連 倩，賈湃湃，肖 明,，崔明明，孫小鳳

（1. 青海大學 農牧學院，青海 西寧 810016；2. 青海大學 農林科學院農業(yè)農村部農產(chǎn)品質量安全風險評估實驗室（西寧），青海 西寧 810016）

真菌毒素是由真菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，廣泛存在于小麥、水稻等農產(chǎn)品中[1]。真菌毒素污染是全球性問題，大多數(shù)國家的谷物都受到不同程度的真菌毒素的污染[2]。在歐洲，2006—2007年，意大利的翁布里亞地區(qū)玉米中 DON含量最高達14.00 mg/kg[3]。奧地利玉米中DON的檢出率高達95%，其他谷類也有60%，70%的玉米同時也檢出了玉米赤霉烯酮[4]。在我國，2010年12個省份的215份玉米樣品中ZEN檢出率為69.30%[5]。青稞是一種高原特色顯著的健康食物資源[6]，它在青藏高原地區(qū)得到廣泛種植，是藏族人民的基本口糧。青稞質量安全不僅與青藏高原地區(qū)的農業(yè)發(fā)展息息相關，還直接影響到人民的身體健康[7]。此外青稞還具有高蛋白質、高可溶性纖維、高維生素和低脂肪、低糖的營養(yǎng)結構特點[8]，因此具有很高的食療價值[9]。因此，它的質量安全也受到廣泛的關注與重視。在所有影響青稞質量的安全因子中，真菌毒素是其中的一個主要因素。由于青稞在儲藏過程中時間較長，存儲不當將有可能導致青稞發(fā)霉變質，產(chǎn)生毒素。迄今發(fā)現(xiàn)超過400種真菌毒素[10]，主要有黃曲霉毒素（Aflatoxin，AFT）、玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON）及伏馬毒素等，這些毒素對人體具有致畸、致癌、致突變、降低免疫力和肝硬化等慢性毒性[11-12]。真菌毒素對糧食的污染不僅對人畜健康造成危害，而且有可能產(chǎn)生食品貿易糾紛。因此，真菌毒素在糧食中的污染問題受到世界各國和有關國際組織的高度重視。

本研究利用高效液相色譜串聯(lián)質譜的檢測方法，對青稞原糧中13種主要真菌毒素進行檢測，以初步探明青稞產(chǎn)品真菌毒素等高風險產(chǎn)區(qū)及監(jiān)管重點，為青稞的科學研究、促進生產(chǎn)、有效監(jiān)管提供數(shù)據(jù)支撐，也為我國居民安全消費提供參考借鑒。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

青稞樣品共 299份：分別從青海、四川、甘肅、西藏采集，如表1所示；

表1 樣品信息采集Table 1 Sample information collection 份

13種毒素標準品（純度＞99%），伏馬毒素B1（Fumonisin B1，F(xiàn)B1）、伏馬毒素 B2（Fumonisin B2，F(xiàn)B2）、伏馬毒素 B3（Fumonisin B3，F(xiàn)B3）、黃曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）、黃曲霉毒素B2（Aflatoxin B2，AFB2）、黃曲霉毒素 G1（Aflatoxin G1，AFG1）、黃曲霉毒素G2（Aflatoxin G2，AFG2）、3-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌稀醇（3-Acetyldeoxynivalenol，3-ADON）、15-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌稀醇（15-Acetyldeoxynivalenol、15-ADON）、DON、雪腐鐮刀菌烯醇（Nivaleno，NIV）、ZEN、T-2毒素（T-2 Toxin）：北京美正檢測技術有限公司；乙腈、甲酸為色譜純：上海安普實驗科技股份有限公司產(chǎn)品。

1.2 儀器與設備

LCMS-8050三重四極桿液質聯(lián)用儀：島津有限公司；FLBP-200萬能高速粉碎機：上海菲力博食品機械有限公司；VORTEX-5渦旋振蕩器：北京海天友誠科技有限公司；H1850R離心機：長沙高新技術產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)湘儀離心機儀器有限公司；DC-12氮吹儀：上海安譜實驗科技股份有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 真菌毒素標準溶液的配制

準確稱取1 mg（精確至0.01 mg）13種標準品分別置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，得到13種濃度為100 mg/L的真菌毒素標準儲備溶液，置于-20 ℃冰箱中避光保存，備用。實驗中使用的單個標準工作液，均由單個標準儲備液稀釋得到，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.2 樣品前處理

采集的青稞樣品，挑出其中的石塊、草根及其他植物殘體，用80目的篩子篩走樣品中殘帶的細泥沙，使用破壁機粉碎青稞，得到青稞均勻粉末，裝塑封袋貼標簽備用。量取5 mL乙酸，400 mL乙腈，100 mL水，混合配制成提取液。稱取2.00 g樣品于50 mL離心管內，加入10 mL提取液，在30 ℃下超聲10 min，期間不斷搖勻三次，渦旋振蕩5 min至充分混勻，在10 000 r/min離心5 min，取上清液0.5 mL至離心管中，氮吹干后加提取液0.5 mL，混勻，過0.22 μm濾膜于樣品瓶內，待上機。

1.3.3 色譜質譜條件

色譜條件：C18液相色譜柱（2.1 mm×100 mm,1.7 μm），流動相A: 1%乙酸和5 mmol/L 乙酸銨水溶液；流動相 B:甲醇，進樣量：2 μL，流速:0.3 mL/min，柱溫：35 ℃。

梯度洗脫程序：0～2 min，10.0% B；3～10.5 min，20%～60% B；13.5～18.0 min，60%～75% B，18.1～22.0 min，95%～10% B。質譜條件：電噴霧電離源（electrospray ionization，ESI）；霧化氣：氮氣（99.999%）；碰撞氣：氮氣（99.999%）；霧化氣壓力：40 psi；干燥器溫度：350 ℃；干燥器流量：10 L/min；毛細管電壓：4 000 V。

1.3.4 真菌毒素限量規(guī)定

限量標準參照相關[13-14]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

運用 Excel、SPSS 23. 0、Origin 2018 等軟件對數(shù)據(jù)進行數(shù)據(jù)處理分析。

2 結果與分析

2.1 青稞真菌毒素各地情況

全部樣品中真菌毒素均未超標，僅檢出T-2、ZEN兩種真菌毒素。T-2毒素是由多種真菌，主要是三線鐮刀菌產(chǎn)生的單端孢霉烯族化合物之一[15]。它在自然界中存在廣泛，是常見的污染田間作物和庫存谷物的主要毒素，對人、畜危害較大[16-18]。如表2所示，T-2毒素在所有樣品中檢出率為25.75%，在青海樣本中檢出率為49.26%，是甘肅地區(qū)檢出率的3倍；甘肅樣本中檢出T-2毒素檢出率為16.67%；四川樣本中，T-2毒素檢出率為13.89 %，最高含量為68 μg/kg；西藏樣本中未檢出 T-2毒素。研究表明 T-2毒素在變溫、高水分含量且溫度在3～7 ℃條件下最適宜生長[19]。青海地區(qū)樣本主要采集于門源縣，門源氣候濕潤、水量充足且青稞黑穗病發(fā)生普遍，因此檢出 T-2毒素頻率較高。ZEN只有在四川和西藏兩個地區(qū)檢出，檢出率四川地區(qū)為8.33%，最高含量為52 μg/kg；西藏地區(qū)檢出率較低，為3.09%。

表2 各地區(qū)青稞毒素含量Table 2 Content of highland barley toxin in different regions

2.2 各青稞品種毒素情況

北青8號、肚里黃、昆侖14號均檢出T-2毒素。黑青稞中兩種毒素均檢出，但含量均較低，抗逆性較強。T-2在青稞品種中分布情況如表3所示，T-2毒素在七種品種中均有檢出，其中北青8號檢出T-2毒素最多，肚里黃次之，昆侖14號中檢出較多，其中北青8號不抗倒伏，中抗條紋??；肚里黃較抗倒伏，抗病蟲害；昆侖14號抗倒伏性強，中抗條紋病及云紋病。青稞品種的抗倒伏性及抗病蟲害能力影響青稞籽粒毒素的生成。倒伏發(fā)生以后，部分葉片被壓倒或折損，無法獲得足夠的光照，影響葉片光合作用，嚴重時葉片會變黃甚至腐爛，如果土壤濕度大，倒伏后的植株更易滋生毒素。ZEN在青稞品種中分布情況如表4所示，ZEN毒素僅在藏青2000、當?shù)仄贩N及黑青稞三種青稞品種中檢出，ZEN毒素在各品種中檢出率均未超過2.40%。

表3 T-2在青稞品種中分布情況Table 3 T-2 distribution of highland barley varieties 份

表4 ZEN在青稞品種中分布情況Table 4 Distribution of ZEN in highland barley varieties 份

2.3 毒素在不同貯存條件中檢出情況

兩種毒素在不同貯存條件下檢出情況如表5所示，兩種毒素在農戶貯存中均有檢出，并且檢出率在農戶貯存條件下均高于在農場貯存條件下。T-2毒素在農戶中檢出率達33.16%，是在農場貯存中檢出率的3.71倍；ZEN僅在農戶貯存中檢出。統(tǒng)計分析顯示，T-2、ZEN在不同貯存條件下的檢出率具有顯著性差異（P＜0.05）。農場貯存青稞選擇聯(lián)合收割機統(tǒng)一收割，收割時間短，避免突遇陰雨天氣，而使成熟糧含水率增加。選擇糧倉儲存，溫度控制在10～15 ℃，相對濕度控制在65%以內，且通風條件較好；而青稞農戶貯存一般為人工收割，碾場脫粒，庭院晾曬，土樓庫存。中間籽粒暴露環(huán)節(jié)多，尤其庫房多年使用終年沒有陽光，相對陰潮，溫濕度得不到很好的控制，容易滋生真菌。

表5 兩種毒素在不同貯存條件下檢出情況Table 5 Detection of three toxins under different storage conditions

2.4 毒素在不同收獲方式下檢出情況

兩種毒素在不同收獲方式下檢出情況如表6所示，T-2在機械收獲條件下檢出率為 42.95%，ZEN僅在人工收獲方式下檢出，檢出率為3.50%。統(tǒng)計分析顯示，T-2、ZEN檢出率在不同收獲方式下具有顯著性差異（P＜0.05）。

表6 兩種毒素在不同收獲方式下檢出情況Table 6 Detection of three toxins under different harvest methods

3 結論

本研究在前期調研的基礎上，選取四川、青海、西藏和甘肅4 個青稞種植省份作為采樣點，采集了299份并分析13種真菌毒素的污染情況。結果顯示，T-2、ZEN在全部樣品中的檢出率分別為 25.75%、2.00%，但均未超標，由此說明 T-2毒素是主要污染物，且兩種毒素污染水平較低。青海主要受T-2毒素污染，檢出率為49.26%，高于其他 3個省份?？傮w來看，4個省份青稞受真菌毒素污染水平較低。真菌毒素產(chǎn)生受多種因素影響，本研究分析了不同地域、不同品種、不同貯存條件及不同收獲方式對真菌毒素產(chǎn)生的影響，研究顯示不同地域，由于氣候條件不一，水量充足且溫濕度較高的地區(qū)受毒素污染嚴重；抗倒伏、抗病蟲害的品種不易受毒素污染；農戶貯存條件下，由于儲藏條件不科學，儲藏室陰暗潮濕，毒素檢出較多；機械收獲對青稞籽粒造成的損傷高于人工收獲，因此 T-2毒素檢出較高。為減輕毒素污染，應采取合理的措施進行防控，可選擇抗性強青稞品種，合理灌溉，控制濕度，植株成熟后盡快收獲并晾曬，盡量在通風良好的條件下儲存。在后續(xù)研究中，還可繼續(xù)擴大樣本量，監(jiān)測其他影響因素，如氣候條件、土壤類型、溫濕度等。目前糧食真菌毒素已引起廣泛關注，國家有關部門對此高度重視，采取有效措施，妥善處理被真菌毒素污染的超標糧食，確保不用做食用用途，保障廣大人民群眾“舌尖上的安全”。