酶解時間相差較大， 考慮到實際生產(chǎn)周期和生產(chǎn)便捷性，在兩者最優(yōu)工藝參數(shù)基礎上進行微調(diào)，調(diào)整后的工藝參數(shù)為反應pH 7.5， 反應溫度46 ℃，酶添加量0.9%，酶解時間3.5 h。

2.6.2 驗證試驗 以市售水解羽毛粉作為對照，將均勻設計優(yōu)化后的參數(shù)應用于羽毛酶解工藝中，對得到的酶解羽毛粉進行測定。 結(jié)果如表4 所示，酶解羽毛粉中的可溶性蛋白質(zhì)含量為157.35 mg/g，胃蛋白酶消化率為90.07%， 與預測結(jié)果基本吻合。 優(yōu)化工藝后的酶解羽毛粉比市售水解羽毛粉中的可溶性蛋白質(zhì)含量提高了1224.49%，胃蛋白酶消化率提高了57.85%。

表4 驗證試驗結(jié)果

2.7 羽毛粉感官及組成指標評價

2.7.1 羽毛粉感官評價 經(jīng)酶解處理得到的羽毛粉與市售水解羽毛粉進行對比。 從外觀和氣味上來看， 酶解羽毛粉呈淡黃色， 顆粒大小均一，粉質(zhì)細膩均勻，基本無腥味；市售羽毛粉顆粒粗糙，腥味較重。 鏡檢結(jié)果顯示，市售羽毛粉視野中存在大量未被水解的羽毛桿， 說明羽毛水解不徹底； 酶解羽毛粉視野中顆?；玖６染鶆?，結(jié)團膠粒較少。

2.7.2 優(yōu)化工藝后羽毛粉中多肽分子量分布 采用凝膠過濾色譜測定優(yōu)化后羽毛粉與市售羽毛粉中肽分子質(zhì)量分布，結(jié)果如表5 所示，經(jīng)酶解后的羽毛粉中多肽和寡肽占比升高，其中<5000 Da 的多肽占比達 92.42% ， 遠高于市售羽毛粉（63.17%），經(jīng)優(yōu)化酶解工藝處理后的羽毛粉中絕大多數(shù)角蛋白已被酶解成多肽和氨基酸。

表5 羽毛粉中分子質(zhì)量分布峰面積占比 %

3 小結(jié)

本處理工藝使用低濃度的羽毛預處理劑浸泡， 配合短時間的高溫處理打開角蛋白間的二硫鍵，以復合酶解的方式酶解羽毛表層的脂質(zhì)，使角蛋白與堿性蛋白酶充分接觸， 最終不僅提高了羽毛粉的胃蛋白酶消化率， 而且加快了酶解時間，提高了生產(chǎn)效率。 目前市售品質(zhì)較好的國產(chǎn)魚粉胃蛋白酶消化率為80%左右， 經(jīng)優(yōu)化工藝處理后的羽毛粉體外胃蛋白酶消化率達到了90.07%， 在一定程度上可作為優(yōu)質(zhì)的蛋白飼料源替代魚粉。

本研究通過單因素試驗和均勻設計試驗優(yōu)化提高胃蛋白酶消化率的羽毛粉加工工藝， 確定最優(yōu)的酶解工藝為反應pH 7.5，反應溫度46 ℃，堿性蛋白酶添加量0.9%，脂肪酶添加量0.3%，酶解時間3.5 h，此時可溶性蛋白質(zhì)含量為157.35 mg/g，胃蛋白酶消化率為90.07%。 該工藝處理下的羽毛粉顆粒均勻， 無腥味， 小于5000 Da 的多肽占比達92.42%。 該工藝對酶解羽毛粉的生產(chǎn)提供了參考，也對開發(fā)高附加值的羽毛肽粉具有重要的意義。