李玉磊 張瑞芳 劉莉敏

肺炎是全世界發(fā)病率和死亡率的主要原因，肺泡上皮細(xì)胞損害及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)與肺炎的發(fā)展密切相關(guān)；研究表明，中醫(yī)藥能改善臨床癥狀，減輕炎癥反應(yīng)，提高臨床療效[1-2]。白芍總苷是從中藥白芍干燥根部提取的有效成分，具有廣泛的抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用[3]。研究報(bào)道白芍總苷可降低炎癥程度，對(duì)慢性心力衰竭大鼠起保護(hù)作用[4]。白芍總苷可以有效調(diào)節(jié)炎癥因子表達(dá)，減少結(jié)腸組織的炎癥損傷[5]。白芍總苷通過(guò)調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)，抑制氧化應(yīng)激和炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而抑制局灶性腦缺血后海馬神經(jīng)元損傷[6]。肺炎鏈球菌是導(dǎo)致社區(qū)獲得性肺炎最主要的病原體，然而白芍總苷對(duì)肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制尚不清楚。研究報(bào)道重癥肺炎患兒外周血中miR-23b-3p低表達(dá)，與病情加重、炎癥反應(yīng)激活有關(guān)[7]。miR-23b-3p靶向PALM3抑制肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的A549炎癥和細(xì)胞凋亡[8]。在線軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-23b-3p與叉頭盒蛋白A1(FoxA1)有結(jié)合位點(diǎn)。而抑制叉頭盒蛋白A1(FoxA1)表達(dá)可緩解脂多糖誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞損傷[9]。然而miR-23b-3p與FoxA1的關(guān)系，以及白芍總苷是否調(diào)控miR-23b-3p與FoxA1的表達(dá)也尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)旨在研究白芍總苷對(duì)肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制是否與miR-23b-3p與FoxA1有關(guān)。

資料與方法

一、材料

肺泡上皮細(xì)胞A549、肺炎鏈球菌購(gòu)自美國(guó)ATCC；RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；白芍總苷膠囊(國(guó)藥準(zhǔn)字H20055058，規(guī)格：0.3g/粒)購(gòu)自寧波立華制藥有限公司；CCK-8試劑盒、凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自日本同仁研究所；IL-6、IL-10酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒、蛋白提取試劑盒購(gòu)自上海研生實(shí)業(yè)有限公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海翌圣生物科技有限公司。

二、方法

1 細(xì)胞處理與分組 肺泡上皮細(xì)胞A549培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基中，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用1×108CFU/mL的肺炎鏈球菌培養(yǎng)細(xì)胞，作為模型(Model)組，未經(jīng)感染的細(xì)胞作為對(duì)照(Con)組；分別用17.5 mg/mL、35 mg/mL、70 mg/mL的白芍總苷處理A549細(xì)胞后，用1×108CFU/mL的肺炎鏈球菌感染，作為Model+白芍總苷低、中、高劑量組；將miR-23b-3p抑制劑轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后，用70 mg/mL的白芍總苷處理，再用1×108CFU/mL的肺炎鏈球菌感染，作為Model+白芍總苷+anti-miR-23b-3p組。

2 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活性 各組培養(yǎng)48 h的細(xì)胞，每孔中加入10 μL CCK-8試劑，孵育2 h后，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處吸光度值(OD)。

3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集各組細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS漂洗，加入400 μL的結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞；然后加入10 μL的Annexin V-FITC，再加入5 μL的PI，混勻避光孵育10 min；上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)IL-6、IL-10水平 各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后取上清，具體按照試劑盒操作進(jìn)，酶標(biāo)儀檢測(cè)各組OD450nm值；以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品OD值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查找相應(yīng)濃度。

5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)miR-23b-3p表達(dá)水平 提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以U6為內(nèi)參進(jìn)行PCR擴(kuò)增，95 ℃預(yù)變性2 min(1個(gè)循環(huán))，95 ℃變性30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s(40個(gè)循環(huán))，72 ℃延長(zhǎng)5 min；相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt法計(jì)算。miR-23b-3p上游引物序列：5′-ACACTCCAGCTGGGATCACATTGCCAGGGAT-3′，下游引物序列：5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGTGGTAAT-3′；U6上游引物序列：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物序列：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

6 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)FoxA1蛋白表達(dá) 提取總蛋白，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜，封閉液封閉1 h，加入FoxA1抗體(1 ∶800)4 ℃孵育過(guò)夜；加入二抗(1 ∶2 000)室溫孵育2 h，用ECL發(fā)光液顯影，分析蛋白條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

7 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 構(gòu)建FoxA1的3′UTR野生型和突變型熒光素酶載體，將其分別與miR-NC或miR-23b-3p共轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作檢測(cè)細(xì)胞的熒光素酶活性。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、白芍總苷對(duì)肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞凋亡和細(xì)胞活性的影響

與Con組相比，Model組A549細(xì)胞活性降低，細(xì)胞凋亡率升高，IL-6含量升高，IL-10含量降低(P<0.05)；與Model組相比，Model+白芍總苷低、中、高劑量組A549細(xì)胞活性升高，細(xì)胞凋亡率降低，IL-6含量降低，IL-10含量升高，呈劑量依賴(lài)性(P<0.05)(圖1)。

圖1 白芍總苷抑制肺炎鏈球菌誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡、提高細(xì)胞活性及對(duì)IL-6和IL-10含量的影響

二、白芍總苷對(duì)肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞中miR-23b-3p和FoxA1表達(dá)的影響

與Con組相比，Model組肺泡上皮細(xì)胞中miR-23b-3p表達(dá)水平降低，F(xiàn)oxA1蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)；與Model組相比，Model+白芍總苷低、中、高劑量組肺泡上皮細(xì)胞中miR-23b-3p表達(dá)水平升高，F(xiàn)oxA1蛋白表達(dá)水平降低，呈劑量依賴(lài)性(P<0.05)(圖2)。

圖2 白芍總苷對(duì)miR-23b-3p和FoxA1表達(dá)的影響

三、過(guò)表達(dá)miR-23b-3p對(duì)肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞凋亡、細(xì)胞活性及IL-6和IL-10含量的影響

與Model組和Model+miR-NC組相比，Model+miR-23b-3p組miR-23b-3p表達(dá)水平升高，F(xiàn)oxA1蛋白表達(dá)水平降低，細(xì)胞活性升高，細(xì)胞凋亡率降低，IL-6含量降低，IL-10含量升高(P<0.05)(圖3)。

圖3 過(guò)表達(dá)miR-23b-3p對(duì)肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞凋亡、細(xì)胞活性及IL-6和IL-10含量的影響

四、抑制miR-23b-3p對(duì)白芍總苷作用的肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞凋亡、細(xì)胞活性及IL-6和IL-10含量的影響

與Model+白芍總苷組相比，Model+白芍總苷+anti-miR-23b-3p組miR-23b-3p表達(dá)水平降低，F(xiàn)oxA1蛋白表達(dá)水平升高，細(xì)胞活性降低，細(xì)胞凋亡率升高，IL-6含量升高，IL-10含量降低(P<0.05)(圖4)。

圖4 抑制miR-23b-3p可逆轉(zhuǎn)白芍總苷對(duì)肺炎鏈球菌誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡、活性和IL-6和IL-10含量的影響

五、miR-23b-3p靶向FoxA1

Targetscan軟件預(yù)測(cè)顯示FoxA1的3′UTR含有miR-23b-3p的互補(bǔ)序列(圖5)；wt-FoxA1與miR-23b-3p共轉(zhuǎn)染后細(xì)胞熒光素酶活性降低(P<0.05)，而mut-FoxA1與miR-23b-3p共轉(zhuǎn)染后細(xì)胞熒光素酶活性無(wú)顯著變化。

圖5 FoxA1和miR-23b-3p的互補(bǔ)序列及熒光素酶活性檢測(cè)

討 論

近些年研究表明，中醫(yī)藥治療肺炎具有一定的優(yōu)勢(shì)和特色，因此開(kāi)發(fā)新的中藥對(duì)治療肺炎具有重要意義[10]。研究報(bào)道白芍總苷能夠通過(guò)抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)而對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化表現(xiàn)出一定的保護(hù)作用[11]。白芍總苷抑制XIST表達(dá)以調(diào)節(jié)miR-124-3p/ITGB1軸，從而減輕缺氧/復(fù)氧處理的腎細(xì)胞的凋亡和炎癥[12]。白芍總苷通過(guò)降低炎癥因子IL-1β，IL-6和TNF-α的水平以及減少細(xì)胞凋亡來(lái)減輕大鼠的血腦屏障破壞和腦缺血/再灌注損傷[13]。本實(shí)驗(yàn)用肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞建立肺炎細(xì)胞模型，用不同濃度的白芍總苷處理，結(jié)果顯示，肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞的活性升高，細(xì)胞凋亡率降低，IL-6含量降低，IL-10含量升高，呈劑量依賴(lài)性；IL-6是促炎細(xì)胞因子，IL-10是抑炎細(xì)胞因子，因此，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，白芍總苷可濃度依賴(lài)性的抑制肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)。

研究報(bào)道硫酸鈹誘導(dǎo)的人支氣管上皮細(xì)胞16HBE中miR-23b-5p表達(dá)下調(diào)[14]。miR-23b-3p調(diào)控脂蛋白(a)抑制同型半胱氨酸誘導(dǎo)的冠狀動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞中miR-23b-5p表達(dá)水平降低，過(guò)表達(dá)miR-23b-3p后，細(xì)胞活性升高，細(xì)胞凋亡率降低，IL-6含量降低，IL-10含量升高；表明過(guò)表達(dá)miR-23b-3p可抑制肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)。而且本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-23b-3p靶向調(diào)控FoxA1的表達(dá)。本研究報(bào)道脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷過(guò)程中FoxA1上調(diào)表達(dá)[16]。抑制FOXA1表達(dá)能減輕LPS誘導(dǎo)的人肺泡上皮細(xì)胞HPAEpiC凋亡并促進(jìn)其增殖[17]。沉默lncRNA H19通過(guò)調(diào)節(jié)miR-423-5p/FoxA1軸減輕肺損傷，炎癥和急性呼吸窘迫綜合征的纖維化[18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞中FoxA1蛋白表達(dá)水平升高。而過(guò)表達(dá)miR-23b-3p可降低FoxA1的表達(dá)。因此，表明miR-23b-3p可能通過(guò)調(diào)控FoxA1影響肺泡上皮細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，白芍總苷處理后，肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞中miR-23b-3p表達(dá)水平升高，F(xiàn)oxA1蛋白表達(dá)水平降低。而抑制miR-23b-3p可逆轉(zhuǎn)白芍總苷對(duì)肺炎鏈球菌誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡、活性和IL-6和IL-10含量的影響。

綜上所述，白芍總苷通過(guò)調(diào)控miR-23b-3p/FoxA1軸抑制肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞凋亡和炎癥。