楊尚儒，辛鎮(zhèn)忠，王 越，王 愈

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 太谷 030801）

蕎麥（Buckwheat），屬于蓼科（Polygonaceae）蕎麥屬（Fagopyrum）。主要有甜蕎（F. esculentum Moench）與苦蕎（F. tataricum）兩個(gè)栽培品種，在我國乃至世界范圍都有廣泛種植。甜蕎是一種常見的營養(yǎng)豐富的雜糧，其中的GABA對(duì)人體有著重要調(diào)控功能。在脊椎動(dòng)物體內(nèi)，GABA作為抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，可以降低神經(jīng)元活性，并與腦部抗焦慮受體結(jié)合，在其他物質(zhì)的協(xié)調(diào)作用下達(dá)到鎮(zhèn)靜神經(jīng)改善腦功能的作用[1]。國內(nèi)外多項(xiàng)研究表明：糙米、黑米等谷物、大豆、綠豆等豆類及苦蕎和大麥等麥類經(jīng)萌發(fā)后GABA含量會(huì)得到提升[2]。高立城等的研究表明，甜蕎經(jīng)萌發(fā)后氨基酸種類不發(fā)生變化，但部分氨基酸含量會(huì)上升；黃酮含量表現(xiàn)出先下降后上升的趨勢(shì)；蛋白質(zhì)含量呈現(xiàn)先上升后下降后又上升的趨勢(shì)；脂肪和淀粉表現(xiàn)出整體下降的趨勢(shì)[3]。種子萌發(fā)后生理活性增加，多種代謝途徑激活，與未經(jīng)萌發(fā)處理的種子相比，營養(yǎng)成分發(fā)生改變，包括GABA在內(nèi)的多種功能性成分含量提升，而部分抗?fàn)I養(yǎng)因子含量降低[4]。GAD是影響甜蕎萌發(fā)過程中GABA積累的主要酶，甜蕎經(jīng)萌發(fā)后生物活性提高、多種酶被激活，GAD催化甜蕎籽粒中的L-谷氨酸轉(zhuǎn)化為GABA；GABA經(jīng)過GABA-T的催化形成琥珀酸半醛（SSA）；SSA進(jìn)一步被SSADH催化形成琥珀酸并進(jìn)入三羧酸循環(huán)，這個(gè)流程被稱為GABA支路[5]。合適的萌發(fā)處理?xiàng)l件可以提高相關(guān)酶活性，從而影響到GABA支路，從而提高了甜蕎萌發(fā)過程中產(chǎn)生GABA的能力。

地球自身存在一定的電場(chǎng)，以大氣層為零電勢(shì)，地面平均電場(chǎng)強(qiáng)度為-130 V/m。地球的電場(chǎng)本身對(duì)生物的生長代謝有著一定影響。國內(nèi)外幾乎沒有關(guān)于使用高壓電場(chǎng)處理甜蕎促進(jìn)其萌發(fā)后GABA積累的研究，但是多項(xiàng)研究表明，外加高壓電場(chǎng)處理會(huì)影響到植物種子的萌發(fā)、生長等[6]。徐佳楠等發(fā)現(xiàn)通過高壓電場(chǎng)處理可以促進(jìn)菠菜新、陳種子萌發(fā)，并得到低場(chǎng)強(qiáng)處理效果不明顯、過高場(chǎng)強(qiáng)處理抑制菠菜種子萌發(fā)的結(jié)論[7]。高壓電場(chǎng)可以通過改變酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)，影響酶活性的高低，進(jìn)一步影響到植物的生理代謝[8]，王莘等使用高壓電場(chǎng)對(duì)月見草進(jìn)行處理，結(jié)果表明電場(chǎng)處理使過氧化物酶同工酶活性增強(qiáng)，對(duì)生物膜保護(hù)作用增強(qiáng)，并且可以促進(jìn)新蛋白合成和胚發(fā)育[9]。胡建芳等通過高壓電場(chǎng)處理高粱種子，結(jié)果表明適宜的電場(chǎng)處理可以提高高粱種子內(nèi)α-淀粉酶、SOD、POD的活性[10]。

在國內(nèi)，甜蕎主要是制粉后作為原料制作面條、小吃等，而且有了方便蕎麥面條、碗團(tuán)等可工廠化生產(chǎn)的產(chǎn)品，但是這類產(chǎn)品特點(diǎn)在于方便，在營養(yǎng)及功能性方面有著極大的提升空間。甜蕎經(jīng)短期萌發(fā)后便于制粉且營養(yǎng)性得到提高，通過試驗(yàn)中方法處理甜蕎使得其 GABA含量得到提升，以處理后的甜蕎為原料制得的產(chǎn)品在不影響原產(chǎn)品口感、外形等品質(zhì)的前提下具有更高的營養(yǎng)價(jià)值，可產(chǎn)生更多的經(jīng)濟(jì)效益，而且符合現(xiàn)代人的飲食理念。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

甜蕎：內(nèi)蒙古赤峰；GABA標(biāo)準(zhǔn)品：北京索萊寶科技有限公司；四硼酸鈉（分析純）：天津市北辰方正試劑廠；次氯酸鈉溶液（分析純）：天津市天力化學(xué)試劑有限公司；重蒸苯酚（分析純）：上海藍(lán)季科技有限公司；無水乙醇（分析純）：北京華騰化工有限公司；植物谷氨酸脫羧酶（GAD）ELISA試劑盒：江蘇晶美生物科技有限公司；植物GABA轉(zhuǎn)氨酶（GABA-T）ELISA試劑盒、植物琥珀酸半醛脫氫酶（SSADH）ELISA試劑盒：江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高壓直流電源（0 V～-30 KV）：天津市東文高壓電源廠；LDZ5-2型低速自動(dòng)平衡離心機(jī)：北京雷勃爾離心機(jī)有限公司；P4型分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司；LRHS-250-Ⅱ型恒溫恒濕培養(yǎng)箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；多功能粉碎機(jī)：北京科偉永興儀器有限公司；KQ-250DE型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；424R型冷凍離心機(jī)：德國 eppendorf公司；SpectraMax iD5-多功能酶標(biāo)儀：美谷分子儀器（上海）有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 甜蕎處理方式及指標(biāo)測(cè)定

挑選顆粒完整、大小均勻的甜蕎籽粒，之后清水淘洗，并加入約甜蕎籽粒二倍體積的自來水，并在預(yù)先設(shè)置的符合試驗(yàn)條件的溫度下浸泡數(shù)小時(shí)。甜蕎籽粒經(jīng)浸泡后吸水膨脹，更利于萌發(fā)。將浸泡過后的甜蕎籽粒用清水沖洗，洗去表面粘液與浮沫。沖洗過的甜蕎籽粒平鋪于塑料托盤并覆蓋上濕紗布以保證萌發(fā)過程中的水分。將盛有試驗(yàn)樣品的托盤放置于設(shè)好溫度與濕度的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中，設(shè)置溫度為 25 ℃，濕度為 80%。培養(yǎng)0、8、16、24、32、40 h后取出甜蕎樣品放置于-80 ℃冰箱待測(cè)。需干燥的樣品利用真空冷凍干燥機(jī)凍干，之后使用多功能粉碎機(jī)粉碎，粉碎時(shí)間為1 min，待粉碎機(jī)冷卻徹底后進(jìn)行下一批樣品粉碎，樣品粉末過80目篩。得到的樣品粉末用塑封袋密封、避光保存，以待測(cè)定。

GABA易溶于水，微溶于乙醇等有機(jī)溶劑，可利用蒸餾水對(duì)樣品粉末中的GABA進(jìn)行提取。稱取3 g樣品粉末，加水混勻后定容至30 mL。將制得的樣品混合溶液用蒸餾水在 35 ℃的條件下超聲波震蕩提取 30 min，之后利用離心機(jī)在5 000 r/min的條件下離心20 min，取甜蕎樣品提取液上清液備測(cè)。GABA與常規(guī)氨基酸在Berthelot反應(yīng)中的響應(yīng)差別巨大，利用Berthelot反應(yīng)進(jìn)行測(cè)定[11]。取300 μL甜蕎樣品提取液，加入0.1 mol/L四硼酸氫鈉緩沖液200 μL，6%重蒸苯酚400 μL，7.5%次氯酸鈉 600 μL。沸水浴 10 min，后冰浴5 min，期間不斷搖晃，最后加入60%乙醇2 mL。在波長645 nm處測(cè)量吸光度。

酶活性利用酶聯(lián)免疫試劑盒中相應(yīng)方法測(cè)定。

1.3.2 高壓電場(chǎng)搭建及處理方式

試驗(yàn)中采用的高壓電場(chǎng)由實(shí)驗(yàn)室自行搭建。高壓電場(chǎng)的電極板使用表明平整光潔的不銹鋼板并涂抹不銹鋼漆制成，極板長1.5 m、寬0.8 m，將極板平行放置于木質(zhì)的多層結(jié)構(gòu)。將其中一片極板與高壓直流電源相接，其臨近的極板與地線相接，當(dāng)電源接通后兩極板間形成一個(gè)高壓電場(chǎng)。高壓電場(chǎng)運(yùn)行工作時(shí)產(chǎn)生的高壓會(huì)對(duì)空氣有電離作用，并會(huì)產(chǎn)生臭氧，故高壓電場(chǎng)的工作環(huán)境要干燥且通風(fēng)良好。

經(jīng)浸泡處理后的甜蕎籽粒需及時(shí)進(jìn)行高壓電場(chǎng)處理，將浸泡吸漲后的甜蕎籽粒平鋪于托盤并覆蓋濕潤的紗布保證其濕度，托盤放置于電場(chǎng)的電極板之間，且盡量放于極板中間位置，減少邊界效應(yīng)的影響。之后接通電源，調(diào)整合適的輸出電壓，處理一段時(shí)間后關(guān)閉電源，將處理后的甜蕎轉(zhuǎn)入合適的培養(yǎng)環(huán)境。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)重復(fù) 3次，數(shù)據(jù)處理使用 IBM SPSS Statistics 23.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 高壓電場(chǎng)處理對(duì)甜蕎萌發(fā)后 GABA含量的影響

2.1.1 電場(chǎng)強(qiáng)度和方向?qū)ABA含量的影響

甜蕎籽粒在35 ℃條件下浸泡3 h，甜蕎籽粒為菱形，模擬實(shí)際生產(chǎn)，浸泡后的甜蕎自由散落后側(cè)躺于平面，電場(chǎng)方向垂直于地面。使用電場(chǎng)強(qiáng)度為 0，0.5，1.0，1.5 KV/cm 及-0.5，-1.0，-1.5 KV/cm的高壓電場(chǎng)分別處理30 min，經(jīng)電場(chǎng)處理后的甜蕎在溫度25 ℃，濕度80%的條件下培養(yǎng)24 h，以電場(chǎng)強(qiáng)度0 KV/cm處理組為空白對(duì)照組。試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。在相同電場(chǎng)強(qiáng)度下不同場(chǎng)強(qiáng)方向處理后的甜蕎中GABA含量差異不顯著（P＜0.05）。對(duì)照組GABA含量（171.68±0.45） mg/100 g，場(chǎng)強(qiáng)0.5 KV/cm處理組GABA含量（181.82±1.37） mg/100 g，場(chǎng)強(qiáng)1.0 KV/cm處理組GABA含量（190.18±1.37） mg/100 g，1.5 KV/cm 處理組 GABA 含量（192.12±0.52）mg/100 g。電場(chǎng)處理組與空白對(duì)照組相比GABA含量差異顯著（P＜0.05）；場(chǎng)強(qiáng)0.5 KV/cm處理組與場(chǎng)強(qiáng)1.0 KV/cm處理組差異顯著（P＜0.05）；場(chǎng)強(qiáng)1.0 KV/cm處理組與場(chǎng)強(qiáng)1.5 KV/cm處理組差異不顯著（P＜0.05）。試驗(yàn)結(jié)果表明：外加高壓電場(chǎng)可以顯著提高甜蕎萌發(fā)過程中產(chǎn)生 GABA的能力。在一定電場(chǎng)強(qiáng)度范圍內(nèi)，隨著場(chǎng)強(qiáng)的增加，甜蕎萌發(fā)后GABA含量越高，但是當(dāng)外加電場(chǎng)強(qiáng)度到達(dá)一定程度時(shí)（1.0 KV/cm～1.5 KV/cm）GABA的含量無顯著提升；試驗(yàn)還表明電場(chǎng)方向?qū)ψ杂缮⒙浜髠?cè)臥的甜蕎萌發(fā)過程中產(chǎn)生GABA的含量無顯著影響。

圖1 電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)萌發(fā)后甜蕎中GABA含量的影響Fig. 1 Effect of electric field intensity on GABA content in buckwheat after germination

2.1.2 電場(chǎng)處理時(shí)間對(duì)GABA含量的影響

甜蕎浸泡后在1.0 KV/cm的電場(chǎng)中處理不同時(shí)間，試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。在30～60 min處理組間甜蕎中 GABA含量差異不顯著（P<0.05）；15 min處理組與 60 min處理組差異顯著（P<0.05）。高壓電場(chǎng)處理時(shí)間30 min以上時(shí)，外加高壓電場(chǎng)處理的時(shí)間對(duì)甜蕎中GABA的含量無顯著影響。試驗(yàn)結(jié)果表明：甜蕎經(jīng) 1.0 KV/cm的電場(chǎng)處理30 min以上，其GABA含量得到顯著提升。

圖2 電場(chǎng)處理時(shí)間對(duì)萌發(fā)后甜蕎中GABA含量的影響Fig. 2 Effect of electric field treatment time on GABA contentin buckwheat after germination

2.1.3 電場(chǎng)處理后甜蕎萌發(fā)40 h內(nèi)GABA含量的變化

由試驗(yàn)2.1.1、2.1.2可知使用1.0 KV/cm高壓電場(chǎng)處理30 min，在節(jié)能的同時(shí)也能夠?qū)μ鹗w中GABA的富集達(dá)到最優(yōu)效果。在該條件下對(duì)浸泡后的蕎麥處理，同時(shí)設(shè)置未經(jīng)高壓電場(chǎng)處理的甜蕎為對(duì)照組，每隔8 h取樣一次，測(cè)定其40 h內(nèi)GABA含量變化，結(jié)果如圖3所示。甜蕎在萌發(fā)40 h內(nèi)其 GABA含量呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，且在24 h含量達(dá)到最高，此時(shí)未處理組甜蕎GABA含量為（184.38±0.46） mg/100 g，電場(chǎng)處理組中甜蕎 GABA 含量達(dá)到（195.49±0.81）mg/100 g。在甜蕎萌發(fā)16 h后，甜蕎中GABA含量顯著提高（P＜0.05），高壓電場(chǎng)處理組中GABA含量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。甜蕎萌發(fā) 24 h后GABA含量開始降低。

圖3 電場(chǎng)處理后甜蕎萌發(fā)40 h內(nèi)GABA含量的變化Fig. 3 Changes of GABA content in buckwheat after electric field treatment within 40 h of germination

2.2 電場(chǎng)處理對(duì)甜蕎 GABA合成相關(guān)酶類活性的影響

2.2.1 電場(chǎng)處理對(duì)甜蕎萌發(fā)過程中 GAD活性的影響

GAD可以促進(jìn)甜蕎萌發(fā)過程中 GABA的合成。使用1.0 KV/cm高壓電場(chǎng)處理甜蕎30 min，并對(duì)其萌發(fā)40 h內(nèi)GAD活性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖4所示。經(jīng)高壓電場(chǎng)處理后的甜蕎萌發(fā)40 h內(nèi)GAD 活性整體高于未處理組（P＜0.05）；甜蕎在浸泡后GAD有著較高活性，萌發(fā)初期GAD活性降低，之后不斷提高，在萌發(fā)24～32 h期間GAD活性較高，32 h后GAD活性降低。高壓電場(chǎng)處理對(duì)甜蕎中GAD活性影響主要表現(xiàn)在萌發(fā)初期，經(jīng)處理后甜蕎在萌發(fā)初期 GAD活性要明顯高于對(duì)照組；萌發(fā)40 h內(nèi)甜蕎中GAD活性也與甜蕎中GABA的含量表現(xiàn)出相關(guān)性。

圖4 電場(chǎng)處理對(duì)甜蕎萌發(fā)過程中GAD活性影響Fig. 4 Effect of electric field treatment on GAD activity during germination of buckwheat

2.2.2 電場(chǎng)處理對(duì)甜蕎萌發(fā)過程中GABA-T活性的影響

GABA-T促進(jìn)甜蕎中 GABA分解轉(zhuǎn)化為SSA。使用1.0 KV/cm高壓電場(chǎng)處理甜蕎30 min，并對(duì)其萌發(fā)40 h內(nèi)GABA-T活性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖5所示。對(duì)于高壓電場(chǎng)處理組，萌發(fā)0～16 h期間，處理組甜蕎中的GABA-T活性要顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），但是未對(duì)該階段甜蕎萌發(fā)過程中GABA的整體積累有降低作用，推測(cè)其活性變高是由于電場(chǎng)處理提高了萌發(fā)初期 GAD活性并促進(jìn)GABA的積累，大量GABA的產(chǎn)生刺激了相關(guān)代謝而促進(jìn)了GABA-T活性的提高；在萌發(fā)16 h后GABA-T活性急劇降低，并且在萌發(fā)24～40 h期間處理組中 GABA-T活性要顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），這利于甜蕎萌發(fā)中后期 GABA 的積累。對(duì)照組中GABA-T活性呈現(xiàn)出較為規(guī)律的先上升后降低的趨勢(shì)。

圖5 電場(chǎng)處理對(duì)甜蕎萌發(fā)過程中GABA-T活性影響Fig. 5 Effect of electric field treatment on GABA-T activity during germination of buckwheat

2.2.3 電場(chǎng)處理對(duì)甜蕎萌發(fā)過程中 SSADH活性的影響

SSADH是參與 GABA代謝支路最后環(huán)節(jié)的酶。使用1.0 KV/cm高壓電場(chǎng)處理甜蕎30 min，并對(duì)其萌發(fā)40 h內(nèi)SSADH活性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖6所示。高壓電場(chǎng)處理組甜蕎中SSADH活性整體低于對(duì)照組。在處理組中，8～16 h期間SSADH活性明顯提高，推測(cè)是由于在該階段GABA-T活性較高，大量生成的SSA使得SSADH活性提高來將 SSA轉(zhuǎn)化為琥珀酸，之后隨著GABA-T活性降低，SSA合成減少，SSADH活性降低；對(duì)照組中GABA-T在24～40 h期間保持較高活性，在此期間 SSADH活性要顯著高于處理組（P＜0.05）。

圖6 電場(chǎng)處理對(duì)甜蕎萌發(fā)過程中SSADH活性影響Fig. 6 Effect of electric field treatment on SSADH activity during buckwheat germination

2.3 分析討論

多項(xiàng)研究表明，外加高壓電場(chǎng)處理可以影響到植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)，促進(jìn)植物細(xì)胞受損結(jié)構(gòu)修復(fù)、增加細(xì)胞活性。外加高壓電場(chǎng)可以改變酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步影響到其活性。水分子團(tuán)處于一種大分子團(tuán)解締為小分子團(tuán)，小分子團(tuán)締結(jié)為大分子團(tuán)的過程，高壓電場(chǎng)極有可能打破這一平衡，活化了水分子團(tuán)，水作為生物體內(nèi)各種反應(yīng)的介質(zhì)，其性質(zhì)的改變會(huì)影響到相關(guān)酶促反應(yīng)的速率。此外，高壓電場(chǎng)會(huì)使水中產(chǎn)生過量超氧陰離子自由基，超氧陰離子自由基可以增加植物細(xì)胞膜通透性，除了增加籽粒對(duì)外界水、無機(jī)鹽、氧、氮等的吸收，還可以激活部分相關(guān)酶系的調(diào)控基因，加速種子萌發(fā)代謝[9]。本試驗(yàn)中，外加高壓電場(chǎng)處理組與未處理組相比，甜蕎經(jīng)萌發(fā)后GABA的含量顯著提升，證明合適條件的高壓電場(chǎng)處理可以提高甜蕎萌發(fā)過程中產(chǎn)生GABA的能力。試驗(yàn)中高壓電場(chǎng)對(duì)GABA代謝支路中的多種酶類產(chǎn)生影響，促進(jìn)了甜蕎萌發(fā)過程GABA的積累。郝建雄等的研究表明甜蕎在萌發(fā)2 d以內(nèi)其GAD活性較高，之后 GAD活性下降明顯[12]。部分研究表明通過 Ca2+或 H2O2等化學(xué)試劑脅迫及真空處理也可以促進(jìn)谷物中GABA或是其他營養(yǎng)成分的積累[13-14]。

3 結(jié)論

甜蕎萌發(fā)后GABA含量隨著電場(chǎng)處理時(shí)電場(chǎng)強(qiáng)度增加得到提升，但在場(chǎng)強(qiáng)到達(dá)一定強(qiáng)度（1.0～1.5 KV/cm）后無法繼續(xù)提高，且電場(chǎng)方向?qū)ψ杂缮⒙浜髠?cè)躺狀態(tài)的甜蕎中GABA含量無顯著影響（P＜0.05）；電場(chǎng)處理處理30～60 min間甜蕎 GABA 含量無顯著差異（P＜0.05）。由試驗(yàn)可得處理甜蕎的最佳條件為使用1.0 KV/cm高壓處理30 min。甜蕎浸泡處理后外加場(chǎng)強(qiáng)1.0 KV/cm的高壓電場(chǎng)處理30 min，之后在溫度25 ℃，濕度80%條件下萌發(fā)24 h。經(jīng)該方式處理后甜蕎中GABA含量達(dá)到（195.49±0.81） mg/100 g，對(duì)照組中甜蕎GABA含量達(dá)到（184.38±0.46） mg/100 g，差異顯著（P＜0.05）。

高壓電場(chǎng)處理會(huì)影響到甜蕎GABA代謝支路中酶的活性。電場(chǎng)處理后甜蕎萌發(fā)過程中 GAD的活性得到提高；GABA-T活性萌發(fā)前期得到提升，中后期顯著降低；電場(chǎng)處理對(duì) SSADH活性整體表現(xiàn)出抑制作用。萌發(fā)過程中甜蕎GABA含量與GAD活性表現(xiàn)出一定的相關(guān)性，證實(shí)GAD是影響甜蕎萌發(fā)過程中GABA積累的主要酶類，同時(shí)也表明高壓電場(chǎng)通過影響GABA支路相關(guān)酶類活性來達(dá)到對(duì)甜蕎萌發(fā)過程中GABA的富集。