王曉艷，李 翔，肖 翔，陸德生，張仕華，杜彥丹

內(nèi)蒙古林業(yè)總醫(yī)院/內(nèi)蒙古民族大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼倫貝爾 021000

森林腦炎是一種由蜱傳森林腦炎病毒引起的發(fā)熱性疾病，嚴(yán)重時(shí)會(huì)對(duì)中樞神經(jīng)造成一定程度損傷[1]。森林腦炎主要流行于歐洲及亞洲東北部林區(qū)，近年來(lái)隨著生態(tài)旅游業(yè)的發(fā)展，感染人群范圍持續(xù)擴(kuò)大，嚴(yán)重影響人民健康及經(jīng)濟(jì)發(fā)展[2]。森林腦炎是一種自抑性疾病，機(jī)體主要憑借自身抗炎作用進(jìn)行自我修復(fù)，目前仍無(wú)特效治愈方式[1,3]，且病毒入侵機(jī)體產(chǎn)生的促炎及抗炎作用機(jī)制還未被揭示。代謝組學(xué)憑借高通量技術(shù)和先進(jìn)的數(shù)據(jù)分析方法，捕捉生物體內(nèi)代謝通路變化，從而系統(tǒng)揭示機(jī)體的整個(gè)代謝變化，在系統(tǒng)科學(xué)中占據(jù)舉足輕重的位置[4-7]。筆者前期基于流式細(xì)胞技術(shù)分析了病毒侵染后機(jī)體與細(xì)胞免疫因子的相關(guān)性，為尋找與疾病病程相關(guān)的靶向標(biāo)志物，筆者對(duì)森林腦炎患者和健康人群進(jìn)行了代謝組學(xué)檢測(cè)，并結(jié)合多元分析以闡釋疾病發(fā)病機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 50例森林腦炎患者(森林腦炎組)為呼倫貝爾牙克石市附近居民，有蜱蟲(chóng)叮咬史，且出現(xiàn)發(fā)熱、四肢疼痛等癥狀，經(jīng)血清學(xué)檢測(cè)，神經(jīng)內(nèi)科專(zhuān)家鑒定為森林腦炎。森林腦炎組中男39例，女11例；年齡25～68歲；IgG或IgM抗體呈陽(yáng)性。健康對(duì)照組為內(nèi)蒙古林業(yè)總醫(yī)院職工體檢健康者39例，其中男19例，女20例；年齡22～59歲；IgG或IgM抗體呈陰性。所有受試者均簽署了知情同意書(shū)。

森林腦炎組納入標(biāo)準(zhǔn)：符合《職業(yè)性森林腦炎診斷標(biāo)準(zhǔn)》[8]；外周血清特異性抗體IgM或IgG呈陽(yáng)性，且IgM或IgG≥1∶20；年齡18～70歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：近期有疫苗接種史；妊娠期、哺乳期。健康對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)：特異性抗體IgM或IgG呈陰性。排除標(biāo)準(zhǔn)：有蜱蟲(chóng)叮咬史及森林腦炎疫苗接種史；患有其他疾病。

1.2儀器與試劑 LC-30AD液相色譜儀，日本島津公司；Triple TOF 5600質(zhì)譜檢測(cè)器，美國(guó)AB Sciex 公司。甲醇(MEOH)、乙腈(ACN)試劑均為Optimal MS級(jí)別，美國(guó)Fisher Chemical公司生產(chǎn)；超純水為屈臣氏超純水；醋酸銨(純度≥98%)、氨水(純度28%～30%)購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1標(biāo)本前處理 取血清標(biāo)本300 μL，加入900 μL提取液[ACN∶H2O=4∶1(V/V)]，旋渦混勻30 s，-20 ℃靜置1 h后于4 ℃，12 000 r/min離心15 min；小心取出600 μL上清液，等體積加入至兩個(gè)獨(dú)立的EP管中并在真空濃縮儀中干燥提取物；向干燥后的代謝物中加入200 μL提取液(提取液為初始梯度的流動(dòng)相)，旋渦30 s。將標(biāo)本于4 ℃、12 000 r/min離心15 min，小心取出75 μL上清液于2 mL進(jìn)樣瓶上機(jī)檢測(cè)。等體積血清標(biāo)本各3 μL，標(biāo)本混合后為質(zhì)量控制樣(QC)。QC標(biāo)本隨機(jī)穿插在標(biāo)本序列中多次進(jìn)樣，以監(jiān)測(cè)儀器與方法的穩(wěn)定性。

1.3.2檢測(cè)分析 為了全面覆蓋標(biāo)本信息，采用非極性色譜柱及極性色譜柱進(jìn)行生物標(biāo)本的分離。針對(duì)中等極性及弱極性小分子化合物：色譜柱采用Acquity HSS T3 Column(以下簡(jiǎn)稱(chēng)T3色譜柱，1.8 μm,2.1 ×100 mm)，美國(guó)Waters公司；梯度洗脫采用流動(dòng)相A：H2O(0.1% FA)；B：MEOH∶ACN=1∶1(V/V)。流速為0.3 mL/min；進(jìn)樣量為5 μL；柱溫為40 ℃。梯度洗脫程序信息見(jiàn)表1，質(zhì)譜相關(guān)參數(shù)信息見(jiàn)表2。

表1 梯度洗脫程序詳細(xì)參數(shù)

表2 質(zhì)譜詳細(xì)參數(shù)

針對(duì)強(qiáng)極性小分子代謝物：色譜柱采用Acquity UPLC BEH Amide Column(以下簡(jiǎn)稱(chēng)BEH Amide色譜柱，3 μm,2.1 mm×100.0 mm)，美國(guó)Waters公司；梯度洗脫采用流動(dòng)相A：H2O(25 mmol/L CH3COONH4+25 mmol/L NH4OH)；B：ACN。流速為0.3 mL/min；進(jìn)樣量為5 μL；柱溫為40 ℃。梯度洗脫程序信息見(jiàn)表1，質(zhì)譜相關(guān)參數(shù)信息見(jiàn)表2。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 質(zhì)譜采集到的UPLC-QTOF-MS圖譜采用Analyst Software(美國(guó)AB Sciex公司)導(dǎo)出原始數(shù)據(jù)，通過(guò)基峰離子流色譜圖(BPC)及總離子流色譜圖(TIC)等判斷數(shù)據(jù)及平臺(tái)的可靠性。隨后利用XCMS plus及Markerview對(duì)采集到的潛在標(biāo)志物進(jìn)行定性及定量分析。將包含質(zhì)荷比-保留時(shí)間、標(biāo)本信息與峰面積三維數(shù)據(jù)進(jìn)行校正后，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入網(wǎng)絡(luò)版MetaboAnalyst (https://www.metaboanalyst.ca/)進(jìn)行數(shù)據(jù)的歸一化、去除同位素等處理，并進(jìn)行主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘判別分析(OPLS)等多元統(tǒng)計(jì)分析，篩選潛在標(biāo)志物，并歸屬相應(yīng)代謝通路，以尋求代謝通路變化與疾病之間的相關(guān)性。

PCA屬無(wú)師監(jiān)督法，該處理法則主要是對(duì)標(biāo)本信息進(jìn)行降維處理，能夠?qū)崿F(xiàn)標(biāo)本分組的可視化分析，且不會(huì)造成重要信息的丟失，并對(duì)于建模的情況進(jìn)行評(píng)估[9]。PCA模型的建立主要用于評(píng)估實(shí)驗(yàn)建模的成功與否，其主要依據(jù)于QC標(biāo)本的聚集程度，QC標(biāo)本隨機(jī)穿插在進(jìn)樣序列中，QC標(biāo)本的聚攏程度可反映平臺(tái)的可靠性及實(shí)驗(yàn)方法的重復(fù)性。OPLS主要依據(jù)多元統(tǒng)計(jì)變量VIP值、單變量P值及差異倍數(shù)值(FC)法則，對(duì)于標(biāo)本之間的代謝物進(jìn)行篩選挖掘[10]。篩選到的潛在標(biāo)志物依據(jù)同位素模型分布原則、元素組成分析原則，縮小目標(biāo)化合物范圍，在標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)如京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(KEGG)、人類(lèi)代謝組數(shù)據(jù)庫(kù)(HMDB)進(jìn)行進(jìn)一步篩選，依據(jù)實(shí)際譜圖與標(biāo)準(zhǔn)譜圖的對(duì)比匹配系數(shù)，進(jìn)一步確定物質(zhì)屬性。對(duì)于獲得的潛在標(biāo)志物進(jìn)行代謝通路富集分析，建立通路變化與生物背景之間的紐帶，解釋其生物學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1BPC結(jié)果 血清標(biāo)本正離子模式下基于T3色譜柱的圖譜見(jiàn)圖1。從圖中可以看出，色譜峰的峰型良好，進(jìn)一步證實(shí)檢測(cè)平臺(tái)的可靠性。經(jīng)80%去零規(guī)則消除缺失值，基于T3色譜柱正離子模式共鑒定到166個(gè)代謝物，BEH Amide色譜柱正負(fù)離子模式下分別得到181、182個(gè)代謝物，3種模式下，去掉重復(fù)信號(hào)，共得到410個(gè)代謝物。

圖1 森林腦炎組血清標(biāo)本正離子模式下基于T3色譜柱的基峰離子流色譜圖

2.2PCA結(jié)果 從圖2可以看出，基于T3色譜柱及BEH Amide色譜柱，QC標(biāo)本的聚集度均良好，表明建模的可靠性。

注：H為健康對(duì)照組；QC為質(zhì)控組；T為森林腦炎組；A為T(mén)3色譜柱正離子模式下PCA圖，組成分PC1=67.2%，PC2=3.8%；B為BEH Amide色譜柱正離子模式下PCA圖，組成分PC1=55.6%，PC2=9.1%；C為BEH Amide色譜柱負(fù)離子模式下PCA圖，組成分PC1=21.1%，PC2=11.9%。

2.3差異代謝物提取和解析 基于UPLC-QTOF-MS血清代謝組學(xué)技術(shù)，在森林腦炎組和健康對(duì)照組中可鑒定到410個(gè)代謝物，這些物質(zhì)同時(shí)經(jīng)二級(jí)譜庫(kù)精確鑒定。利用XCMS plus及METLIN對(duì)生物學(xué)標(biāo)志物進(jìn)行篩選，MetDNA進(jìn)行物質(zhì)鑒定，實(shí)現(xiàn)了擬靶向分析。其中144個(gè)代謝物在兩組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，VIP>1，F(xiàn)C>1.0)，所涵蓋的差異代謝物中，氨基酸水平整體呈下降趨勢(shì)，且脂肪酸水平同樣表現(xiàn)為下降趨勢(shì)。通過(guò)代謝通路富集分析，差異代謝物主要涵蓋了氨基酸、脂肪酸、花生四烯酸、白三烯等物質(zhì)，所富集代謝通路主要為氨基酸代謝通路及與脂類(lèi)代謝密切相關(guān)的代謝通路(包括脂蛋白生物合成、脂肪酸合成、花生四烯酸生物合成、白三烯生物合成等)。兩組間主要差異代謝物見(jiàn)表3。

表3 健康對(duì)照組與森林腦炎組的主要差異代謝物

續(xù)表3 健康對(duì)照組與森林腦炎組的主要差異代謝物

3 討 論

本研究結(jié)果表明，差異代謝物主要集中于氨基酸、脂肪酸、花生四烯酸、白三烯等物質(zhì)，所富集代謝通路主要為氨基酸代謝通路，另外也發(fā)現(xiàn)了與脂類(lèi)代謝密切相關(guān)的代謝通路，包括脂蛋白生物合成、脂肪酸合成、花生四烯酸生物合成、白三烯生物合成。脂肪酸合成、花生四烯酸合成、白三烯生物合成通路代謝紊亂與機(jī)體對(duì)病毒入侵所做出的免疫反應(yīng)有著直接聯(lián)系[11]。氨基酸水平整體呈下降趨勢(shì)，這與大量病毒的入侵有關(guān)，病毒在機(jī)體內(nèi)大量繁殖，需借助機(jī)體內(nèi)氨基酸作為基底物質(zhì)維持其生長(zhǎng)，供自身細(xì)胞蛋白合成代謝所需[12]。同時(shí)，本研究監(jiān)測(cè)到脂肪酸水平呈下降趨勢(shì)，這主要與宿主機(jī)體的機(jī)能有關(guān)，病毒在機(jī)體的復(fù)制、繁殖都需要能量供應(yīng)，導(dǎo)致脂肪酸水平的降低。另外，脂質(zhì)是細(xì)胞膜的主要組成成分，細(xì)胞膜的正常運(yùn)行能夠保證細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的相對(duì)穩(wěn)定，使各種生化反應(yīng)能夠有序運(yùn)行。病毒的入侵?jǐn)_亂了機(jī)體的正常代謝，細(xì)胞做出相應(yīng)的應(yīng)激反應(yīng)，細(xì)胞膜流動(dòng)性發(fā)生了改變，從而導(dǎo)致脂類(lèi)代謝紊亂[13]。

內(nèi)源性花生四烯酸的產(chǎn)生主要是通過(guò)細(xì)胞膜磷脂的釋放來(lái)實(shí)現(xiàn)的。這一過(guò)程由磷脂酶A2家族酶催化，并由多種細(xì)胞激活信號(hào)誘導(dǎo)，包括炎癥或感染驅(qū)動(dòng)的腫瘤壞死因子受體和Toll樣受體4的刺激[14]?；ㄉ南┧岬拇x對(duì)于人體健康和組織穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)具有重要意義。花生四烯酸參與調(diào)節(jié)細(xì)胞膜靈活性和流動(dòng)性，在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中作為脂質(zhì)第二信使，誘導(dǎo)血管舒張及炎癥介質(zhì)產(chǎn)生，參與病毒入侵過(guò)程機(jī)體出現(xiàn)的炎性反應(yīng)[15-16]。

病毒的復(fù)制依賴(lài)于宿主的代謝機(jī)制和必要的細(xì)胞因子。氨基酸在所有病毒相關(guān)感染的發(fā)病機(jī)制中都發(fā)揮著重要作用，它們既是蛋白質(zhì)合成的基底物，又是許多代謝途徑的調(diào)節(jié)因子[17-18]。有研究發(fā)現(xiàn)，氨基酸的代謝與慢性肝病存在緊密聯(lián)系，其中支鏈脂肪酸如纈氨酸、亮氨酸及異亮氨酸等水平在患病組中呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，這可能與丙型肝炎病毒侵染組織并在組織中大量繁殖有關(guān)[19]?；ㄉ南┧峒捌溲苌锬軌騾⑴c多種代謝途徑，將免疫與脂質(zhì)代謝聯(lián)系起來(lái)，蜱蟲(chóng)叮咬人體后，機(jī)體會(huì)發(fā)生復(fù)雜的免疫應(yīng)答以抵御病毒入侵，患者常會(huì)出現(xiàn)相應(yīng)的炎性反應(yīng)。急性炎性反應(yīng)一般包含起始階段和消退階段，臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、腫脹、疼痛和最終功能喪失等。炎癥的起始和消退主要由某些化學(xué)物質(zhì)控制，包括蛋白質(zhì)、肽和脂類(lèi)物質(zhì)(脂類(lèi)主要包括白三烯和前列腺素等物質(zhì))[20]，森林腦炎患者體內(nèi)花生四烯酸等脂類(lèi)物質(zhì)發(fā)生明顯變化，證實(shí)了這一觀(guān)點(diǎn)。

代謝組學(xué)作為基因組學(xué)、蛋白組學(xué)的下游研究技術(shù)，與表征、現(xiàn)象之間的聯(lián)系更加緊密。病毒侵染機(jī)體后，會(huì)在體內(nèi)進(jìn)行侵染-復(fù)制整個(gè)過(guò)程，機(jī)體則會(huì)呈現(xiàn)促炎-抗炎等炎性反應(yīng)。目前關(guān)于森林腦炎的代謝過(guò)程及機(jī)制還未被完全解讀，本研究基于代謝組學(xué)技術(shù)深入剖析森林腦炎的整個(gè)機(jī)制，將機(jī)體炎性反應(yīng)與代謝特征聯(lián)系起來(lái)，系統(tǒng)挖掘代謝機(jī)制，為疾病的診斷及預(yù)后提供了基礎(chǔ)依據(jù)，為后續(xù)研究打下了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。