謝貞蘭,邢益祥,李 佳,袁小慶,趙 鐵

安徽省銅陵市人民醫(yī)院病理科,安徽銅陵 244009

胃癌在惡性腫瘤中病死率居第2位，多數病死患者合并腫瘤轉移[1]。部分胃癌患者早期即可發(fā)生淋巴結轉移，但有關淋巴結轉移的分子及生物學機制尚未明確。既往研究證實，淋巴結轉移與腫瘤分化程度、浸潤深度等病理特征有關，胃癌組織病理學檢查可用于評估胃癌患者淋巴結轉移風險[2]。但僅通過腫瘤分化程度、浸潤深度評估淋巴結轉移風險仍有一定誤診率，還需結合其他手段進一步確診淋巴結轉移，包括影像學檢查、內鏡檢查、病理學檢查等[3-4]。在胃癌患者中，胃癌組織中相關因子表達水平已被作為淋巴結轉移的輔助診斷手段，但目前已發(fā)現的相關分子標志物仍較少，需持續(xù)探討新的分子標志物[5]。研究指出，上皮間質轉化(EMT)相關蛋白參與上皮-間質-上皮轉化過程，與腫瘤細胞黏附連接丟失相關，可增強腫瘤細胞轉移能力[6]。轉化生長因子(TGF)-β1可調節(jié)細胞增殖、分化，也可影響腫瘤細胞轉移[7]。推測二者均與腫瘤患者淋巴結轉移有關，但目前有關二者在胃癌組織中的表達及與胃癌患者淋巴結轉移的關系尚無較多研究報道?；诖耍狙芯坑^察胃癌患者組織中EMT相關蛋白、TGF-β1 mRNA相對表達水平與淋巴結轉移的相關性，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性分析本院2016年1月至2020年11月收治的51例胃癌合并淋巴結轉移患者的資料，納入淋巴結轉移組，回顧性分析本院同期收治的51例胃癌未合并淋巴結轉移患者的資料，納入無淋巴結轉移組。納入標準：(1)符合《胃癌規(guī)范化診療指南(試行)》[8]；(2)經病理學檢查確診，胃癌組織學類型均為腺癌；(3)臨床資料及病理資料均完整。排除標準：(1)合并胃潰瘍；(2)合并其他部位原發(fā)腫瘤；(3)合并腎間質、肝、肺纖維化；(4)合并脾功能亢進；(5)合并糖尿病；(6)合并高尿酸血癥；(7)合并心血管疾?。?8)合并哮喘。本研究的設計符合倫理學有關規(guī)定，經本院醫(yī)學倫理委員會審核并批準。

1.2方法

1.2.1收集基線資料 回顧性分析患者入院時基線資料，詳細記錄本研究所需資料，包括年齡、性別、腫瘤最大徑、發(fā)病部位、病程、腫瘤分化程度、TNM分期[9]、脈管內癌栓，其中腫瘤最大徑、發(fā)病部位、腫瘤分化程度、TNM分期、脈管內癌栓均根據手術結果及手術標本病理學檢查結果評估。

1.2.2EMT相關蛋白檢測 取手術標本進行EMT相關蛋白檢測，EMT相關蛋白包括E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、β-鏈蛋白(β-catenin)等，選取E-cadherin、Vimentin、β-catenin進行評估。試劑盒均由南京凱基生物技術發(fā)展有限公司提供。將組織剪碎后充分研磨，采用全蛋白提取試劑盒提取蛋白，采用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術分離蛋白質，將蛋白質轉移至聚偏二氟乙烯膜上。用5%脫脂奶粉37 ℃封閉1 h，TBST洗滌3次(每次5 min)，加入稀釋兔抗人E-cadherin、Vimentin、β-catenin單克隆抗體[賽默飛世爾(中國)有限公司]，4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3次(每次5 min)，加入辣根過氧化物酶標記山羊抗兔抗體[賽默飛世爾(中國)有限公司]，室溫下反應1 h，TBST洗滌3次(每次5 min)。采用增強化學發(fā)光試劑盒對組織進行增強化學發(fā)光，反應體系嚴格按照說明書進行。采用以色列DNR公司Micro Chemi型化學發(fā)光凝膠成像系統觀察、拍照。采用Quantity One軟件分析蛋白條帶，計算吸光度(A)值，以檢測A值/內參照磷酸甘油醛脫氧酶A值作為EMT相關蛋白相對表達水平。

1.2.3TGF-β1 mRNA相對表達水平檢測 取手術標本進行TGF-β1 mRNA相對表達水平檢測，試劑盒均由上海研生生化試劑有限公司提供。碾碎組織，加入裂解液，采用總RNA試劑盒提取RNA，操作按照試劑盒說明書進行。提取RNA后，檢測純度，通過紫外分光光度法檢測A值，波長取260和280 nm，滿足A260/A280>1.80為合格。取1 μL RNA，采用反轉錄試劑盒進行反轉錄。采用熒光定量試劑盒對TGF-β1 mRNA相對表達水平進行定量檢測，探針由美國Bioserch-MC公司合成，探針序列為5′-FAM-CGG ACC TTG TG-CAA CTC TCC ACC TCC-TAMRA-3′，反應體系嚴格按照說明書進行，檢測方法為實時熒光定量PCR，采用2-ΔΔCt方法計算TGF-β1 mRNA相對表達水平。

1.2.4相關性評估 記錄經手術標本病理學檢查結果確診患者淋巴結轉移情況。采用回歸分析檢驗患者腫瘤分化程度、TNM分期、脈管內癌栓、EMT相關蛋白、TGF-β1 mRNA相對表達水平與淋巴結轉移的關系，并分析患者胃癌組織中EMT相關蛋白、TGF-β1 mRNA相對表達水平對淋巴結轉移的預測效能。

2 結 果

2.1淋巴結轉移組和無淋巴結轉移組基線資料比較 淋巴結轉移組不同腫瘤分化程度、TNM分期、脈管內癌栓的患者例數與無淋巴結轉移組比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；淋巴結轉移組E-cadherin相對表達水平低于無淋巴結轉移組，Vimentin、β-catenin及TGF-β1 mRNA相對表達水平高于無淋巴結轉移組(P<0.05)；兩組年齡、性別、腫瘤最大徑、發(fā)病部位、病程比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 淋巴結轉移組和無淋巴結轉移組基線資料比較

2.2回歸分析檢驗患者各主要指標或變量與淋巴結轉移的關系 將初步基線資料比較結果顯示差異有統計學意義的腫瘤分化程度、TNM分期、脈管內癌栓、E-cadherin、Vimentin、β-catenin及TGF-β1 mRNA相對表達水平作為自變量并說明，見表2，將淋巴結轉移情況作為因變量(1=淋巴結轉移，0=無淋巴結轉移)，經回歸分析檢驗結果顯示，胃癌患者腫瘤分化情況、病理分期、脈管內癌栓情況、胃癌組織內E-cadherin相對表達水平、Vimentin、β-catenin及TGF-β1 mRNA相對表達水平均與患者淋巴結轉移有關(P<0.05)；腫瘤低分化，TNM分期Ⅲ～Ⅳ期，有脈管內癌栓，胃癌組織中Vimentin、β-catenin及TGF-β1 mRNA相對表達水平升高均是淋巴結轉移的風險因子(OR>1，P<0.05)；胃癌組織中E-cadherin相對表達水平升高是淋巴結轉移的保護因子(OR<1,P<0.05)。見表3。

表2 自變量賦值情況

表3 回歸分析檢驗患者腫瘤分化程度、TNM分期、脈管內癌栓、胃癌組織中EMT相關蛋白、TGF-β1 mRNA相對表達水平與淋巴結轉移的關系

2.3胃癌組織中EMT相關蛋白、TGF-β1 mRNA相對表達水平預測淋巴結轉移風險的ROC曲線分析結果 胃癌組織中E-cadherin、Vimentin、β-catenin、TGF-β1 mRNA相對表達水平用于預測淋巴結轉移的AUC分別為0.863、0.833、0.831、0.838，AUC均>0.800，均有一定預測效能；最佳截斷值分別取0.555、0.565、0.515、0.865時可以獲得最佳預測效能，見表4、圖1。

表4 胃癌組織中EMT相關蛋白、TGF-β1 mRNA相對表達水平預測淋巴結轉移的效能比較

圖1 胃癌組織中EMT相關蛋白、TGF-β1 mRNA相對表達水平預測淋巴結轉移的ROC曲線圖

3 討 論

胃癌淋巴結轉移是一個復雜的過程，涉及多步驟，包括腫瘤細胞惡變、侵襲、浸潤等?；颊叱霈F淋巴結轉移后，行手術及放化療的難度增加，治療后患者仍有較高的復發(fā)及轉移風險，且短期生存情況不理想[10]。因此，及時預測、診斷淋巴結轉移，并實施針對性治療尤為必要。

有研究指出，胃癌患者腫瘤分化程度、臨床分期、脈管內癌栓等病理特征均與淋巴結轉移相關[11-12]。本研究初步比較發(fā)生與未發(fā)生淋巴結轉移患者的資料后行Logistic回歸分析結果顯示，胃癌患者腫瘤低分化，TNM分期Ⅲ～Ⅳ期，有脈管內癌栓，胃癌組織中E-cadherin相對表達水平降低，Vimentin、β-catenin及TGF-β1 mRNA相對表達水平升高均與患者淋巴結轉移有關，可能是胃癌患者淋巴結轉移的風險因子。說明除病理特征外，胃癌組織中EMT相關蛋白、TGF-β1 mRNA相對表達水平也與淋巴結轉移密切相關，胃癌患者若Vimentin、β-catenin及TGF-β1 mRNA相對表達水平升高可能提示淋巴結轉移高風險。既往臨床常采用腫瘤分化程度、TNM分期、脈管內癌栓評估淋巴結轉移風險[13-16]。腫瘤分化程度可反饋癌細胞與其起源細胞的結構差異，分化程度越低的患者，腫瘤惡性程度越高，侵襲及浸潤風險高，易累及淋巴結[13]。TNM分期可反饋腫瘤侵襲程度，分期Ⅲ～Ⅳ期患者的腫瘤侵襲程度較高，可侵襲黏膜下層，黏膜下層有豐富淋巴管及毛細血管，腫瘤可隨淋巴管及毛細血管轉移至淋巴結[14]。脈管內癌栓被作為多種腫瘤淋巴結轉移的獨立危險因素，存在脈管內癌栓的胃癌患者，胃壁淋巴管網受癌細胞侵犯，易發(fā)生淋巴結轉移[15-16]。但上述特征仍難以準確反饋患者淋巴結轉移情況，還可在此基礎上結合淋巴結轉移可能的風險因子，作為輔助預測與診斷的手段。

EMT是腫瘤轉移重要機制之一，表現為腫瘤上皮細胞受細胞外因子刺激后，失去極性，轉化為間質細胞，遷移和運動能力增強，因此腫瘤易發(fā)生轉移[17]。EMT相關蛋白中，E-cadherin在胃癌患者中呈表達降低，主要原因在于胃癌發(fā)病后，黏附分子及基因表達改變，啟動子胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤基序島區(qū)過度甲基化，活性氧化物、TGF-β、凋亡信號傳導途徑基因升高，造成E-cadherin失活。而E-cadherin具有維持細胞和細胞間連接的作用，若E-cadherin表達降低，可使腫瘤細胞間黏附作用降低或喪失，腫瘤細胞易從原發(fā)灶脫落分離，轉移到局部淋巴結，最終造成淋巴結轉移[18]。Vimentin具有多種功能，其表達升高時可降低細胞表面E-cadherin水平，抑制E-cadherin促進細胞黏附作用，加速腫瘤從原發(fā)病灶處脫落[19]。此外，Vimentin表達升高可激活C-src原癌基因，C-src可進一步使限速酶己糖激酶磷酸化，為腫瘤細胞提供充足能量，為腫瘤轉移提供有利條件，因此，腫瘤發(fā)生淋巴結轉移的風險較高。而β-catenin則能與E-cadherin共同作用，形成復合物，發(fā)揮穩(wěn)定E-cadherin結構、促進腫瘤細胞黏附的作用。當β-catenin表達升高時，復合物形成出現異常，腫瘤細胞難以緊密黏附，因此更易發(fā)生轉移[20]。此外，β-catenin表達升高時，可影響β-catenin/TCF信號途徑，促進細胞外基質蛋白表達，造成腫瘤細胞過度增殖，淋巴結轉移風險高。TGF-β1 mRNA表達升高可反饋為腫瘤細胞中TGF-β1功能增強。TGF-β1是重要組織修復因子，具有調節(jié)細胞增殖、分化的功能。在胃癌患者中，TGF-β1可抑制免疫細胞，促使腫瘤發(fā)生免疫逃逸。此外，TGF-β1還可通過升高LMO1基因表達，促進腫瘤細胞發(fā)生EMT改變，并可促進血管內皮生長因子表達，誘導腫瘤血管生成，從而增加腫瘤侵襲、轉移能力，導致淋巴結轉移風險增加[21]。

結合回歸分析結果與各項主要指標增加淋巴結轉移風險的機制，推測胃癌患者組織中EMT相關蛋白、TGF-β1 mRNA相對表達水平對淋巴結轉移有一定預測甚至診斷效能。繪制ROC曲線發(fā)現，胃癌組織中E-cadherin、Vimentin、β-catenin、TGF-β1 mRNA相對表達水平用于預測淋巴結轉移的AUC均>0.800，均有一定預測效能，證實推測成立。臨床可結合患者病理特征與胃癌組織EMT相關蛋白、TGF-β1 mRNA相對表達水平，預測患者淋巴結轉移風險，若淋巴結轉移風險較高，可于根治術中實施淋巴結清掃，并于術后實施強化放化療，以預防腫瘤復發(fā)及轉移。但因本研究未能探討癌胚抗原、糖類抗原125、糖類抗原199等血清腫瘤標志物水平，結論尚有局限，還應在未來增加上述指標進行研究，全面分析與胃癌患者淋巴結轉移相關的多種指標，進一步提高對胃癌患者淋巴結轉移的預測與診斷特異度及靈敏度，對指導治療具有積極意義。

綜上所述，胃癌患者組織中EMT相關蛋白、TGF-β1 mRNA相對表達水平與淋巴結轉移密切相關，癌組織中E-cadherin相對表達水平降低，Vimentin、β-catenin及TGF-β1 mRNA相對表達水平升高可增加淋巴結轉移風險，且上述指標均可用于預測患者淋巴結轉移，為淋巴結清掃術及術后強化放化療的實施提供參考。